приборы
.doc1. На протяжении многих десятилетий клиническая лабораторная диагностика развивалась по двум основным направлениям:
1) разработка новых и более информативных (по сравнению с ранее известными) лабораторных критериев и тестов,
2) автоматизация технологической процедуры анализа при проведении клинико-биохимических, гематологических, общеклинических, иммунологических, молекулярно-биологических и гормональных исследований.
Практикуемый в большинстве ординарных клинико-диагностических лабораторий р у ч н о й (мануальный) метод анализа базируется на непосредственном участии лаборанта в осуществлении всех основных этапов клинико-лабораторного исследования, а именно: во взятии биологического материала, реагентов, их смешивании, инкубации, регистрации аналитического сигнала (на фотометре или другом приборе), в расчете концентрации определяемого вещества. Поэтому неудивительно, что даже незначительные отклонения в условиях выполнения анализа (неизбежно возникающие при постановке большого количества проб) способны существенно повлиять на конечный результат лабораторного исследования.
Стандартизация режимов определения, достигаемая автоматизацией всей процедуры анализа, естественно, повышает и надежность его выполнения, притом за более короткий период времени и с использованием значительно меньшего (чем при мануальном исследовании) объема реагентов и биологического материала.
Автоматизация биохимических исследований в мировой лабораторной практике началась с середины 50-ых годов, ознаменовавшихся созданием фотометров и спектрофотометров с контролируемой температурой кюветы: это позволило выполнять наряду с конечноточечными кинетические исследования. Дальнейшее совершенствование фотометров было направлено на автоматизированный перевод значений абсорбции в показатели концеентрпации или активности (ферментов).
Применение в клинико-лабораторной практике автоматизированных фотометров сделало возможным осуществлять измерения не только в режиме конечной точки, когда реакция уже завершилась, но также в режимах:
- фиксированного времени (измерение результата через определенный интервал времени после начала реакции),
- кинетики (ряд измерений с определенным интервалом времени и расчетом активности фермента по средней величине изменения абсорбции за этот интервал времени),
- дифференциальном (расчет концентрации по разности абсорбции образца и бланка),
- бихроматическом (при котором расчет концентрации выполняется по разности абсорбции, измеренной на двух длинах волн).
Последующая автоматизация фотометров была связана с использованием в них проточной кюветы, что исключило ошибки, обусловленные установкой кюветы в измерительный модуль и ее термостатированием. Кроме того, применение проточной кюветы позволяет экономнее расходовать реактивы, поскольку при толщине поглощающего слоя 1 см объём кюветы составляет до 100 мкл. С учетом объемов подводящих трубок и необходимости несколько раз сменять реакционную смесь в кювете до начала измерения, необходимый для проведения лабораторного анализа объем не превышает 0,5 - 1 мл.
Наряду с одно- и двухканальными появились и многоканальные фотометры, позволяющие измерять одновременно большое количество проб, что существенно ускоряет процесс измерения. К наиболее распространенным в республике фотометрам относятся:
- Одноканальные спектрофотометры фирмы "СОЛАР" PV-1251 C (отечественного производства). Комплектуется современным компьютером Позволяет использовать практически все современные наборы реагентов и методы исследования (в том числе кинетический, бихроматический, конечноточечного исследования.
- Одноканальный фотометр фирмы "Bayer" RA-50. Может снабжаться проточной кюветой. Позволяет проводить все необходимые клинико-лабораторные исследования.
- Многоканальные фотометры фирмы "Лабсистемс" FP-900 (901, 901 M). Многие модификации прибора снабжены компьютером. Все версии имеют не связанный с фотометром термостат-встиряхиватель, кюветы оригинальной конструкции, по 9 штук в обойме. В связи с тем, что фотометрическое измерение вертикальное, очень важнособлюдать одинаковый объём реакционной смеси всех кюветах.
Главной отличительной особенностью автоматических фотометров (спектрофотометров) от автоанализаторов является необходимость вручную смешивать анализируемый образец с реактивами. Если укомплектовать автоматический фотометр устройством, автоматически смешивающим определенный объём пробы с требуемым объёмом реактива, то полученный комплекс может рассматриваться как автоанализатор.
Если пробоотборник в автоматизированном устройстве отсутствует, прибор рассматривается не как полный биохимический автоанализатор, а как полуавтоанализатор, процесс эксплуатации которого требует постоянного участия оператора: при этом лаборант практически не может отойти от прибора.
Практически все автоматические фотометры снабжены программой внутреннего контроля качества (автоматически сообщают о возникших неисправностях) и имеют выход на компьютер. Число каналов программирования практически у всех автоматических фотометров позволяет без перепрограммирования выполнять все биохимические исследования.
Техника а в т о м а т и ч е с к о г о лабораторного анализа к настоящему времени достигла высокой степени совершенства. Разработано несколько десятков вариантов конструкции автоанализаторов для осуществления биохимических, гематологических и иммунохимических исследований.
Классификация автоанализаторов
Известные в мире биохимические автоанализаторы могут быть подразделены (несколько условно) на три основных типа.
1. Одноцелевые биохимические автоанализаторы, с помощью которых в анализируемой пробе определяется лишь один компонент биологической жидкости и ткани. К числу таковых может быть отнесен, например, анализатор "Глюкоза-2" фирмы "Beckman".
2. Автоанализаторы для определения так называемых родственных компонентов. Это, например, автоанализатор аминокислот, принцип действия которого основан на хроматографическом их разделении (по Штейну и Муру); автоматический атомно-абсорбционный пламенный спектрофотометр.
3. Многоцелевые биохимические автоматические устройства, предназ начающиеся для установления содержания в биологических жидкостях большого количества различных по химической природе компонентов.
Технико-аналитические возможности биохимических автоанализаторов во многом зависят от заложенного в них принципа действия: "поточного" или "дискретного".
Впервые поточный принцип действия автоанализатора был предложен Skeggs в 1954 году. Вскоре после этого (1957) он был положен в основу созданного фирмой "Technicon Instrument Corp." (1957) одноканального биохимического автоанализатора.
Согласно п о т о ч н о м у принципу функционирования автоанализаторов, все химические реакции в процессе осуществления анализа проводятся в потоке транпортируемых по трубкам и разделенных воздушными прослойками проб. Воспроизводимость результатов обеспечивается тем, что на каждый этап исследования всегда отводится один и тот же, притом строго определенный, промежуток времени. Результат анализа рассчитывется путем сопоставления показателей исследования опытной, контрольной и стандартной проб.
Отдельными функциональными блоками (так называемыми "специализированными модулями") автоанализатора выполняются: подача биологического материала к пробоотборнику, дозирование, транспортировка анализируемых проб, реагентов и воздуха, перемешивание растворов, диализ, термостатирование, измерение, графическая запись и/или цифропечать результатов исследования. Для выполнения этих технических процедур используются входящие в состав автоанализатора специальные устройства: пробоотбрник с коллектором проб, дозирующий перистальтический насос (шланговый дозатор), диализатор, термостат, измерительный блок (фотометр, флюориметр и др.), самописец или система цифропечати. Выбор отдельных блоков и их функциональное объединение производятся в зависимости от особенностей методологии проводимого исследования.
В автоанализаторах Скеггса (производимых фирмой "Техникон", США), поток жидкости, проходящий через трубчатый реактор, фрагментируется пузырьками воздуха, что обеспечивает эффективное перемешивание растворов и в то же время снижает гидродинамическе размывание и взаимозагрязнение соседних проб. Однако перед поступлением жидкости в детектор она должна быть дегазирована (отделена от воздуха) с помощью специальных устройств.
Автоанализаторы, использующие д и с к р е т н ы й принцип работы, применяются в клинико-лабораторной практике с начала 60-х годов. Согласно этой, наиболее часто применяесмой в клинико-лабораторной практике технологии, из специального пробоотборника в реакционную емкость приготовителя вносятся: анализируемая проба, разбавитель (при необходимости) и соответствующие реагенты. Смесь термостатируется, после чего измеряется ее оптическая плотность (в видимой, ультрафиолетовой области). Возможно использование и других способов детектирования.
Основными узлами дискретных автоанализаторов являются:
1).Карусели (картриджи) с исследуемым биологическим материалом и реагентами.
2).Дозаторы (манипуляторы).
3).Блок измерения концентрации определяемого компонента.
4).Регистрирующее устройство.
5).Система управления комплексом перечисленных модулей.
В дискретных автоанализаторах вместо центрифугирования и диализа (процедуры предварительного отделения белков в «мануальном» - ручном анализе) используется большое разбавление проб, при котором помехи от присутствия белков в большинстве реакций становятся ничтожно малыми. Автоматизированные устройства дискретного типа в настоящее время используется производятся большинством фирм индустриально развитых стран мира.
Своеобразным «компромиссом», объединяющим проточный и дискретный принципы автоматизированного исследования, является р о т а ц и о нн а я с и с т е м а, особенность которой состоит в использовании процесса центрифугирования. При этом смешивание пробы с реактивами, термостатирование и измерение величины оптической плотности осуществляются в период вращения ротора центрифуги: в процессе центрифугирования жидкость перемещается по радиальным каналам ротора в соответствующие кюветы, вращающиеся совместно с ним.
Поскольку подавляющее большинство применяемых в лаборатории автоанализаторов используют дискретный принцип исследования, он заслуживает более пристального рассмотрения.
Классификация автоанализаторов в зависимости от особенностей технологии выполнения клинико-лабораторных исследований
В зависимости от конструктивных особенностей приборов и предоставляемых ими возможностей выполнения аналитических процедур все
автоматизированные устройства могут быть подразделены на несколько основных классов.
1-ый класс. Автоанализаторы, реализующие принцип "BATCH-системы", т.е. выполнения исследований "по тестам". Характерной их конструктивной особенностью является использование проточных кювет. Анализаторы этого типа предназначены для последовательного выполнения отдельных методик (серий исследований). Представляют собой открытые системы.
2-ой класс. Анализаторы селективные, обеспечивающие режим выполнения работы "по пациентам" - RANDOM. Позволяют выполнять исследование по различным биохимическим тестам путем взятия (с использованием манипулятора) отдельных аликвот одной и той же пробы биологического материала. Как правило, регистрация оптической плотности производится не в проточной, а отдельной реакционной кювете. Приборы этого типа допускают возможность проводить экспресс-анализы (в STAT-режиме: "внеочередного проведения анализа").
3-ий класс. Многофункциональные интеллектуальные системы. Предназначаются для использования в лабораториях крупных лечебно-профилактических учреждений, диагностических центрах, централизованных клинико-биохимических лабораториях. Содержат иооноселективные блоки.
Всем биохимическим автоанализаторам свойственны:
1) программное обеспечение, достигаемое использованием современ-
ной компьютерной техники (не микропроцессоров),
2) осуществление контрольных функций, обеспечиваемое автоматизи-
рованным слежением компьютерного устройства за работой отдельных бло-
ков прибора и выполнением программы контроля качества проводимых лабо-
раторных исследований,
3) автоматические пробоподготовка и дозирование.
Стремление специалистов клинической лабораторной диагностики к использованию в своей работе полностью автоматизированных устройств базируется на достижении многих, связанных с применением таких приборов п р е и м у щ е с т в. Основные из них следующие:
1. Экономичность, достигаемая экономным расходованием реагентов. Если при работе на ФЭКе обычно требуется 3-4 мл реактива, то при выполнении исследований на автоанализаторе всего лишь 350 - 500 мкл (и менее). Отсюда возможная 10-кратная экономия реагентов (!). Благодаря такому, экономному использованию реактивы расходуются в течение значительно более длительного времени, реже закупаются.
2. Использование весьма небольшого объема анализируемой биологической жидкости (3 - 7 мкл)
3. Высокая производительность (до 800 и более исследований в час).
4. Достаточно большая загруженность. Автоанализатор должен эксплуатироваться не менее 5-6 часов в сутки.
5. Гибкость в работе. Обеспечивается возможностью использования разных режимов определения: по конечной точке, двух- многоточечной кинетике, с привлечением технологии турбидиметрии (иммунонефелометрии), ионометрии, поляризационной флюориметрии и других.
В последнее время находит использование принцип турбидиметрии фиксированной абсорбцией. Особенностью этого технологического процесса является измерение времени прироста оптической плотности до заданного ее значения. Реализуется в коагулологии.
6. Допускаемая конструкцией многих приборов возможность программирования автоанализатора под реактивы разных фирм-производителей.
7. Использование небольших (в том числе и моющихся) измерительных кювет.
8. Системный подход, который расценивается как возможность "просмотреть" сам ход реакции, что позволяет, в частности, выявить фазу исчерпания субстрата, кофакторов (в обычных условиях, при "ручном" определении это обнаружить невозможно).
9. Осуществление контроля качества. В современных автоанализаторах заложено несколько используемых для этого программ.
10. Программное сохранение базы данных.
11. Возможность выполнения экстренных исследований, постановки так называемых "цитовых" проб.
12. Связь с компьютерами: многие автоанализаторы имеют выход на центральный, "хохстовый" компьютер.
13. Широкие возможности измерительного модуля. В отличие от обычных фотоэлектроколориметров, позволяющих производить замер оптической плотности растворов в пределах до 0,2 - 0,7 ед., современные биохимические автоанализаторы позволяют регистрировать абсорбцию (при условии соблюдения закона Бугера-Ламберта-Беера) в диапазоне до 2,5 ед. А: это достигается использованием мощного источника облучения и более чувствительных приемников света.
Многие из современных биохимических автоанализаторов оснащены также ионоселективным блоком, позволяющим, в частности, проводить определения ионов калия, нгатрия, кальция, хлора потенциометрическим методом.
14. Использование неагрессивных жидкостей. Ферментные наборы реагентов не содержат агрессивных жидкостей, практически не обладают токсическим эффектом.
15. Надежность устройства, связанная с применением в нем новейших технологий.
Каждый из биохимических автоанализаторов характеризуется рядом технико-аналитических критериев. В их числе: -Спектр определяемых веществ: субстраты, ферменты, специфические белки, гормоны, электролиты, факторы свертывания крови, иммуноглобулины, чужеродные соединения (наркотики, лекарственные вещества и др.)
- Производительность: количество исследований в час.
- Последовательность выполнения анализов: "от методики к методике", т.е. "по тестам" - BATCH или "по пациентам" - RANDOM.
- Открытость системы.
Под нею понимается возможность использовать наряду с реактивами, рекомендуемыми фирмой-производителем автоанализатора, ряд других, что предполагает введение в компьютер всех необходимых параметров биохимической реакции и осуществление самостоятельного программирования. Тем самым открытая система позволяет адаптировать к автоанализатору реагенты других фирм (что имеет большое значение, так как стоимость одного биохимического исследования на 50% определяется использованными реагентами, на 30% - стоимостью анализатора и на 20% - всеми остальными затратами).
-Возможность выполнять биохимические исследования с использованием только одного реагента (монотесты), либо одного и большего их количества (требуемых для постановки конкретной методики). Хотя большинство биохимических реакций может протекать с одним реагентом, возможность применения двух реактивов расширяет возможности анализатора (позволяя, в частности, выполнять определение билирубина, MB-изофермента креатинкиназы).
- Объем биологической жидкости (мкл): обычно 3-7 мкл
- Объем проточной кюветы (напри мер, 32, 100 мкл)
- Объем реактива на одно исследование 250, 350, 500 мкл и др.
- Объем реакционной смеси (мкл)
- Необходимость в дополнительной очистке дистиллированной воды.
- Особенности оптической системы регистрации:
а) источник света (ксеноновая, галогеновая лампа с длительным сроком эксплуатации, лампа накаливания (вольфрамовая, вольфрамо-галогеновая, ксеноновая, кварцевая, пульсирующа).
б) диапазон длин волн,
в) монохроматизация светового потока: с помощью диффракционной решетки, набора простых или интерференционных светофильтров,
г) система детектирования светового сигнала,
д) режим фотометрического измерения: монохроматический, бихроматический.
- Используемый блок измерения (измерительный блок): проточная кювета, сменные реакционные кюветы - одноразового, многоразового применения; моющиеся кварцевые кюветы (очищающиеся механическим путем, высушиваемые потоком воздуха)
- Характер измерения оптической плотности раствора, оценки результата:
а) по конечной точке (возможность построения калибровочной кривой),
б) по кинетике,
в) по двум точкам,
г) по фиксированной абсорбции,
д)оценка результатов по нелинейной калибровке (иммунотурбидиметрия).
- Реакционные кюветы: их количество, объем, материал, из которого изготовлены реакционные ячейки.
- Реагентные каналы: их количество (имеется ли зависимость их количества от числа анализируемых проб).
- Дозатор (манипулятор) и особенности дозирования биологической жидкости и реагентов.
- Температурный режим: термостатированный измерительный блок, термокювета и пр.
- Устанавливаемая температура реакционной смеси: 37 С, 30 С, 25 С.
- Возможность охлаждать жидкие реагенты "на борту" автоанализатора.
- Возможность осуществлять разбавление сыворотки.
- Возможность выполнения срочных ("цитовых") исследований.
- Особенности компьютерного обеспечения:
а) встроенная программа контроля качества.
Данное программное обеспечение сокращает время, затрачиваемое сотрудниками каждой лаборатории на составление отчетной документации и контрольных карт.
б) возможность вносить в компьютерную память автоанализатора все необходимые параметры проведения биохимической реакции, а именно: сведения о длине волны, характере измерения, температурном режиме, значении эталона (или коэффициенте), контрольной пробы на реактивы, пробы, продолжительности измерения, времени задержки и инкубационного периода, объеме пробы и реагента и др.
в) количество каналов программирования.
г) возможность архивировать данные, касающиеся информации о больных: зависит от объема операционной памяти (например, на 40 методик).
д) объем памяти для программирования биохимических реакций.
е) связь с внешним компьютером
ж)возможность создания профилей (наборов тестов для диагностики заболеваний)
Печатающее устройство (принтер встроенный или внешний):
- Используемая бумага (обычная, термобумага).
- Необходимость использования кондиционера.
- Шумовые эффекты.
- Необходимость стабилизации напряжения.
- Габариты прибора.
- Масса прибора.
- Цена (USD).
В зависимости от потенциальных возможностей приборов биохимические автоанализаторы подразделяют на:
1. Малые аналитические системы (обладающие производительностью примерно 100-120 анализов/ч).
2. Средние по производительности автоанализаторы (180-250 анализов/ч).
3. Современные большие моногоканальные биохимические автоанализаторы, позволяющие выполнять 400-600-800 (и более) анализов/ч.
В зависимости от габаритов и массы приборов различают:
1. Настольные автоанализаторы (малогабаритные приборы, не требующие дополнительной водоподготовки).
2. Напольные автоанализаторы с системой водоочистки (иногда нуждающиеся в расположении в отдельной комнате, оснащенной кондиционером).
В зависимости от характера химической процедуры исследовании различают 4 основные группы методов ПИА (проточно-инжекционный *вводной* анализ).
К 1-ой из них относят способы анализа, основанные на обычной "неферментативной" химической реакции.
Ко 2-ой - способы определения субстратов с помощью ферментов.
К 3-ей - методы исследования активности ферментов.
К 4-ой - методы иммунохимического анализа.
Использование ПИА позволяет значительно уменьшить объем биопробы и реагентов - за счет возможности осуществлять исследования в кинетическом режиме; обеспечивает высокую производительность системы при повышении точности анализа.
Оборудование для ПИА производится рядом фирм, например, "Текатор" (Швеция).
6. Биологические микрочипы являются одним из наиболее быстро развивающихся экспериментальных направлений современной биологии. Существует два основных типа биочипов . Первый тип- это микроматрицы различных соединений, главным образом биополимеров, иммобилизованных на поверхности стекла, в микрокаплях геля, в микрокапиллярах. Другим типом биочипов являются миниатюризованные "микролаборатории". Эффективность биочипов обусловлена возможностью параллельного проведения огромного количества специфических реакций и взаимодействий молекул биополимеров, таких как ДНК, белки, полисахариды, друг с другом и низкомолекулярными лигандами. Удается в достаточно простых параллельных экспериментах собрать и обработать на отдельных элементах биочипа огромное количество биологической информации. В этом заключается фундаментальное информационное сходство биочипов с электронными микрочипами. Однако между ними имеется и ряд принципиальных различий.
Биологические микрочипы — это совокупность ячеек, расположенных на поверхности стекла или пластика, своего рода миниатюрный аналог сразу нескольких сотен, а то и тысяч реакционных пробирок.
Технологии изготовления чипов могут быть разными.
Биочип устроен следующим образом. На матрице-подложке расположено множество ячеек с гидрогелем (диаметром около 100 микрон, так что на одном квадратном сантиметре могут разместиться до тысячи ячеек). В ячейках содержатся молекулы-зонды: в зависимости от назначения биочипа это могут быть фрагменты ДНК, РНК или белки. Каждая ячейка - это аналог микропробирки, в которой происходит реакция между молекулами-зондами и молекулами исследуемой пробы. Если эти молекулы подходят друг к другу как ключ к замку, происходит так называемая гибридизация - молекулы соединяются химическими связями. Ячейка, в которой произошла реакция, флуоресцирует (потому что пробу предварительно обрабатывают светящейся меткой). В специальном приборе-анализаторе под названием "чип-детектор" конфигурация светящихся точек покажет, какие мутации есть в клетках пациента, обнаружит бактерии и вирусы, выявит генетические формы микроорганизмов – возбудителей болезни.
1.Забор анализируемого образца.
2 Обработка образца.
3 Взаимодействие образца
с иммобилизованными зондами биологического микрочипа.
4 Анализ биочипа после взаимодействия. Картина распределения свечения ячеек микрочипа является индивидуальной характеристикой анализируемого образца.
Управляющая программа контролирует эксперимент и обрабатывает данные в реальном масштабе времени и отображает их на экране монитора.