Добавил:
ilirea@mail.ru Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз: Предмет: Файл:
шпора.doc
Скачиваний:
70
Добавлен:
23.08.2018
Размер:
121.34 Кб
Скачать

Цитохимические исследования лейкоцитов

Цитохимические исследования проводят в

мазках крови, лейкоконцентрата; они основаны

на использовании специфических химических

реакций для определения в клетках различных

веществ. Эти исследования позволяют изучать

локализацию и ориентировочно оценивать коли-

чество определяемых веществ в различных кле-

точных элементах. Цитохимические исследова-

ния относительно несложны, дают возможность

исследовать различные виды лейкоцитов, но ус-

тупают в точности количественному анализу,

проводимому с помощью биохимических мето-

дов.

При цитохимическом исследовании чаще

пользуются полуколичественной оценкой резуль-

татов, используя принцип Астальди, основан-

ный на выявлении различной степени интенсив-

ности специфической окраски. В зависимости

от нее исследуемые элементы делят на 4 группы:

с отрицательной реакцией (—), слабоположи-

тельной ( + ), положительной (+ +) и резко

положительной ( + + + ). Для количественного

выражения результатов подсчитывают 100 кле-

ток определенного вида, дифференцируя их по

указанному принципу, затем число клеток с оди-

наковой интенсивностью окраски умножают на

соответствующее данной группе число плюсов,

сумма этих произведений составляет условные

единицы. Например, при исследовании активно-

сти щелочной фосфатазы в нейтрофилах из 100

просмотренных клеток в 60 клетках активность

фермента не выявлена (—), в 35—специфи-

ческая окраска была слабой ( + ) и в 5— более

интенсивной ( + + ). Результат определения ак-

тивности щелочной фосфатазы в нейтрофилах

в таком случае составит (60 ХО)+(35 X 1) +

+(5 X 2) = 0 + 35+ 10 = 45 ед. Можно выразить

результат в виде среднего цитохимического по-

казателя по L. Kaplow (1955) или среднего

цитохимического коэффициента (СЦК). С этой

целью также дифференцируют 100 исследуемых

клеток по указанной выше системе. Полученный

процент клеток в каждой группе умножают на

соответствующее данной группе число плюсов.

Сумма этих величин, деленная на 100, пред-

ставляет собой СЦК для одной клетки. В ука-

занном примере СЦК щелочной фосфатазы ней-

трофилов равен 0,45. В тех случаях, когда изуча-

емые вещества локализуются в клетках в виде

единичных гранул (например, активность не-

специфической эстеразы в лимфоцитах и др.),

результат цитохимической реакции целесооб-

разно выражать в процентах клеток, дающих

положительную реакцию.

Метод полуколичественйой оценки является

ориентировочным, но позволяет сравнивать рас-

пределение исследуемых веществ в разных кле-

точных элементах или в одних и тех же клетках

при различных патологических состояниях ор-

ганизма, а также в зависимости от течения забо-

левания, степени его тяжести и в связи с прово-

димой терапией.

Наиболее распространены цитоэнзиматичес-

кие исследования, дающие возможность выя-

вить в клетках активность различных ферментов.

Для этого чаще используют методы азосочета-

ния, в которых специфический субстрат, взаимо-

действуя с ферментом, образует продукт реак-

ции, который окрашивается солями диазония;

по окраске судят о локализации фермента и его

активности.

В настоящей главе приведены наиболее рас-

пространенные в клинической практике цитохи-

мические методы исследования.

ЩЕЛОЧНАЯ ФОСФАТАЗА (К. Ф. 3.1.3.1.)

содержится преимущественно в зрелых нейтро-

фильных лейкоцитах; активность фермента свя-

зывают со вторичными (специфическими) гра-

нулами цитоплазмы. Относится к группе гидро-

литических ферментов с оптимумом действия

при рН 9,6, осуществляет гидролиз однозаме-

щенных эфиров ортофосфата. Наиболее распро-

странено определение активности фермента ме-

тодами азосочетания.

Метод азосочетания по Кеплоу. П р и н ц и п .

Расщепление щелочной фосфатазой а-нафтил-

фосфата с освобождением а-нафтола, образу-

ющего с солями диазония нерастворимый окра-

шенный в коричневый цвет осадок в местах

локализации фермента.

Р е а к т и в ы . 1. 10% раствор формалина

в абсолютном метаноле. 2. 0,05 М раствор про-

пандиолового буфера (рН 9,75); готовят основ-

ной 0,2 М раствор (10,5 г 2-амино-2-метил-1,3-

пропандиола растворяют в 500 мл дистиллиро-

ванной воды), хранят его в холодильнике. Из

основного раствора готовят 0,05 М раствор

(25 мл основного раствора буфера смешивают

с 5 мл 0,1 н. раствора НС1 и доводят дистиллированной водой до 100 мл), хранят в холодильнике. 3. а-Нафтилфосфат. Можно использовать

нафтол-АS-Фосфат, нафтол-АS-ТR-фосфат или

нафтол-АS-В1-фосфат. 4. Прочный синий RR;

можно использовать отечественные красители

диазоль синий 2С и диазоль синий 0. 5. 2 %

раствор метилового зеленого. 6. Инкубационная

среда (готовят перед употреблением): 35 мг

а-нафтилфосфата, 35 мг прочного синего RR,