Добавил:
ilirea@mail.ru Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз: Предмет: Файл:

Занятия / Методы / Мегакариоцитопоэз

.doc
Скачиваний:
63
Добавлен:
23.08.2018
Размер:
69.63 Кб
Скачать

Министерство здравоохранения Республики Беларусь

Гомельский государственный медицинский институт

Кафедра лабораторной диагностики и иммунологии

Утверждено на заседании кафедры

Протокол №…. от…. 2000 года

Заведующий кафедрой, к.м.н.

______________ И.В.Тарасюк

Мегакариоцитопоэз.

Учебно-методическое пособие для студентов

Автор: ассистент Жукова Е.Г.

Гомель, 2000 год

Введение.

Около 80% всех случаев кровоточивости у больных приходится на долю нарушений первичного (тромбоцитарного) звена гемостаза. Это прежде всего наследственные тромбоцитопатии, наиболее распространенными из которых являются тромбастения Гланцмана, болезнь Бернара—Сулье, нарушения секреции тромбоцитов, обусловленные, с одной стороны, различными дефектами гранул хранения (дефицит пула хранения адениновых нуклеотидов, болезнь Германского—Пудлака, болезнь Чедиака—Хигаши, тромбоцитопатия с одновременным отсутствием лучевой кости, болезнь серых тромбоцитов и др.), с другой — нарушениями секреции, зависящими от дефектов активации этого процесса (отсутствие циклооксигеназы, тромбоксансинтетазы и другие аномалии передачи сигнала внутрь клетки).

Значительно чаще, чем наследственные, встречаются аналогичные нарушения приобретенного характера, которые развиваются при эндотоксикозе. аутоиммунных и дисгормональных нарушениях в организме, в результате побочного действия лекарственных веществ и вредного воздействия факторов окружающей среды и промышленных вредностей.

Изучение данной темы является важным разделом в подготовке врачей-лаборантов.

Цель:

  • Получить знания по основным вопросам мегакариоцитопоэза, методам оценки тромбоцитарного звена гемостаза.

Задачи:

  • знать кинетические и структурные особенности тромбоцитов;

  • знать лабораторные методы оценки количества и функциональных свойств тромбоцитов;

  • уметь определять количество тромбоцитов;

  • уметь идентифицировать клетки мегакариоцитопоэза

Практические навыки:

  • Подсчет количества тромбоцитов унифицированным методом.

Основные учебные вопросы:

  1. Мегакариоцитопоэз.

  2. Морфологическая и функциональная характеристика тромбоцитов.

  3. Способы определения количества тромбоцитов.

  4. Агрегатометрия.

  5. Тромбоцитопении, этиология, патогенез, клинико-лабораторные показатели крови, костного мозга.

  6. Тромбоцитопатии, классификация, этиопатогенез, клиника, лабораторные показатели крови, костного мозга, агрегатограмм.

  7. Тромбоцитоз, этиопатогенез, клинико-лабораторная диагностика, эссенциальная тромбоцитемия.

Вспомогательные материалы по теме:

ПРОГРАММА ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ ТРОМБОЦИТОПАТИЙ

Программа клинико-лабораторного обследования больных для диагностики характера тромбоцитарных нарушений включает 3 этапа обследования больного в зависимости от задачи диагностики и возможностей медицинского учреждения: I этап — скрининговый, проводится для установления факта патологии тромбоцитов как причины кровоточивости у больного, а также для выбора направления углубленного изучения гемостаза; II этап — функциональный, его цель — выявление характера тромбоцитопатического синдрома у больного, т. е. преимущественно нарушенной ступени первичного гемостаза; III этап — функционально-биохимический, его цель — выяснение генеза тромбоцитопатического синдрома.

Скрининговый этап обследования больного начинается с оценки клинических данных, позволяющих высказать предположение о наличии у больного, с одной стороны, тромбоцитопатии или болезни Виллебранда, с другой — коагулопатии, а также о генезе заболевания — наследственный или приобретенный.

Для больного с тромбоцитопатией характерен системный капиллярный тип кровоточивости: носовые, десневые, кожные, почечные, маточные кровотечения, кровотечения сразу после экстракции зуба, отсутствие гемартрозов и гематом, характерных для кровоточивости при коагулопатиях.

В пользу наследственного генеза заболевания свидетельствует наличие кровоточивости у родственников, начало заболевания в детстве и юности, множественные его обострения, в том числе тяжелые, требующие обращения в "скорую помощь", госпитализации и трансфузионной терапии, иногда хирургического вмешательства для остановки кровотечения. Наоборот, на приобретенный характер патологии указывает не очень большой срок заболевания, явное совпадение его развития чаще всего с одной из следующих причин: с длительным, массивным, а иногда с единичным приемом лекарств — аспирина, сосудорасширяющих и антипсихотических средств, антиде-прессантов, антибиотиков; наличием общих заболеваний (заболевания крови, соединительной ткани, хронические очаги инфекции, болезни почек, печени, тяжелые эндокринные нарушения); наконец, с воздействием факторов, которые можно отнести к промышленным вредностям: ионизирующее облучение, СВЧ, бензол и его производные, свинец, пестициды и др.

Лабораторные исследования скринингового этапа обследования начинаются с проведения 2 самых простых тестов, которые могут быть выполнены в любой самой маленькой лаборатории: длительность кровотечения и время свертывания крови по Ли и Уайту. Системный капиллярный тип кровоточивости и увеличение длительности кровотечения наводит на мысль, что у больного имеется патология тромбоцитарного, а не коагуляционного звена гемостаза. Обязательным, конечно, является подсчет числа тромбоцитов в крови для исключения тромбоцитопении как причины кровоточивости у больного или тромбоцитопатии, при которой наряду с качественной неполноценностью тромбоцитов имеется и количественный их дефект (синдром Бернара—Сулье, синдром Вискотта—Олдрича, синдром отсутствия лучевой кости). При этом обращают также внимание на размеры тромбоцитов, так как для ряда тромбоцитопатии характерно наличие макроформ (синдром Бернара—Сулье, синдром отсутствия лучевой кости) и микроформ (синдром Вискотта—Олдрича).

На скрининговом этапе обследования делается также ориентировочная коагулограмма для окончательного исключения коагулопатии у больного или афибриногенемии как причины нарушения образования тромбоцитарной пробки, а также для получения коагулологических критериев диагностики болезни Виллебранда — удлинение активированного парциального тромбопластинового времени и снижение коагуляционной активности фактора VIII.

Таким образом, после проведения скринингового этапа обследования, врач не только знает, что у больного кровоточивость связана с нарушеним первичного гемостаза, но и имеет рабочую гипотезу в отношении того, страдает ли больной истинной тромбоцитопатией или это болезнь Вилленбранда или афибриногенемия.

При проведении функционального этапа обследования безгранично господствует фотометрический метод Борна. Он разработан и применяется для изучения агрегации тромбоцитов под влиянием различных агрегирующих агентов. Но с помощью агрегометра, изменяя способ стабилизации крови, выбирая соответствующий индуктор и его концентрацию, можно оценивать не только процесс агрегации, но и 2 другие ступени тромбоцитарного гемостаза — адгезию и секрецию с необратимой агрегацией тромбоцитов. Помимо этого, можно дифференцировать тромбоцитопатии и зависимости от механизма и происхождения наблюдаемого синдрома, отличить истинно тромбоцитарный дефект от дефекта плазменного кофактора или наличия в плазме ингибитора функции тромбоцитов. С учетом этого клинико-диагностическая лаборатория гематологического стационара обязана иметь прибор для автоматической регистрации процесса агрегации тромбоцитов (агрегометр).

Целью функционального этапа обследования является оценка процесса адгезии тромбоцитов, а также выяснение генеза ее нарушения, т.е. диагностика тромбоцитопатии. в основе которых лежит нарушение процесса адгезии кровяных пластинок.

Основным молскулярно-клеточным механизмом процесса адгезии является взаимодействие тромбоцитов при помощи мембранного рецептора гликопротеида (ГП) Ib/IX с коллагеновыми фибриллами субэндотелия через фактор Виллебранда плазмы. Существенно, что этот процесс в отличие от агрегации кровяных пластинок может происходить и при отсутствии в среде ионов кальция. Следовательно, патологии, которые мы определяем, изучая адгезию тромбоцитов, — это болезнь Виллебранда (недостаточность фактора Виллебранда плазмы) и болезнь Бернара—Сулье (недостаточность рецептора тромбоцитов для фактора Виллебранда — ГП Ib/IX). Следует помнить также о возможности развития аналогичных синдромов приобретенного характера, когда фактор Виллебранда или ГП Ib/IX могут быть блокированы антителами.

После установления факта нарушения у больного адгезии тромбоцитов необходимо определить причину этого нарушения, т. е. дифференцировать синдром Виллебранда и синдром Бернара—Сулье. О синдроме Бернара—Сулье наряду с нарушением адгезии пластинок свидетельствует умеренное снижение числа тромбоцитов — порядка (100—120) х109л, наличие их макроформ, а также полученные при проведении ориентировочной коагулограммы данные о нормальном уровне коагуляционной активности фактора VIII и значении АПТВ. В пользу синдрома Виллебранда будут говорить сведения противоположного характера — нормальные число и диаметр тромбоцитов и измененные показатели АПТВ и активности фактора VIII. Нарушения, выявленные при болезни Виллебранда, могут быть "исправлены" при заменной пробе, когда к исследуемой плазме с тромбоцитами больного добавляют равное количество плазмы, лишенной тромбоцитов, донора. При болезни Бернара—Сулье все нарушения останутся, так как они обусловлены патологией тромбоцитов, а не их плазменного кофактора.

Информативным исследованием при диагностике болезни Вилленбранда является определение активности фактора Виллебранда, точнее — ристомицин-кофакторной активности плазмы больного в тесте агглютинации формалинизированных тромбоцитов донора.

До окончательного подтверждения диагноза болезни Виллебранда на функционально-биохимическом этапе обследования проводится прямое определение содержания в плазме крови больного антигена фактора Виллебранда с помощью моно-клональных антител методом иммуноферментного анализа.

Наконец, анамнестические данные, указывающие на возможность приобретенного генеза выявленных нарушений, в частности, на наличие в крови больного антител, блокирующих активные места фактора Виллебранда или ГП Ib/lX, требуют проведения ингибиторной пробы, оценивающей влияние на ристомициновую агрегацию донора предварительной инкубации его плазмы с бестромбоцитной плазмой больного. При наличии антител величина агрегации под влиянием ристомицина уменьшится ниже 75% от исходного значения.

При неизмененных показателях адгезии переходят к оценке следующей ступени динамических превращений тромбоцитов на пути образования гемостатической пробки — первичной (обратимой) агрегации.

Молекулярно-клеточным механизмом этого процесса является взаимодействие мембранного рецептора ГП llb/llla одного тромбоцита с ГП llb/llla другого через плазменный белковый кофактор фибриноген. При этом обязательно участие ионов кальция плазмы крови. Следовательно, первичная агрегация будет нарушена при наличии у больного тромбастении Гланцмана (отсутствие или неполноценность рецептора ГПЬ/llla) или афибриногенемии.

Основными методами оценки первичной агрегации является изучение снижения оптической плотности стандартизированной плазмы под влиянием пороговых доз АДФ (10-7 — 10-6 М), адреналина и серотонина, а также по величине 1-й волны агрегации под влиянием средних доз этих агонистов (2-я волна отражает процесс секреции).

При установлении факта нарушенной первичной агрегации необходимо установить причину этой аномалии. Об афибриногенемии свидетельстсвуют показатели фибриногена в ориентировочной коагулограмме.

Для диагностики тромбастении Гланцмана обязательно проводится исследование ретракции сгустка крови, ибо отсутствие ее или резкое нарушение наряду с нарушением первичной агрегации является патогномоничным признаком этого заболевания.

При подозрении на аутоиммунный генез тромбастенического синдрома проводится ингибиторная проба по влиянию на АДФ-агрегацию донорских тромбоцитов их предварительной инкубации с бестромбоцитной плазмой больного.

Верификация диагноза тромбастении Гланцмана проводится на функционально-биохимическом этапе обследования путем непосредственного определения наличия в мембране тромбоцитов больного ГП llb и ГП IIIa методом электрофореза после предварительного окисления перйодатом и введения радиоизотопной метки 3Н или определения наличия и количества мембранного комплекса ГП Ilb/llla методом жидкостной цитометрии с помощью моноклональных антител.

Если у больного с нарушенным первичным гемостазом не выявлено изменений адгезии и первичной агрегации тромбоцитов, вероятнее всего, патология этих клеток заключается в секреции ими эндогенных агрегирующих агентов и модуляторов гемостаза. Этот, наиболее сложный этап образования первичной гемостатической пробки, сопровождается необратимой агрегацией тромбоцитов и сокращением (ретракцией) тромбоцитарного сгустка с превращением его в гемостатически эффективную пластиночную пробку, не смываемую кровью. На этом этапе из плотных гранул хранения высвобождается большое количество АДФ, что необходимо для увеличения объема тромбоцитарной пробки до гемостатически эффективных размеров; из альфа-гранул высвобождаются белковые факторы, участвующие в образовании тромбоцитарного сгустка: фибриноген, фибронектин, фактор Виллебранда; из альфа-гранул высвобождаются медиаторы воспалительных и репаративных процессов; мембранами активированных тромбоцитов формируется каталитическая поверхность для реакций свертывания крови, а из альфа-гранул высвобождаются факторы, участвующие в этом процессе.

Клинические наблюдения показывают, что наиболее часто нарушение секреторного процесса происходит по двум причинам. Первая — дефект механизма передачи сигнала от мембраны внутрь клетки до энергетических и сократительных систем, непосредственно производящих гемостатический ответ клетки. В основе этого дефекта активации процесса секреции чаще всего лежит недостаточность двух ключевых ферментов тромбоксансинтезируюшей системы — циклооксигеназы и тромбоксансинтетазы. Вторая причина — отсутствие плотных гранул или резкое снижение содержания в них адениновых нуклеотидов. Эта патология может быть наследственно обусловленной (дефицит пула хранения адениновых нуклеотидов, синдром Германского—Пудлака, синдром Чедиака—Хигаши, тромбоцитопатия с одновременным отсутствием лучевой кости) или приобретенной. Приобретенная патология типа дефицита пула хранения адениновых нуклеотидов может быть двух принципиально различных происхождений: в результате дисфункции мегакариоцитов костного мозга при различных патологиях — первичный дефицит пула хранения АДФ и в результате внутрисосудистой активации и секреции тромбоцитов — вторичный дефицит пула хранения адениновых нуклеотидов. Дифференциация генеза приобретенного синдрома дефицита пула хранения имеет непосредственное определяющее значение при выборе направления лечения: в первом случае — стимуляция, во втором — ингибиция тромбоцитарной активности.

Основными фотометрическими методами оценки эффективности секреции тромбоцитов является изучение агрегации под влиянием малых концентраций коллагена и величины 2-й волны агрегации под влиянием средних концентраций АДФ, адреналина и серотонина. Коллаген в прямом смысле слова не является агрегирующим агентом, но это мощный активатор процесса секреции тромбоцитов. Агрегация тромбоцитов, которую фиксирует агрегометр после добавления к плазме с тромбоцитами суспензии коллагена, вызвана собственной АДФ тромбоцитов, высвободившейся под влиянием их контакта с коллагеновыми фибриллами. Таким образом, величина агрегации, развившейся после добавления коллагена, при нормальной агрегационной активности тромбоцитов косвенно отражает эффективность их процесса секреции.

При обнаружении факта нарушенной секреции необходимо установить внутриклеточный генез этой аномалии. Для этого проводятся дополнительные функциональные и биохимические исследования. Прежде всего повторяется исследование коллагеновой агрегации, однако концентрацию коллагена берут в 10—100 раз выше стандартной. Активация тромбоцитов под влиянием таких концентраций коллагена идет не через тромбоксансинтезирующий путь, а через другой, фосфоинозитольный и, таким образом, дефект активации тромбоксансинтезируюшей системы при этом будет нивелирован. Если же причиной неэффективности секреции является не дефект активации, а отсутствие материала секреции, пула хранения адениновых нуклеотидов в плотных гранулах, то увеличение дозы коллагена не нормализует коллагеновую агрегацию.

Кроме того, может быть проведена переносная проба на определение скорости и эффективности синтеза в активированных коллагеном тромбоцитах тромбоксана А. Агрегацию тромбоцитов больного проводят в кювете агрегометра после добавления к ней суспензии коллагена. Через 1 мин от начала реакции 0,1 мл супернатанта содержимого кюветы переносят в другую кювету с тромбоцитарной плазмой донора и фотометрически оценивают в ней величину агрегации, вызванной тромбоксаном А, синтезированным тромбоцитами обследуемого. Показатели этой пробы нарушены при дефектах механизма активации и не изменены при дефиците пула хранения адениновых нуклеотидов.

Наилучшим способом дифференциации внутриклеточного генеза дефекта секреции является прямое определение содержания в тромбоцитах АТФ и АДФ до и после секреции кровяных пластинок методом тонкослойной хроматографии на пластинах силуфол или одним из других биохимических методов.

При выявлении у больного дефицита пула хранения адениновых нуклеотидов явно приобретенного характера целесообразно провести исследование на внутрисосудистую активацию тромбоцитов по методу А. С. Шитиковой. Повышенная внутрисосудистая активация тромбоцитов в сочетании с недостатком пула хранения АДФ указывает на вторичность дефицита АДФ в кровяных пластинках и требует терапии, направленной на ингибицию этой патологической активации.

Своевременная диагностика наследственных и приобретенных тромбоцитопатий и определение их генеза способствуют дифференцированному подходу к лечению и принятию мер социальной защиты больного.

Материалы для контроля за усвоением темы:

Тестовый контроль:

  1. В тромбоцитах в наибольших количествах синтезируется:

  1. Простациклин.

  2. Тромбоксан.

  3. Протеин С.

  4. Фактор VII.

  5. Протромбин.

2. Для выявления тромбоцитопении необходимо исследовать:

  1. Адгезивно-агрегационную функцию тромбоцитов.

  2. Количество тромбоцитов.

  3. Фибриноген.

  4. Тромбиновое время.

3. Для выявления тромбоцитопатии необходимо исследовать:

  1. Агрегационную функцию тромбоцитов.

  2. Адгезивную функцию тромбоцитов.

  3. Фактор 3 тромбоцитов.

  4. Время кровотечения.

  5. Все перечисленное.

Ответы: 1-2; 2-2; 3-5.

Задания для самоподготовки и УИРС:

  1. Мегакариоцитопоэз.

  2. Морфологическая и функциональная характеристика тромбоцитов.

  3. Способы определения количества тромбоцитов.

  4. Агрегатометрия.

  5. Тромбоцитопении, этиология, патогенез, клинико-лабораторные показатели крови, костного мозга.

  6. Тромбоцитопатии, классификация, этиопатогенез, клиника, лабораторные показатели крови, костного мозга, агрегатограмм.

  7. Тромбоцитоз, этиопатогенез, клинико-лабораторная диагностика, эссенциальная тромбоцитемия.

  8. УИРС: Наследственные тромбоцитопатии.

Литература:

Основная

  1. Справочник по клиническим лабораторным методам исследования (под ред. Е.А. Кост). – М.: «Медицина», 1968. – с.80-88.

  2. Л.В. Козловская, М.А. Мартынова Учебное пособие по клиническим лабораторным методам исследования – М.: «Медицина», 1975. – с.28-31, 65-68.

  3. Исследование системы крови в клинической практике (под ред. Г.И. Козинца и В.А. Макарова). – М.: Триада – Х, 1997. – с.106-112.

  4. Фред Дж. Шиффман Патофизиология крови – М. – СПб.: «Издательство БИНОМ» – «Невский Диалект», 2000. – с.149-190

Дополнительная

  1. Гольдберг Е.Д. Справочник по гематологии с атласом микрофотограмм. Томск: Изд-во Том. Ун-та, 1989. – 468 с.

  2. Вуд М., Банн П. Секреты гематологии и онкологии. – М.: «Издательство Бином», 1997. –560 с.