Занятия / Методы / ЛейкозОстрЛабДиагностика

Министерство здравоохранения Республики Беларусь

Гомельский государственный медицинский институт

Кафедра лабораторной диагностики и иммунологии

Утверждено на заседании кафедры

Протокол №…. от…. 2001 года

Заведующий кафедрой, к.м.н.

______________ И.В.Тарасюк

Острые лейкозы. Лабораторная диагностика.

Учебно-методическое пособие для студентов

Автор: ассистент Жукова Е.Г.

Гомель, 2001 год

Введение.

Острый лейкоз – опухолевое клоновое заболевание кроветворной системы с первичным поражением костного мозга. Мишенью опухолевой трансформации являются коммитированные клетки-предшественники, реже стволовые кроветворные клетки. Диагностика острых лейкозов включает исследование периферической крови, костного мозга и по показаниям трепанобиопсию. Диагноз острого лейкоза – исключительно морфологический, устанавливаемый при обнаружении в крови и/или костном мозге бластных клеток, что обуславливает актуальность данной темы.

Цель:

• Изучить этиопатогенез, классификацию, стадии течения и основные клинические синдромы острых лейкозов.

• Разобрать вопросы клинико-лабораторной диагностики острых лейкозов.

Задачи:

• знать этиопатогенез, классификацию, стадии течения и основные клинические синдромы острых лейкозов;

• уметь проводить лабораторную диагностику острых лейкозов.

Практические навыки:

• Изучить особенности, характерные для мазков крови и костного мозга при основных типах острых лейкозов.

• Выполнение цитохимических методов диагностики острых лейкозов.

Основные учебные вопросы:

1. Лейкозы, эпидемиология, этиология, патогенез.

2. Классификация лейкозов.

3. Современные методы лабораторной диагностики лейкозов.

4. Острые лейкозы, стадии течения, клинико-лабораторные показатели.

Вспомогательные материалы по теме:

Острая миелоидная лейкемия — ОМЛ (acute myeloid leukaemia — AML). В соответствии с ФАБ-классификацией, выделяется 8 вариантов ОМЛ, обозначаемых буквой М и цифрой: МО, M1, М2, МЗ, М4, М5, М6, М7. Дифференциация вариантов М1—М5 и большинства случаев М6 проводится на основании морфологии и цитохимии, которые позволяют охарактеризовать линейную направленность дифференцировки лейкемических клеток (гранулоцитарная, моноцитарная и эритроидная линии дифференцировки), а также определить степень этой дифференцировки (M1 — острая миелобластная лейкемия без созревания, М2 — острая миелобластная лейкемия с созреванием, МЗ — острая промиелоцитарная лейкемия, М5а — острая монобластная лейкемия, М5Ь — острая моноцитарная лейкемия). Выделение вариантов МО, М6 с незрелым фенотипом бластных клеток и большинства случаев М7 возможно лишь при использовании иммунологических методов и/или электронной микроскопии.

Для улучшения воспроизводимости классификации ФАБ-группа сформулировала цитологические критерии выделения миелобластов и промиелоцитов. По морфологическим признакам выделяется 2 типа миелобластов. Тип 1 — бластные клетки с высоким ядерно-цитоплазматическим соотношением (я/ц), неконденсированным ядерным хроматином, выступающими нуклеолами. Эти клетки не имеют морфологических признаков миелоидной дифференцировки и при отсутствии в лейкемической популяции более зрелых миелобластов могут рассматриваться как неклассифицируемые или даже лимфобласты. Тип 2 — бластные клетки напоминают тип 1, но имеют морфологические признаки миелоидной дифференцировки в виде редких азурофильных гранул и могут иметь палочки Ауэра. Этот тип характеризуется более низким я/ц и центральным положением ядра.

Промиелоцит имеет низкое я/ц соотношение, эксцентрически расположенное ядро, развитую зону Гольджи (просветление в выемке ядра), более конденсированный ядерный хроматин и множественные азурофильные гранулы.

Рассмотрим основные практические аспекты ФАБ-классификации. Диагностика ОМЛ в соответствии с ФАБ-критериями может быть представлена в виде нескольких этапов и требует обязательного исследования мазков пунктата костного мозга и периферической крови.

На первом этапе подсчет морфологической миелограммы на 500 клеток позволяет определить процент бластных клеток от всех ядерных элементов костного мозга. Содержание в костном мозге 30% и более клеток с морфологическими признаками бластов необходимо и достаточно для диагностики ОЛ (ОМЛ и ОЛЛ). Однако если количество бластных клеток менее 30%, диагностика проводится дифференцированно в зависимости от процентного содержания эритроидных клеток в пунктате (наличие или отсутствие эритроидного преобладания).

Если суммарное содержание эритроидных клеток меньше 50%, диагностируется МДС. Таким образом, в отсутствие эритроидного преобладания сохраняет свою силу основной диагностический критерий ОМЛ — 30% и более бластов от всех ядерных клеток костного мозга. Исключение составляет лишь МЗ вариант ОМЛ, когда в цитологическом составе пунктата преобладают атипичные промиелоциты, а не миелобласты.

В случае эритроидного преобладания (50% и более эритрокариоцитов в пунктате костного мозга) необходимо определить процент бластов внутри неэритроидной популяции. Содержание в неэритроидной популяции 30% и более бластных клеток соответствует диагностическому критерию М6-варианта ОМЛ, а при меньшем проценте бластных клеток диагностируется МДС. Необходимо отметить, что из популяции неэритроидных клеток (НЭК) исключаются не только все эритрокариоциты, но и лимфоциты, плазматические клетки, макрофаги и тучные клетки. Таким образом, неэритроидный компонент костного мозга включает только бластные клетки и созравающие элементы гранулоцитарной и моноцитарной серий.

Кроме корректного подсчета процента бластов, диагностика ОМЛ предполагает обязательное выявление цитохимических маркеров миелоидной дифференцировки лейкемических клеток.

Обязательные цитохимические реакции включают: 1) выявление миелопероксидазы (МПО) и/или липидов; 2) исследование активности неспецифических эстераз: альфа-нафтилацетатэстеразы (АНАЭ) и/или альфа-нафтилбутиратэстеразы (АНБЭ) с оценкой чувствительности реакции к ингибиции фторидом натрия.

МПО — высокоспецифичный маркер миелоидной дифференцировки и может обнаруживаться в отсутствие азурофильных гранул в бластах 1-го типа. Липиды обычно выявляются в высокой корреляции с МПО, но могут обнаруживаться в менее зрелых миелобластах в отсутствие МПО, т. е. являются более чувствительным (на уровне световой микроскопии) маркером миелоидной дифференцировки. Однако в редких случаях ОЛЛ липиды выявляются и в лейкемических лимфобластах.

Распределение МПО и липидов различается в клетках гранулоцитарной и моноцитарной линий дифференцировки. В миелобластах МПО и липиды расположены компактно, чаще на одном полюсе клетки, а в моноцитарных клетках — в виде рассеянных гранул.

В соответствии с ФАБ-критериями ОМЛ для подтверждения миелоидной природы бластов необходимо выявить 3% и более бластных клеток, положительных на МПО и/или липиды. Выявление МПО и/или липидов имеет наибольшую диагностическую ценность в случае ОМЛ с проявлением гранулоцитарной дифференцировки (варианты M1—M4), поскольку "чистые" моноцитарные, мегакариобластные и лейкемии из малодифференцированных эритроидных предшественников в большинстве случаев отрицательны по этим реакциям. Моноцитарная природа лейкемической популяции подтверждается выявлением в бластных клетках неспецифических эстераз (АНАЭ и АНБЭ), чувствительных к ингибирующему действию фторида натрия. Дополнительным тестом может служить измерение уровня лизоцима в сыворотке крови или моче. Лейкемические мегакариобласты также могут давать положительную реакцию на АНАЭ, однако в отличие от клеток моноцитарной серии они отрицательны на АНБЭ. Эстеразная активность в мегакариобластах часто локализуется в зоне Гольджи. Эритробласты при Мб-варианте ОМЛ также обычно положительны в реакциях на АНАЭ и на АНБЭ.

Заключительный этап диагностики ОМЛ связан с определением варианта заболевания. Выполнение этого этапа требует обязательного исследования мазков периферической крови. В табл. 1 суммированы основные критерии диагностики вариантов ОМЛ в соответствии с предложениями ФАБ-группы.

Таблица 1

Критерия диагностики вариантов ОМЛ

Вариант	Соотношение клеток, различных по направлению и степени дифференцировки, %					Наиболее важные диагностические маркеры
	от всех клеток костного мозга		от неэритроидных клеток
	сумма эритроидных клеток	бласты	бласты	созревающие гра-нулоциты*	созревающие моноциты**
МО	<50	>30	Не отражено в оригинальном описании			Иммунологические и ультраструктурные маркеры миелоидной дифференцировки
Ml	<50	>30	> 90	Не имеет значения		Морфологические и цитохимические маркеры миелоидной дифференцировки: 1) МПО, 2) липиды, 3)НЭ (NaF), 4) ХАЭ
M2	<50	>30	30-89	> 10	< 20
МЗ	<50	Вариабелен, преобладают атипичные промиелоциты
М4	<50	>30	Не имеет значения	> 20 в сумме с миелобла-стами	> 20 в сумме с монобла-стами
М5	<50	>30	Не имеет значения		> 80 в сумме с монобла-стами
Мб	>50	Вариабелен	>30	Не имеет значения		Иммунологические маркеры эритроидной дифференцировки
М7	<50	>30	Не отражено в оригинальном описании			Иммунологические и ультраструктурные маркеры мегакариоцитарной дифференцировки

Для диагностики МО-варианта ОМЛ необходимо выявить признаки миелоидной дифференцировки иммунологическими методами (экспрессия миелоидных антигенов) или с помощью электронной микроскопии (наличие миелопероксидазы). В табл. 1 представлены лишь те количественные критерии, без которых невозможна дифференциальная диагностика вариантов ОМЛ. Так, для верификации M1-варианта достаточно выявить 90% и более бластов l1—2-гo типа среди НЭК костного мозга и подтвердить наличие цитохимических признаков гранулоцитарной дифференцировки этих клеток (МПО и/или липиды, АНАЭ и/или АНБЭ). Понятно, что в этом случае созревающие гранулоцитарный и моноцитарный компоненты не могут превышать 10% и фактически не требуют оценки. Некоторые проблемы могут возникать лишь при выявлении клеток, которые не отвечают морфологическим критериям бластов 1—2-го типа и промиелоцитов. Эти клетки имеют более обильную, часто базофильную цитоплазму и вариабельное, иногда с тенденцией к слиянию число гранул. Эти бласты рассматриваются как более зрелые и, если их количество достигает 10% и более от НЭК, диагностируется М2-вариант ОМЛ.

В случае М2-варианта учитываются все 3 показателя, так как количество бластов (30—89% НЭК) и количество созревающих гранулоцитов (>10% НЭК) необходимы для разделения M1- и М2-вариантов ОМЛ, а оценка моноцитарного компонента (<20% НЭК) — для исключения М4-варианта ОМЛ.

При диагностике М4-варианта ОМЛ гранулоцитарный компонент рассчитывается как сумма всех созревающих гранулоцитов и миелобластов, поэтому часть случаев М4-варианта ОМЛ соответствует М2-варианту с моноцитарным компонентом более 20%, при этом созревающий гранулоцитарный компонент (от промиелоцита и ниже) может быть меньше 20%. Моноцитарный компонент также включает в себя, кроме более зрелых клеток, еще и монобласты, поэтому другая часть случаев М4-варианта ОМЛ по своим цитологическим характеристикам может приближаться к М5-варианту, но с гранулоцитарным компонентом более 20%.

Однако в соответствии с ФАБ-классификацией оценка моноцитарного компонента не ограничивается подсчетом моноцитарных клеток в пунктате костного мозга. Присутствие моноцитарного компонента считается доказанным в перечисленных ниже диагностических ситуациях.

1. Морфологически в костном мозге выявляется 20% и более моноцитарных клеток, включая монобласты (от НЭК), а моноцитоз в периферической крови больше 5х10⁹/л. Цитохимическое подтверждение моноцитарной природы этих клеток — не обязательно.

2. Морфологически в костном мозге выявляется 20% и более моноцитарных клеток, включая монобласты, но моноцитоз в крови меньше 5х10⁹/л. В этом случае обязательно цитохимическое исследование для доказательства моноцитарного происхождения этих популяций.

3. Морфологическая картина костного мозга соответствует М2-варианту ОМЛ, но моноцитоз в крови достигает 5х10⁹/л. Для подтверждения моноцитарного компонента необходимо цитохимическое исследование этих клеток и/или определение уровня лизоцима в сыворотке крови и/или моче. В этих случаях процент клеток, положительных на НЭ, обычно превышает процент моноцитарных клеток, полученный при подсчете морфологической миелограммы.

В соответствии с этими критериями М4-вариант является наиболее гетерогенной группой ОМЛ и для его диагностики необходимо исследование клеток костного мозга и крови. Следует обратить внимание на тот факт, что ФАБ-критерии не предусматривают разделения М4-варианта ОМЛ на 2 реально существующих варианта: варианта с 2 лейкемическими популяциями, каждая из которых имеет признаки либо гранулоцитарной, либо моноцитарной дифференцировки, и так называемого переходного варианта (transitional myelomonocytic variant), при котором бластные клетки одновременно экспрессируют маркеры обеих линий миелоидной дифференцировки (интенсивно положительная реакция на МПО и/или липиды и интенсивная, чувствительная к ингибиции фторидом неспецифическая эстераза).

Для диагностики М5-варианта ОМЛ моноцитарный компонент, включающий в себя монобласты, промоноциты и моноциты, должен составлять 80% и более НЭК. Понятно, что в этом случае гранулоцитарный компонент не может превышать 20% и диагноз М4-варианта ОМЛ не рассматривается. Если же монобласты составляют 80% и более от всех моноцитарных клеток, диагностируется М5а-субвариант или острая монобластная лейкемия, при меньшем содержании монобластов — М5Ь-субвариант.

Диагностика МЗ-варианта ОМЛ не требует дифференцированного подсчета клеток внутри неэритроидного пула и основана на характерных морфологических (гипергранулярные или микрогранулярные промиелоциты) и цитохимических (высокое содержание МПО, липидов, ХАЭ) признаках лейке-мических промиелоцитов.

Диагностическим критерием Мб-варианта ОМЛ является присутствие 30% и более бластных клеток внутри неэритроидной популяции на фоне эритроидного преобладания (50% и более эритрокариоцитов в пунктате костного мозга).

М7-вариант ОМЛ может быть определен на основе морфологических признаков мегакариоцитарной дифференцировки (формирование и отшнуровка тромбоцитов в цитоплазме дозревающих лейкемических клеток, присутствие мононуклеарных микромегакариоцитов и аномальных форм тромбоцитов в крови). Однако в большинстве случаев М7-варианта ОМЛ бластные клетки являются морфологически недифференцированными или даже напоминают L1-, L2-лимфобласты с цитоплазматическими гранулами или без них в сочетании с гетерогенностью бластных клеток по размерам (20—30% бластов имеют крупные размеры, превышающие в 2—3 раза размеры нормальных лимфоцитов). Отсутствие достоверных морфоцитохимических признаков мегакариоцитарной дифференцировки лейкемических клеток делает необходимым исследование иммунологических маркеров и/или пластиночной пероксидазы (ультраструктурная цитохимия) для диагностики этого варианта заболевания.

Материалы для контроля за усвоением темы:

Тестовый контроль:

1. Какое из перечисленных суждений в отношении диагностики острого лейкоза правильно:

а) диагноз можно поставить при наличии соответствующих жалоб (быстрая утомляемость, потеря массы тела);

b) диагноз можно поставить при наличии определенных клинических синдромов — геморрагического, анемического, септико-некротического;

c) диагноз можно поставить при обнаружении бластной трансформации костного мозга (например, бластов 30% и более);

d) диагноз можно поставить при нахождении в биоптате лимфоузла клеток Березовского—Штернберга.

2. Стернальная пункция целесообразна лишь:

а) у больной, отмечающей в течение нескольких лет меноррагии, синяки на коже при нормальном содержании лейкоцитов и гемоглобина;

b) у больного с гепатолиенальным синдромом, портальной гипертензией, геморрагиями на коже, носовыми кровотечениями, анемией, лейкоцитопенией;

c) у больного с рецидивирующей тромбоэмболией легочной артерии, получающей лечение гепарином, при нормальных показателях гемоглобина и лейкоцитов;

d) у больного с геморрагическим синдромом, возникшим около месяца назад (носовые, десневые кровотечения, кожные геморрагии), анемией, нейтропенией.

Ответы: 1-c; 2-d.

Задания для самоподготовки и УИРС:

1. Лейкозы, эпидемиология, этиология, патогенез.

2. Классификация лейкозов.

3. Современные методы лабораторной диагностики лейкозов.

4. Острые лейкозы, стадии течения, клинико-лабораторные показатели.

5. УИРС: Типичные хромосомные аберрации при лейкозах.

Литература:

Основная

1. Клиническая лабораторная аналитика (под ред. В.В. Меньшикова). – М.: Лабинформ, 1999 – 352 с., т.2.

2. Фред Дж. Шиффман Патофизиология крови – М. – СПб.: «Издательство БИНОМ» – «Невский Диалект», 2000.-с.336-343.

3. Справочник по гематологии (под ред. А.Ф.Романовой). –К.: Здоровье,1997. – с.122-135.

4. Луговская С.А., Морозова В.Т., Почтарь М.Е. Лабораторная диагностика лейкозов. – РМАПО, 1999. – 80 с.

Дополнительная

1. Гольдберг Е.Д. Справочник по гематологии с атласом микрофотограмм. Томск: Изд-во Том. Ун-та, 1989. – 468 с.

2. Вуд М., Банн П. Секреты гематологии и онкологии. – М.: «Издательство Бином», 1997. –560 с.

1. Л.В. Козловская, М.А. Мартынова Учебное пособие по клиническим лабораторным методам исследования – М.: «Медицина», 1975.