4. Полисорбат 80 (polysorbate 80/tween 80) – золотой стандарт вспомогательного вещества для гриппозных инактивированных вакцин.

По данным института безопасности вакцин при Johns Hopkins Bloomberg School of Public Health, в качестве вспомогательных веществ в вакцинах на апрель 2018 г. полисорбат 80 вошел в состав 12 различных типов вакцин (см. таблицу № 3), включая и комбинированные: в вакцины против дифтерии, столбняка, коклюша, гриппа, вируса папилломы человека, гепатита В, японского энцефалита, полиомиелита, гемофильной инфекции типа b, пневмококковой инфекции, ротавирусной инфекции, ветряной оспы и опоясывающего лишая, менингококковой инфекции серогруппы В. Максимальное содержание ПС80 составило 2,35 мг/мл, или 0,235 % (46). Кроме того, ПС80 входит в состав туберкулезной вакцины TheraCysÆ-BCG Live (Intravesical) фирмы Aventis Pasteur Limited. Из 443 позиций по вспомогательным веществам 16 (3,6 %) приходится на ПС80, т. е., доля его использования среди всех вакцин незначительна.

Вероятной причиной использования ПС80 в вакцинах является его различные механизмы действия. Помимо стабилизирующих свойств, приведенных в одном из предыдущих разделов «Общая информационная часть по полисорбату 80 (polysorbate 80/tween 80) для инъекций», имеются и другие. Так, в двух исследованиях выявлен механизм ингибиторного влияния ПС80 на абсорбцию лекарств при внутримышечном введении. Эффект обусловлен, в основном, его влиянием на внеклеточное пространство и проницаемость соединительной ткани (47). В другом исследовании введение мышам интраперитонеально 0,3 мл 25 % ПС 80 дo иммунизации с овальбумином, адсорбированном на гидроокиси алюминия, продемонстрировало отсутствие первичного IgE-ответа (48). ПС80 ингибирует различные механизмы транспорта лекарств (49, 50). Полисорбаты широко используются в фармацевтических препаратах по различным причинам, в том числе включая модификацию активных ингредиентов, их абсорбцию (51).

Важным является использование детергентов на критической стадии производства субъединичных, сплит или расщепленных гриппозных инактивированных вакцин. В настоящее время ПС 80 не используется в качестве единственного расщепляющего агента (52) на стадии солюбилизации вируса гриппа из-за низкого выхода гемагглютинина (ГА), в связи с его стабилизирующими свойствами. Потери гемагглютинина могут составить до 95% на стадии расщепления ионным детергентом, до 75% на стадии удаления детергента, и большая часть ГА может не детектироваться методом ОРИД из-за повреждения антигенности (53). Авторы изобретения за счет оптимизации условий расщепления - совместного использования катионного и неионного детергента, увеличения ионной силы до 100 мМ и более, замены трис-буфера на фосфатный, увеличили выход ГА более, чем в 20-50 раз для некоторых штаммов вируса гриппа. Авторы другого патента (54) для увеличения выхода ГА при получении субъединичной вакцины также использовали совместное действие двух детергентов: катионного (четвертичные аммониевые соединения) и неионного. Несколько детергентов добавляют в виде премикса (в смеси) или добавляют по отдельности, но одновременно или непосредственно один за другим. При совместном использовании потенциально денатурирующих катионных и анионных детергентов с неионными денатурация выделяемых компонентов может уменьшаться (55) из-за внесения экзогенных жирных кислот (липидов) с ПС80. Хотя тритон Х100 лучше стабилизирует антигены вируса гриппа, но ПС80 более безопасен (смесь натуральных жирных кислот с сорбитолом) и разрешен для использования и в лекарственных невакцинных препаратах. Вероятно, поэтому ПС80, в отличие от тритона Х100, получил чуть большее распространение в конечной лекарственной форме гриппозных инактивированных вакцин (таблица № 4). Пожалуй, единственным производителем, который в конечной лекарственной форме двух гриппозных инактивированных вакцин - ФЛЮАРИКС/Influsplit и Pandemrix - совместил использование двух стабилизаторов - неионных детергентов: ПС80 и тритона Х100, - является фирма GSK (GlaxoSmithKline Biologicals). Этот выбор, вероятно, был обусловлен, по их мнению, усилением стабилизирующих свойств комбинацией двух детергентов - ПС80 и тритона Х100 в конечной лекарственной форме гриппозной вакцины (52). Однако в литературе данных подтверждающих эту гипотезу не обнаружено.

Таблица № 3 – Содержание полисорбата 80 (твина 80) в различных вакцинах

	Наименование вакцины	Тип вакцины	Количество полисорбата 80 (твина 80) в дозе (0,5 мл)
1	Boostrix	Tdap	≤100 мкг
2	Fluad	Influenza	1,175 мг
3	Fluarix Quad	Influenza	≤0,550 мг
4	Flucelvax Quad	Influenza	≤1500 мкг
5	Flulaval Quad	Influenza	≤887 мкг
6	Gardasil	HPV	50 мкг
7	Gardasil 9	HPV	50 мкг
8	Heplisav-B	HepB	0,1 мг/мл
9	Infanrix	DTaP	≤100 мкг
10	JE-Vax	Japanese Encephalitis	<0,0007%
11	Kinrix	DTaP+IPV	≤100 мкг
12	Pediarix	DTaP+HepB+IPV	≤100 мкг
13	Pentacel	DTaP+IPV+Hib	10 ppm
14	Prevenar 13	Pneumococcal 13-valent	100 мкг
15	Quadracel	DTaP+IPV	10 ppm
16	RotaTeq	Rotavirus	Количество в инструкции не указано
17	Shingrix	Zoster	0,08 мг
18	Trumenba	Meningococcal Group B	0,018 мг

В современном производстве гриппозных инактивированных вакцин ПС80 используется не только для обеспечения стабильности во время хранения в конечной лекарственной форме (56), но и на многих стадиях производства: расщепления (контролируемая мягкая солюбилизация) (52), ультрацентрифугирования, ультрафильтрации (57), инактивации живого вируса гриппа (52,58), разведения (59), стерилизующей фильтрации. Кроме того, ПС80 в составе гриппозных вакцин обеспечивает адъювантные свойства, вероятно, из-за способности к мицеллообразованию. Вероятно, поэтому ПС80 стал использоваться в составе не только гриппозных (см. таблица № 4), но и других вакцин (таблица № 3).

Если доля использования ПС80 среди всех вакцин мала, то в гриппозных инактивированных он занимает особое место. В прошлом в США нецельновирионные гриппозные вакцины получали с использованием органических растворителей, типа эфира, три-н-бутилфосфата и детергента тритона Х100. В настоящее время для производства гриппозных инактивированных вакцин в международной практике, как правило, используются дезоксихолат/тауродезоксихолат натрия (анионный детергент), цетилтриметиламмоний бромид (катионный), полисорбат 80 (неионный) и тритон Х100 (неионный).

Из 20 вышеприведенных вакцин в 12 используются производные желчных кислот - наиболее безопасные и мягкие среди анионных детергентов, наиболее близкие организму человека – дезоксихолат и тауродезоксихолат натрия. Другой широко используемый детергент, близкий по своей структуре к фосфатидилхолинам, – ПС80/твин 80, обеспечивающий стабильность во время очистки и хранения всех типов гриппозных инактивированных вакцин от субъединичных и сплит до цельновирионных. ПС 80 используется в 9 вакцинах из 20 для обеспечения стабильности во время хранения и в процессе очистки. К сожалению, ПС 80 до сих пор не используется для обеспечения стабильности гриппозных вакцин производства АО «НПО «Микроген», за исключением разрабатываемой с 2010 г. вакцины «Микросплит».

Таблица № 4 – Детергенты, используемые в мировой практике для производства гриппозных инактивированных не тетравалентных вакцин

№	Название торговое	Фирма	Субстрат репродукции вируса	Тип вакцины	Расщепляющий, стабилизирующий, виросом-мицеллообразующий агент-детергент на дозу (0,5 мл)	Примечание *
1	ФЛЮАРИКС/ Influsplit (Fluarix)	GSK-Биомед (GlaxoSmithKline Biologicals), Германия/Бельгия, Россия	куриные эмбрионы	Сплит, трехвалентная	Дезоксихолат ≤50 мкг/0,5 мл, Твин 80 ≤0,415 мг(≤0,38мг), Тритон Х100 ≤0,085 мг (≤0,12мг), α-токофероловый водородный сукцинат ≤0,1 мг	cамый низкий уровень эндотоксина, один самых низких овальбумина, один из самых высоких NP/NA-27 мкг и М - 6 мкг)
2	FLULAVAL	ID Biomedical Corporation of Quebec	куриные эмбрионы	Сплит, трехвалентная	Дезоксихолат 50 мкг/0,5 мл
3	Fluviral S/F	ID Biomedical (ранее Shire Bilogics	куриные эмбрионы	Сплит, трехвалентная	Дезоксихолат, Тритон Х100
4	Pandemrix	GlaxoSmithKline	куриные эмбрионы	Сплит, Моновалентная (H1N1). 15 мкг	Дезоксихолат, Тритон Х100. Адъювант AS03 (DL-α-токоферол - 11,86 мг, сквален - 10,69 мг), Полисорбат 80 - 4,86 мг
5	Influenza A 2009 vaccine	GlaxoSmithKline	куриные эмбрионы	Сплит, Моновалентная (H1N1). 15 мкг	Дезоксихолат, безадъювантная
6	Ваксигрипп Vaxigripp	Sanofi Pasteur Inc., Франция	куриные эмбрионы	Сплит, трехвалентная	Тритон Х100, Дезоксихолат
7	FLUZONE (Flushield)	Sanofi Pasteur Inc., GlaxoSmithKline	куриные эмбрионы	Сплит, Трехвалентная, 15 мкг	Triton® X-100 <0,02%, Дезоксихолат 50 мкг. Безадъювантная
8	Influenza A 2009 vaccine	Sanofi Pasteur Inc	куриные эмбрионы	Сплит, Моновалентная (H1N1), 15 мкг НА	Тритон Х100 <0,02%, Безадъювантная
9	Panenza	Sanofi Pasteur Inc	куриные эмбрионы	Сплит, Моновалентная (H1N1), 15 мкг НА	Octoxynol-9, Безадъювантная
10	Arepanrix	GlaxoSmithKline Inc, Канада	куриные эмбрионы	Сплит, Моновалентная (H1N1), 3,75 мкг НА	Дезоксихолат, адъювант AS03 (DL-α-токоферол - 11,86 мг, сквален) - 10,69 мг, Полисорбат 80 - 4,86 мг
11	Influenza A 2009 vaccine	CSL	куриные эмбрионы	Сплит, H1N1, 15 мкг НА	Тауродезоксихолат, безадъювантная
12	PANVAX	CSL	куриные эмбрионы	Сплит, H1N1, 15 мкг НА	Тауродезоксихолат 5 мкг
13	Afluria	CSL (Seqirus)	куриные эмбрионы	Сплит, H1N1, 15 мкг НА	Тауродезоксихолат < 10 ppm
14	ИНФЛЮВАК (Influvac)	Солвей Фармасьютикалз, Нидерланды	куриные эмбрионы	Субъединичные, трехвалентная	СТАВ (цетилметиламмониум бромид), Дезоксихолат натрия, Полисорбат 80, безадъювантная	Наивысшая активность нейраминидазы (нативность метода выделения), низкое содержание эндотоксинов
15	Celtura	Novartis	MDCK	Cубъединичная, H1N1, 3,75 мкг	СТАВ, MF59C1 (сквален 4,875 мг, твин 80 - 0,588 мг, сорбитантриолеат 0,588 мг)
16	Focetria	Novartis	Куриные эмбрионы	Cубъединичная, H1N1, 7,5 мкг	СТАВ, MF59C1 (сквален 9,75 мг, твин 80 1,175 мг, сорбитантриолеат 1,175 мг)
17	Influenza A 2009 vaccine	Novartis	Куриные эмбрионы	Cубъединичная, H1N1, 15 мкг	Ноноксинол-9 <0,015 %, безадъювантная
18	Agrippal	Novartis	Куриные эмбрионы	Cубъединичная, трехвалентная, 15 мкг	CTAB, Полисорбат 80. Безадъювантная	cамый низкий уровень эндотоксинов
19	Fluvirin	Novartis (Seqirus)	Куриные эмбрионы	Cубъединичная, трехвалентная, 15 мкг	Ноноксинол-9 <0,015 %, безадъювантная	Неактивная нейраминидаза – денатурирующая технология
20	Celvapan	Baxter AG	Vero	Цельновирионная, H1N1, 7,5 мкг НА	Твин 80 0,1-0,15%, безадъювантная

*Примечание, согласно S. Wong, K. Yuen Influenza vaccination: options and issues. Hong Kong Med J 2005; N 5, 11:381-90. Присутствие активной нейраминидазы может рассматриваться как свидетельство аккуратного приготовления вакцин, сохранения нативности антигенов в процессе выделения, а, значит, соответствия иммунного ответа (на вакцину) исходному циркулирующему возбудителю.

Как уже отмечалось выше, в прошлом в США нецельновирионные инактивированные гриппозные вакцины получали с использованием органических растворителей типа эфира, три-н-бутилфосфата и детергента тритона Х100. Отказ от использования эфира произошел из-за взрывоопасности, от трибутилфосфата из-за токсичности и неэкологичности, что позволило еще в 60-е годы перейти на использование более безопасного 1% дезоксихолата (расщепление 37 ^оС, 30 мин) в Австралии (60). Дезоксихолат - мягкий детергент (подобно неионным): дает по некоторым данным выход по выделяемому соединению до 85-90 % (61, 62). Однако, такой высокий выход при использовании этого мягкого анионного детергента для всех штаммов вируса гриппа может быть поставлен под сомнение. Выбор подходящего детергента нелегок. Ионные детергенты более эффективны, чем неионные, по выходу и профилю белков, но являются более жесткими. Мягкие неионные детергенты обеспечивают более контролируюмую солюбилизацию, сохраняя максимально нативность. Однако, неионные детергенты, как правило, трудно удаляются, мешают определению содержания белка, не дают максимального выхода по выделяемому белку (63). В исследованиях Gross P.A., Ennis F.A., Gaerlan P.F. с соавт.(64) была показана одинаковая иммуногенная эффективность двух сплит-вакцин: одна получена двумя реагентами - эфиром и твином, другая - всего одним детергентом - тритоном Х100. В итоге, в производстве гриппозных вакцин произошел переход от использования потенциально опасных органических растворителей (эфир, трибутилфосфат) к мягким детергентам.

Производные желчных кислот могут быть использованы производителями гриппозных вакцин без нарушения авторских прав патентообладателей, так как, по данным ВОЗ, уже с 1969 г. дезоксихолат натрия используется в качестве расщепляющего агента для производства коммерческих гриппозных вакцин (60).

Использование дезоксихолата в производстве гриппозных инактивированных вакцин снизило:

1) реактогенность (65, 66),

2) пирогенность (67, 68, 69), и при этом сохранило в вакцине нативность и ферментативную активность нейраминидазы (70).

Однако, в 2000-2001 гг. у одного из производителей в вакцине были обнаружены микроагрегаты нерасщепленных вирионов гриппа, вызвавших существенное увеличение побочных реакций – окуло-респираторный синдром (71, 72, 73, 74). Снижение побочных реакций было достигнуто введением специального контроля за полнотой расщепления цельного вируса и комбинированным использованием нескольких детергентов, а также подбором необходимой солюбилизирующей концентрации детергента для каждого штамма вируса. Поэтому до сих пор при получении гриппозных инактивированных вакцин стоит задача использования более эффективного детергента, чем дезоксихолат натрия, не оставляющего в препарате опасного уровня нерасщепленного вируса, и, в то же время, сохраняющего, насколько возможно, нативность антигенов.

До настоящего времени за рубежом используется катионный детергент - цетилтриметиламмоний бромид (СТАВ), который уже в течение многих десятилетий доказал свою безопасность. Использование очень мягких и дорогих неионных детергентов типа октилгликозида (в 10 раз дороже) при стандартном использовании в концентрациях 1 % и более снижает выход и увеличивает стоимость производства. Пожалуй, октилглюкозид и холаты объединяет то, что они могут быть легко элиминированы диализом, что является технологичным моментом их удаления при ультрафильтрации. Mukhlis F.A. с соавторами (75) показали, что из трех гриппозных сплит-вакцин, полученных с использованием СТАВ, тритона Х100, empigen, первые два показали равную эффективность, но намного более сильную иммуногенность, чем с empigen.

Среди других неионных детергентов, широко используемых для производства гриппозных инактивированных вакцин, заметное место занимает тритон Х100, который обнаружился в составе 6 из 20 вакцин (см. таблицу № 4). Однако, его использование имеет некоторые потенциальные риски. Тритон X100 широко используется для солюбилизации мембран вирусов при 20 °С, для выделения поверхностных гликопротеинов оболочечных вирусов, включая вирус гриппа. Однако, большинство исследователей для сохранения нативности выделяемых соединений используют низкотемпературную солюбилизацию, а не комнатную. Неэффективны или резистентны к низкотемпературной солюбилизации множество неионных детерегентов, включая тритон Х100, NP40, Lubrol, brij 96, brij 98 и твин 20. При использовании тритона Х100 концентрация детергентрезистентного к экстракции гемагглютинина может достигать больших значений: 26 % (76), что затрудняет возможность отдельного применения тритона Х100 для обеспечения максимального выхода гемагглютинина. Значит некоторые неионные детергенты при неденатурационной температуре не работают эффективно. К тому же, солюбилизация гликопротеинов из вирионов вируса гриппа тритоном Х100 низкоселективна, и препараты субъединичных вакцин должны дополнительно очищаться от M1 и RNP белков. Следовательно, промышленная технология с использованием тритона Х100 не в полной мере подходит для получения субъединичных вакцин, так как требует дополнительных стадий очистки от внутренних белков, повышающих затраты на производство. Поэтому тритон Х100 используется за рубежом исключительно для получения гриппозных сплитвакцин, в состав которых входят внутренние белки вируса гриппа и допускается большее содержание общего белка. В патенте WO2015073633A1 (77) описываются некоторые риски использования тритона X100. Продукты деградации тритона X100 демонстрируют эстрогенные эффекты. Разрешенные нормы для продуктов деградации тритона Х100 – octylphenol, в стоках являются чрезвычайно низкими - от 0,01 дo 0,1 ppb (10^‑9). Поэтому использование тритона Х100 может потребовать комплекса дорогостоящих мероприятий для удаления octylphenol из сточных вод. При оценке цитотоксичности по отношению к эпителиальным клеткам роговицы тритон Х100 был отнесен к тому же сильному раздражающему классу, что и анионные детергенты типа додецилсульфата натрия (78). Вероятно, многие вышеперечисленные риски обусловлены тем, что стабилизатор тритон Х100, в отличие от полисорбата 80, является более синтетической молекулой. К сожалению, на просторах интернета пока не нашлось ни одной фирмы, выпускающей тритон Х100 в качестве вспомогательного (excipient) или активного вещества (DMD). Имеется более или менее приемлемый вариант тритона Х100 фирмы Merck кат. № 108643 - Triton® X-100 suitable for the biopharmaceutical production. Получается, согласно указанной квалификации «для биофармацевтического производства», тритон Х100 можно использовать на производстве, конкретно - на промежуточных стадиях технологического процесса, а на конечной – нет. Фактически допускается его остаточное содержание в конечном препарате. В отличие от тритона Х100, ПС80 можно использовать на любых стадиях производства, в том числе, специально, при формулировании препаратов, так как его квалификация более высокого порядка: excipient или DMF. Каждый производитель препарата делает свой выбор вспомогательного вещества, в зависимости от общей стратегии. При стратегии «не навреди» приоритет отдается безопасности. Пожалуй, единственный вариант при выборе наиболее эффективного стабилизатора с недостаточными пока данными по безопасности - это выбор по жизненным показаниям (это вынужденная необходимость при условии согласования с контролирующими органами). Например, при угрозе пандемии гриппа при нестабильности конкретного штамма вируса гриппа с существующими excipient, доказавшими свою эффективность и безопасность среди лекарственных и иммунобиологических препаратов на протяжении десятков лет, но к сожалению оказавшимися неэффективными по отношению к новому штамму.

С учетом данных паспортов безопасности (MSDS) для Тритона Х100 (polyethylene glycol p-isooctylphenyl ether) при оральном введении крысам: LD50=1800 мг/кг=1,8 г/кг, для ПC80 - LD50=34500 мкл/кг, или 34,5 мл/кг, или около 34,5 г/кг. Следовательно, прикидочно безопасность ПС80 выше, чем у тритона Х100, примерно в 19,2 раза. Поэтому, как видно из таблицы № 4, содержание в гриппозных инактивированных не тетравалентных вакцинах тритона Х100 составляет менее 0,017%, а полисорбата 80 – не более 0,15%. Следовательно, содержание полисорбата 80 в гриппозных инактивированных трехвалентных вакцинах выше тритона Х100 примерно на порядок. Такой результат, вероятно, можно объяснить натуральностью жирных кислот и сорбитола, входящих в состав полисорбата 80. При сравнении детергентов в составе тетравалентных гриппозных инактивированных вакцинах (см. таблицу № 5), допустимое содержание тритона Х100 - не более 500 мкг/мл, или 0,05%, а полисорбата 80 - не более 3000 мкг/мл, или около 0,3%, т.е., примерно в 6 раз больше. Следовательно, и в современных тетравакцинах сохраняется «правило» многократного превышения допустимого содержания полисорбата 80 над тритоном Х100.

Интересно, что при переходе от классических трехвалентных вакцин к перспективным четырехвалентным на примере двух вакцин - Fluarix и FLULAVAL - фирмы GlaxoSmithKline и одной вакцины Flucelvax фирмы Seqirus Pty Ltd, происходит соразмерное увеличение гемагглютинина в 1,33 раза и точно такое же увеличение содержания ПС80 в 1,33 раза. Особенно показано использование ПС80 для сплитвакцин: они, как правило, безадъювантные и содержат плохорастворимые в воде М- и NP-белки вируса гриппа.

Таблица № 5 – Состав тетравалентных зарубежных гриппозных инактивированных вакцин

Фирма (произ-водитель)	Наименование тетравалентной вакцины	Состав стабилизаторов и веществ тетравалентной вакцины	Состав стабилизаторов и веществ в 3 трехвалентной вакцине	Кратность увеличения компонентов в тетравалентной вакцине
1	2	3	4	5
Seqirus Pty Ltd	Flucelvax Quadrivalent	твин 80 ≤ 3000 мкг/мл, СТАБ ≤ 36 мкг/мл, β-пропиолактон <1,0 мкг/мл	твин ≤ 2250 мкг/мл, СТАБ ≤ 27.0 мкг/мл), β- пропиолактон <1,0 мкг/мл	1,33 1,33 1
GlaxoSmithKline	Fluarix Tetra/ QUADRIVALENT (Influsplit Tetra)	Тритон Х100 не > 230 мкг/мл; твин 80 не > 1100 мкг/мл; дезоксихолат натрия не > 130 мкг/мл; формальдегид не > 10 мкг/мл; α-токоферол сукцинат водорода не > 270	Тритон Х100 не > 170 мкг/мл; твин 80 не > 830 мкг/мл; дезоксихолат натрия не > 100 мкг/мл; формальдегид не > 10 мкг/мл; α-токоферол сукцинат водорода не > 200	1,35; 1,33; 1,3 1 1,35
GlaxoSmithKline	FLULAVAL QUADRIVALENT	дезоксихолат натрия не > 100 мкг/мл; твин 80 не > 1774 мкг/мл; α-токоферол сукцинат водорода не > 640 мкг/мл; формальдегид не > 50 мкг/мл	дезоксихолат натрия не > 100 мкг/мл; твин 80 не > 1330 мкг/мл; α-токоферол сукцинат водорода не > 480 мкг/мл; формальдегид не > 50 мкг/мл	1; 1,33; 1,33; 1
Sanofi-Pasteur	Fluzone Quadrivalent	Тритон Х100 не > 500 мкг/мл; Формальдегид не > 200 мкг/мл; Желатин отсутствует; сахароза отсутствует	Тритон Х100 не > 300 мкг/мл (не >0,02%); Формальдегид не > 200 мкг/мл; Желатин 0,05%; сахароза не > 2%	1,67 1

Таким образом, полисорбат 80 получил специфическое распространение в промышленной технологии гриппозных инактивированных вакцин практически на всех критических стадиях производства: расщепления, ультрацентрифугирования, ультрафильтрации, инактивации живого вируса гриппа, разведения, стерилизующей фильтрации, и конечно, в конечной лекарственной форме.