66. Подсчет общего количества эритроцитов. Количество эритроцитов в норме у разных видов животных. Подсчет общего количества эритроцитов

Объект исследования – кровь животных.

Материалы и оборудование – микроскоп, пробирки, камера Горяева, покровные стекла, эритроцитарный меланжер, пипетка от гемометра Сали, капилляры на 2 мл, 0,9-2%-ный раствор натрия хлорида, 70%-ный спирт, вата, бинт.

Ход работы. 1. Подготовка камеры Горяева к работе. Камера представляет собой толстое предметное стекло с четырьмя поперечными желобками, между которыми расположены три полосы. Средняя полоса на 0,1 мм ниже боковых и разделена продольным желобком на две равные половины, на каждой из которых выгравирована сетка Горяева. Когда камеру готовят к работе, еѐ и покровное стекло тщательно протирают спирт-эфиром, а затем на поперечные полосы камеры кладут покровное стекло и притирают его до образования интерференционных цветных кругов («кольца Ньютона»), над средней полосой остается щелевидное пространство (камера) высотой 0,1 мм (рис. 4).

Площадь камеры 9 мм2 (3x3 мм); сетка Горяева состоит из 225 больших квадратов, 25 из них разделены на 16 маленьких квадратиков. Площадь маленького квадратика составляет 1/400 мм2 (1/20х 1,20 мм), а объем камеры над ними 1/4000 мкл (1/400 мм2 х 1,10 мм).

Рис. 4. Счетная камера Горяева и

смеситель для эритроцитов:

А – вид камеры сверху;

Б – вид камеры сбоку;

В – сетка камерв;

Г – эритроцитарный меланжер.

2. Приготовление рабочего раствора. Чтобы подсчитать клетки, кровь разводят жидкостью - разбавителем. Используют эритроцитарный меланжер (смеситель) или чаще пробирку (пробирочный метод по Н. М. Николаеву, 1954).

В меланжер сначала набирают кровь до метки «0,5», кончик капилляра протирают ваткой, а затем до метки «101» - разбавляющую жидкость, которая представляет собой 0,85%-ный или 2%-ный раствор 21

хлорида натрия. Меланжер закрывают с обеих сторон большим и указательным пальцами и встряхивают 1...2мин. В данном случае получается разведение 1:200. Из меланжера вначале удаляют на ватку первые 3 капли разведенной крови, а следующей заряжают камеру - наносят каплю на среднюю полоску камеры у края притертого покровного стекла. Капля попадает под стекло в щелевидное пространство и заполняет камеру.

В пробирку сначала вносят 4 мл 0,85%-ного или 2%-ного раствора хлорида натрия, а затем добавляют 0,02 мл крови пипеткой от гемометра Сали и смешивают. Пастеровской пипеткой набирают разбавленную кровь (разведение 1:200) и заряжают счетную камеру.

3. Техника подсчета эритроцитов. Эритроциты подсчитывают через 2...3 мин после заполнения камеры под микроскопом (объектив х8, окуляр х15) при затемненном поле (прикрывают диафрагму или опускают конденсор) в левом верхнем большом квадрате (разделенном на 16 маленьких квадратиков), а затем еще в 4 больших квадратах, расположенных по диагонали или по краям сетки в 4 квадратах и одном в центре (всего в 5 больших квадратах).

Подсчет клеток в большом квадрате начинают с левого верхнего маленького квадратика и продолжают во втором, третьем и четвертом квадратиках, расположенных справа от первого (рис. 5). Подсчитав эритроциты в верхнем ряду, переходят на нижерасположенный ряд, начиная считать в первом правом квадратике, и т. д. Подсчитывают все эритроциты, которые лежат внутри маленьких квадратиков, а также на верхней и левой сторонах большого квадрата; клетки, расположенные на нижней и правой сторонах, не учитывают.

Рис. 5. Схема подсчета эритроцитов в

большом квадрате счетной

камеры Горяева.

Количество эритроцитов определяют по формуле:

Х = ( Н 4000 200 ) / 80 = Н 10 000 , где

Х - количество эритроцитов в 1 мм3 крови; Н – количество подсчитанных эритроцитов в 5 больших квадратах; 4000 – множитель перевода к объѐму в 1 22

мкл крови; 200 - разведение крови; 80 - число маленьких квадратиков в 5 больших квадратах (16 х 5 = 80).

Количество эритроцитов в 1 мм3 крови составляет, например у коровы 5-7,5 миллионов, или 5-7,5 млн/мм3, что в международной системе СИ соответствует 5-7,51012/л (эритроцитов на литр).

В норме содержание форменных элементов крови (не только эритроцитов, но и лейкоцитов, тромбоцитов) в единице объѐма постоянно для конкретного вида животных. Оно может колебаться в зависимости от физиологического состояния, возраста, пола, условий окружающей среды, но в пределах физиологической нормы. Значительное снижение или повышение количества форменных элементов свидетельствует о патологических изменениях в организме, что может быть следствием воспаления, травмы, новообразования или инфекционного процесса.

67. Подсчета общего количества лейкоцитов. Количество лейкоцитов в норме у разных видов животных. Материалы и оборудование – микроскоп, пробирки, камера Горяева, покровные стекла, лейкоцитарный меланжер, пипетка от гемометра Сали, капилляры на 1 мл, жидкость Тюрка, 70%-ный спирт, вата, бинт. Ход работы. 1. Подготовка камеры Горяева к работе. Камера Горяева готовится к работе так же, как описано в лабораторной работе 5. (Подготовка камеры Горяева к работе. Камера представляет собой толстое предметное стекло с четырьмя поперечными желобками, между которыми расположены три полосы. Средняя полоса на 0,1 мм ниже боковых и разделена продольным желобком на две равные половины, на каждой из которых выгравирована сетка Горяева. Когда камеру готовят к работе, еѐ и покровное стекло тщательно протирают спирт-эфиром, а затем на поперечные полосы камеры кладут покровное стекло и притирают его до образования интерференционных цветных кругов («кольца Ньютона»), над средней полосой остается щелевидное пространство (камера) высотой 0,1 мм (рис. 4). Площадь камеры 9 мм2 (3x3 мм); сетка Горяева состоит из 225 больших квадратов, 25 из них разделены на 16 маленьких квадратиков. Площадь маленького квадратика составляет 1/400 мм2 (1/20х 1,20 мм), а объем камеры над ними 1/4000 мкл (1/400 мм2 х 1,10 мм).)

Рис. 4. Счетная камера Горяева и

смеситель для эритроцитов:

А – вид камеры сверху;

Б – вид камеры сбоку;

В – сетка камерв;

Г – эритроцитарный меланжер.

2. Приготовление рабочего раствора. В меланжер набирают кровь до метки «0,5», а затем до метки «11» - жидкость Тюрка (3%-й раствор уксусной кислоты - 100 мл, 1%-й раствор генциана фиолетового или метиленового синего - 1 мл). Встряхивают 1...2 мин. Уксусная кислота гемолизирует эритроциты, а генциан фиолетовый или метиленовый синий окрашивают лейкоциты. Получают разведение 1:20. Далее выпускают 3 капли на ватку (или фильтровальную бумагу), а следующей каплей заряжают счетную камеру.

В пробирку вносят 0,4 мл жидкости Тюрка и 0,02 мл крови, которую набирают пипеткой от гемометра Сали (разведение 1:20); тщательно перемешивают. Смесь отбирают пастеровской пипеткой и заряжают счетную камеру. Через 2...3 мин, когда лейкоциты осядут на дно камеры, начинают подсчитывать клетки под микроскопом (объектив х8, окуляр х15) при затемненном поле.

3. Техника подсчета лейкоцитов. Лейкоциты считают в 100 больших квадратах (условно 1600 маленьких), не имеющих дополнительных линий и расположенных по всей площади сетки Горяева группами по четыре квадрата. В сетке Горяева хорошо видны линии, в каждой находится пять 23

больших квадратов, состоящих из четырех малых квадратиков, поэтому в одной линии всего 20 квадратиков. Таких линий тоже пять, что в сумме составит 100 маленьких квадратиков или 50 больших квадратов. Когда все лейкоциты в пяти линиях подсчитаны, находят их сумму. Расчет общего количества лейкоцитов проводят по формуле:

Х = ( Н 4000 20 ) / 1600 = Н 50 , где

X - количество лейкоцитов в 1 мкл крови; Н - количество лейкоцитов, подсчитанных в 100 больших квадратах; 4000 - множитель перевода к объему в 1 мкл крови; 20 - разведение крови; 1600 - количество малых квадратов.

Количество лейкоцитов в 1 мм3 крови составляет, например у лошади 7-12 тысяч, или 7-12 тыс/мм3, что в международной системе СИ соответствует 7-12109/л (лейкоцитов на литр).

Результаты и их оформление. Запишите полученные результаты в тетрадь, сравните их с нормой, сделайте вывод.