Цитохимические особенности клеток гранулоцитарного ряда

Дегенеративные изменения лейкоцитов

Токсогенная зернистость нейтрофилов – признак интоксикации, неблагоприятный прогностический признак. Иногда появляется раньше сдвига.

Вакуолизация цитоплазмы – признак интоксикации, встречается реже токсогенной зернистости.

Тельца Деле – проявление интоксикации.

Гиперсегментация ядер нейтрофилов – 5 и более сегментов. Наиболее часто – при дефиците В12 и фолиевой кислоты. М.б. врожденная.

Пельгеровская аномалия – уменьшение сегментации ядер. Наследуемое нарушение.

Псевдопельгеровская аномалия – то же, но вследствие миелопролиферативных, воспалительных процессов и т.д.

Клетки лейколиза (тени Боткина-Гумпрехта) – при ХЛЛ.

Зрелые гранулоциты: Цитохимические исследования

Принцип: выявление различных веществ в клетках, основанное на их реакции с красителями и появлении специфического окрашивания.

Оценивают: наличие или присутствие в клетке исследуемого вещества, особенности его расположения (диффузное, гранулярное).

Цитохимическая характеристика клеток гемопоэза возможна, начиная с бластных форм.

миелопероксидаза ++, липиды ++, гликоген ++ (диффузное окрашивание), щелочная фосфатаза ++.

Миелобласты: миелопероксидаза +, неспецифическая эстераза +, гликоген +, щелочная фосфатаза -.

Цитохимические особенности мононуклеарных клеток

Моноциты: неспецифическая эстераза ++, пероксидаза + - , гликоген +.

Лимфоциты: гликоген + (гранулярное окрашивание), пероксидаза -, липиды -

Выражение результатов цитохимических реакций

Полуколичественная оценка результатов (принцип Астальди): все исследуемые клетки делят на 4 группы –

• Отрицательная реакция –

• Слабоположительная +

• Положительная + +

• Резкоположительная + + +

Подсчитывают 100 клеток, дифференцируя по степени интенсивности окраски, результата суммируют и выражают в процентах (с отсутствием реакции отнимают).

Средний цитохимический коэффициент (по Kaplow)

Пример:

• Отрицательная реакция – 2

• Слабоположительная + 10

• Положительная ++ 25

• Резкоположительная +++ 63

Расчет: (2х0)+(10х1)+(25х2)+(63х3) : 100 = 2,49

Нормы цитохимических показателей каждая лаборатория разрабатывает отдельно!

Средний цитохимический коэффициент (по Kaplow)

Пример:

• Слабоположительная + 10

• Положительная ++ 25

• Резкоположительная +++ 63

Расчет: (2х0)+(10х1)+(25х2)+(63х3) : 100 = 2,49

Нормы цитохимических показателей каждая лаборатория разрабатывает отдельно!

Клиническое использование цитохимических показателей

• Дифференцировать различные формы лейкозов (FAB) -

• Миелобластный – пероксидаза, гликоген, липиды

• Монобластный – неспецифическая эстераза

• Лимфобластный – гликоген

• Дифференцировать хронический миелолейкоз и лейкемоидные реакции миелоидного типа – щелочная фосфатаза (ХМЛ ↓↓↓, лейкемоидная реакция - ↑↑↑).

• Диагностика наследственной гемолитической анемии, обусловленной дефицитом Г-6-ФД в эритроцитах.

• Выявление сидероцитов (сидеробластов).

Отрицательная реакция – 2

1. Цитохимические исследования лейкоцитов

Цитохимические исследования проводят в препаратах (мазках или отпечатках) костного мозга, крови, различных органов и новообразований, пунктатов; они основаны на использовании специфических химических цветных реакций для определения в клетках различных веществ (под действием специально подобранных реактивов происходит окрашивание тех или иных веществ в цитоплазме, а по степени и характеру окраски судят о количестве или активности исследуемых веществ). Цитохимические исследования относительно несложны, но уступают в точности количественному анализу, проводимому с помощью биохимических методов.

При цитохимическом исследовании чаще пользуются полуколичественной оценкой результатов, используя принцип Астальди, основанный на выявлении различной степени интенсивности специфической окраски. В зависимости от нее исследуемые элементы делят на 4 группы: с отрицательной реакцией (-), слабоположительной (+), положительной (++) и резко положительной (+++). Для количественного выражения результатов подсчитывают 100 клеток определенного вида, дифференцируя их по указанному принципу, затем число клеток с одинаковой интенсивностью окраски умножают на соответствующее данной группе число плюсов, сумма этих произведений составляет условные единицы. Например, при исследовании активности щелочной фосфатазы в нейтрофилах из 100 просмотренных клеток в 60 клетках активность фермента не выявлена (-), в 35 - специфическая окраска была слабой (+) и в 5 - более интенсивной (++). Результат определения активности щелочной фосфатазы в нейтрофилах в таком случае составит (60*0)+(35* 1)+(5*2)=0+35+10=45 ед.

Можно выразить результат в виде среднего цитохимического показателя по L. Kaplow (1955) или среднего цитохимического коэффициента (СЦК). С этой целью также дифференцируют 100 исследуемых клеток по указанной выше системе. Полученный процент клеток в каждой группе умножают на соответствующее данной группе число плюсов. Сумма этих величин, деленная на 100, представляет собой СЦК для одной клетки. В указанном примере СЦК щелочной фосфатазы нейтрофилов равен 0,45.

В тех случаях, когда изучаемые вещества локализуются в клетках в виде единичных гранул (например, активность неспецифической эстеразы в лимфоцитах и др.), результат цитохимической реакции целесообразно выражать в процентах клеток, дающих положительную реакцию.

Метод полуколичественной оценки является ориентировочным, но позволяет сравнивать распределение исследуемых веществ в разных клеточных элементах или в одних и тех же клетках при различных патологических состояниях организма, а также в зависимости от течения заболевания, степени его тяжести и в связи с проводимой терапией.

Следует иметь ввиду, что цитохимический метод может быть использован только в качестве дополнения к морфологическому исследованию, но не может его заменить. Недостатком всех цитохимических реакций является их приблизительная качественная оценка, основанная на степени интенсивности окраски.

Наиболее часто проводятся следующие цитохимические исследования: определение гликогена, определение липидов, определение железа (негемоглобинового), определение нуклеиновых кислот (ДНК и РНК), определение катионного белка, тест восстановления нитросинего тетразолия, определение активности ферментов (миелопероксидазы, щелочной фосфатазы, кислой фосфатазы, цитохромоксидазы, дегидрогеназ (сукцинатдегидрогеназы, альфа-глицерофосфатдегидрогеназы), неспецифических эстераз (альфа-нафтилацетат-эстеразы, кислой альфа-нафтилацетатэстеразы, нафтол-AS-ацетат-эстеразы, нафтол-AS-D-хлорацетат-эстеразы).

ЩЕЛОЧНАЯ ФОСФАТАЗА (К. Ф. 3.1.3.1.) содержится преимущественно в зрелых нейтрофильных лейкоцитах; активность фермента связывают со вторичными (специфическими) гранулами цитоплазмы. Относится к группе гидролитических ферментов с оптимумом действия при рН 9,6, осуществляет гидролиз однозамещенных эфиров ортофосфата. Наиболее распространено определение активности фермента методами азосочетания.

Метод азосочетания по Кеплоу. Принцип. Расщепление щелочной фосфатазой а-нафтил фосфата с освобождением а-нафтола, образующего с солями диазония нерастворимый окрашенный в коричневый цвет осадок в местах локализации фермента.

Реактивы . 1. 10% раствор формалина в абсолютном метаноле. 2. 0,05 М раствор про-

пандиолового буфера (рН 9,75); готовят основной 0,2 М раствор (10,5 г 2-амино-2-метил-1,3-пропандиола растворяют в 500 мл дистиллированной воды), хранят его в холодильнике. Из основного раствора готовят 0,05 М раствор (25 мл основного раствора буфера смешивают с 5 мл 0,1 н. раствора НС1 и доводят дистиллированной водой до 100 мл) , хранят в холодильнике. 3. а-Нафтилфосфат. Можно использовать нафтол-АS-Фосфат, нафтол-АS-ТR-фосфат или нафтол-АS-В1-фосфат. 4. Прочный синий RR;

можно использовать отечественные красители диазоль синий 2С и диазоль синий 0. 5. 2 %

раствор метилового зеленого. 6. Инкубационная среда (готовят перед употреблением): 35 мг а-нафтилфосфата, 35 мг прочного синего RR, 35 мл буферного раствора.

Специальное оборудование . Холодильник.

Ход исследования . Высохшие на воздухе мазки фиксируют в 10 % растворе фор-

малина в абсолютном метаноле при температуре 0—5 °С в течение 30 с. На высохшие мазки наносят инкубационную среду после фильтрования и оставляют мазки при комнатной температуре на 8—10 мин. Ополаскивают в проточной воде в течение 10 с. Докрашивают метиловым зеленым в течение 15 мин или гематоксилином Майера 3—4 мин.

Метод азосочетания (модификация М. Г. Шубича). Принцип см. метод зосочетания по Кеплоу. Реактивы . I. 0,5 % раствор целлоидина в смеси равных количеств абсолютного спирта и эфира. Целлоидин можно готовить из кино- и фотопленок по методике Меркулова: удалить слой эмульсии после вымачивания в горячей воде или щелочи, выдержать 5—10 дней в трех сменах хлороформа, промыть спиртом, высушить, мелко нарезать и растворить в смеси абсолютного спирта с эфиром. 2. 0,5 М раствор

тетрабората рН 9,18 [19,1 г тетрабората натрия (бура) растворить и довести дистиллированной водой до 1 л] . Раствор стойкий. 3. 0,1 % раствор а-нафтилфосфата в растворе тетрабората (готовят перед употреблением). 4. 0,2 % раствор диазоля синего 0 в растворе тетрабората (готовят перед употреблением и фильтруют в защищенном от света месте). 5. Гематаль 8 Бейкера: один объем 0,1 % гематеина, приготовленного на 50 % водном растворе этиленгликоля, смешивают с одним объемом 1,6 % водного раствора

сульфата алюминия. Вместо гематаля можно использовать гематоксилин: 1 г краски растворяют в 50 мл дистиллированной воды, доводят до кипения, доливают 50 мл дистиллированной воды, добавляют 0,02 г йодата натрия и 5 г алюмокалиевых квасцов, встряхивают до растворения и охлаждают. 6. Инкубационная среда (готовят перед употреблением); равные количества реактивов 3 и 4.

Специальное оборудование . Холодильник.

Ход определения . Мазки фиксируют в 0,5 % растворе целлоидина в течение 3—5 с.

После фиксации целлоидин с обратной стороны предметного стекла удаляют салфеткой, стекла ставят в вертикальном положении на фильтровальную бумагу и дают им высохнуть. Инкубируют в инкубационной среде при комнатной температуре в защищенном от света месте в течение 30 мин. Промывают в проточной воде в течение 5—10 мин и ополаскивают в дистиллированной воде. Докрашивают ядра красителем

(реактив 5). При использовании гематаля 8 мазки окрашивают 18—24 ч, затем ополаскивают в дистиллированной и проточной воде и высушивают. При использовании гематоксилина мазки окрашивают 30—60 мин, ополаскивают в тетраборатном буфере, разведенном водопроводной водой, промывают водой и высушивают.

Нормальные величины . У здоровых людей большинство сегментоядерных нейтрофилов являются фосфатазоотрицательными и только в 20—30 % клеток выявлена слабая активность фермента ( + )• По данным М. Г. Шубича и Б. С. Нагоева, активность фосфатазы для здоровых обоего пола составляет 26±0,6 ед., или СЦК 0,26 + 0,006. Выявлено достоверное различие между показателями энзиматической активности у мужчин и женщин (соответственно 21 ±0,7 и 31 ±0,8 ед.).

Клиническое значение . Наибольшее диагностическое значение имеет определение активности фермента при гемобластозах; снижение активности характерно для хронического миелолейкоза, повышение — рассматривают как один из признаков эритремии. Повышение активности наблюдается также при воспалительных процессах, интоксикациях, опухолях, коллагенозах, циррозах печени. Показатель может быть использован как дифференциально-диагностический признак при лейкемоидных реакциях (активность фермента повышена) и хроническом миелолейкозе. Снижение активности

фермента часто сопутствует вирусному гепатиту, инфекционному мононуклеозу и другим вирусным инфекциям, лучевой болезни.