Брянский государственный университет им. И.Г. Петровского

Естественно-географический факультет

Кафедра ботаники

Заякин В.В., Нам И.Я.

Генетическая и клеточная инженерия

Методическое пособие для лабораторно-практических занятий по курсу «Введение в биотехнологию»

Брянск

2010

Целью данного пособия является помощь студентам в практическом освоении методов и приемов клонирования генов в плазмидных векторах, электрофоретического анализа нуклеиновых кислот, проведения ПЦР, а также ознакомление с теоретическими основами этих методов.

Термины, выделенные подчеркнутым шрифтом, кратко поясняются в тексте и предназначены для запоминания студентами. В конце темы даны задания для самостоятельной работы и самопроверки.

В конце методических указаний приводится список использованных биологических терминов и рекомендуемая литература.

Рецензенты: Заведующая кафедрой биотехнологии Орловского государственного аграрного университета, доктор биологических наук, профессор Павловская Н. Е.

Профессор кафедры ботаники БГУ им. акад. И. Г. Петровского, доктор сельскохозяйственных наук Кононов А. С.

Рекомендовано к печати Ученым Советом ЕГФ БГУ 23 Декабря 2010 г., протокол №7

Содержание

Тема: Основы клонирования генов с помощью плазмидных генетических векторов 2

Работа 1. Выделение плазмидной ДНК из бактериальных клеток 5

Работа 2.Трансформация E. Coli плазмидными векторами 7

Работа 3.Рестрикция векторной и клонируемой ДНК 14

Тема: Основные принципы создания искусственных рекомбинантных генетических конструкций 19

Работа 4. Получение бактериальных клонов, трансформи- рованных рекомбинантной ДНК 24

Работа 5. Рестрикционный анализ рекомбинантных плазмид с помощью электрофореза 30

Работа 6 Скрининг и анализ рекомбинантных клонов с помощью ПЦР 34

Тема: Генетическая инженерия растений. 41

Работа 7. Получение трансгенных растений малины, несущих ген npt II, кодирующий признак устойчивости к канамицину. 43

Список использованных терминов 45 Рекомендуемая литература 46

2

Тема: Основы клонирования генов с помощью плазмидных генетических векторов

Клонированием генов обычно называют процесс получения бактериальных клонов, содержащих вставки чужеродного генетического материала в составе искусственных рекомбинантных ДНК. Процесс является многостадийным и включает следующие основные этапы:

•Выделение векторной ДНК, например, плазмидной

•Получение фрагментов клонируемой ДНК длиной от нескольких десятков до 5-10 тыс. пар нуклеотидов (при клонировании в плазмиды)

•Подготовка векторных молекул, обычно включающая специфическое расщепление ДНК рестриктазами

•Вставка фрагментов ДНК в векторные молекулы (плазмиды, фаги, минихромосомы) – создание генетических конструкций для трансформации

•Трансформация бактерий, то есть стабильное введение генетической информации

•Скрининг клонов и их изучение

В ходе исследовательской работы часто приходится осуществлять субклонирование и переклонирование ДНК в другие вектора, создавать новые генетические конструкции.

Для манипулирования молекулами ДНК в ходе клонирования необходимы специальные молекулярные инструменты, позволяющие разрезать и сшивать ДНК в нужных местах, вносить необходимые изменения, достраивать комплементарные цепи и так далее. Такими инструментами являются ферменты. Наиболее часто употребляются разные нуклеазы, прежде всего рестриктазы, а так же полимеразы, лигазы, фосфатазы, полинуклеотидтрансферазы, киназы и другие.

3

Работа 1. Выделение плазмидной ДНК из бактериальных клеток

Для выделения плазмидной ДНК пользуются многими методами. Все они включают три основных этапа: выращивание бактерий и амплификацию плазмиды; сбор бактерий и их лизис, очистку плазмидной ДНК.

В методах очистки плазмидной ДНК, так или иначе, используют два основных различия между ДНК Escherichia coli и плазмидной ДНК: 1) хромосома Е. coli по размеру много больше ДНК плазмид, обычно используемых в качестве векторов; 2) основная масса ДНК E. coli выделяется из клеток в виде фрагментированных линейных молекул, тогда как большая часть плазмидной ДНК экстрагируется в виде ковалентно замкнутых кольцевых молекул.

Поэтому большинство методов очистки включают осаждения, при которых из препарата удаляются преимущественно длинные цепи ДНК E. coli, случайно захваченные обломками лизированных клеток. Методики эти основаны также на использовании свойств кольцевой замкнутой ДНК. Каждая из комплементарных цепей плазмидной ДНК представляет собой ковалентно замкнутое кольцо, поэтому цепи нельзя отделить друг от друга (не разорвав одну из них) в тех условиях, при которых происходит разрыв большинства водородных связей в ДНК, например при нагревании или при выдерживании в умеренно щелочных растворах (до рН 12,5). При охлаждении или возвращении к нейтральному рН замкнутые кольцевые молекулы вновь принимают нативную конформацию, тогда как ДНК Е. coli остается денатурированной.

Плазмидная ДНК ведет себя отлично от ДНК Е. coli также и при равновесном центрифугировании в градиентах хлористого цезия, содержащих какой-нибудь интеркалирующий краситель в насыщающей концентрации,

4

например, бромистый этидий или дийодистый пропидий. Ковалентно замкнутые кольцевые ДНК связывают меньше такого красителя, чем линейная ДНК и потому в градиентах хлористого цезия, содержащих интеркалирующий агент, оказываются в зонах с более высокой плотностью. Эту методику используют, если необходима высокая степень очистки плазмидной ДНК. Однако по мере развития методов работы с рекомбинантными ДНК для многих целей оказалось уже необязательным проводить очистку больших количеств плазмидной ДНК до такой степени, чтобы препарат был гомогенным. Например, расщепление рестриктирующими эндонуклеазами, лигирование, трансформация и даже секвенирование ДНК можно проводить теперь, используя относительно малоочищенные препараты плазмидной ДНК, полученные из небольших объемов культуры (около 10 мл). Плазмидную ДНК выделяют из больших объемов культуры лишь в тех случаях, когда нужны значительные ее количества (например, в опытах по гибридизации для отбора специфических мРНК или когда нужно пометить 5'-концы фрагментов ДНК с помощью полинуклеотидкиназы).

Описанные ниже методики можно успешно использовать для выделения разнообразных плазмид из различных штаммов бактерий. Вообще говоря, чем меньше плазмида, тем лучше достигаемые результаты. С увеличением молекулярной массы плазмиды ее свойства становятся все ближе к свойствам ДНК хозяина. Выделение плазмид, размер которых превышает 25 kb, сильно затрудняется и выход оказывается невысоким. Однако все плазмиды, обычно используемые при клонировании, относительно невелики и приведенные ниже методы дают хорошие результаты.

Обеспечение работы

• Оборудование: ламинар-бокс; суховоздушная качалка 5

5

(37°С); суховоздушный термостат (37°С); центрифуга типа «Эппендорф»; шейкер; вортекс; автоматические пипетки на 2—20 мкл и 200—1000 мкл; наконечники для на 200 мкл и на 1000 мкл; центрифужные пробирки на 2 мл и на 1,5 мл; стеклянные палочки для засева колоний; лед.

• Реактивы: спирт 70 и 96%; спирт для стерилизации ламинар бокса; лизирующий буфер (0,2 М NaOH — 1% SDS); нейтрализующий буфер 3 М КАс, рН 4,8);

• Среды: среда LB жидкая.

• Биологический материал:

Лабораторный штамм кишечной палочки (E.coli), содержащий плазмиду с ослабленным контролем и селективными генами устойчивости к антибиотикам или колонии трансформированных бактерий, содержащие рекомбинантные плазмиды.

Лизирующий буфер желательно готовить непосредственно перед использованием.

Нейтрализующий буфер готовят следующим образом: к 60 мл 5 М ацетата калия добавить 11,5 мл ледяной уксусной кислоты и 28,5 мл воды. Концентрация калия в растворе — 3 М, а концентрация ацетата — 5 М.

Ход работы

Выращивание бактериальной культуры и амплификация плазмиды. Используют отобранные колонии бактерий или чистые культуры лабораторных штаммов, содержащие плазмиды и жидкую питательную среду. Работа проводится стерильно, желательно с использованием ламинарного шкафа.

1. Жидкую среду LB, содержащую 100 мкг/мл ампицилина, разливают в 4 стерильные стеклянные пробирки. Засевают в каждую пробирку по одной белой колонии, образовавшейся при трансформации клеток лигазной смесью. Колонию с агара

6

снимают либо стерильной бактериальной петлей, либо стеклянной стерильной палочкой, либо стерильным наконечником.

2. Клетки выращивают в течение ночи (16—18 ч) в термостатируемой качалке при 37°С и скорости качания 160 — 200 об/мин. Из выросших бактериальных культур выделяют плазмиды.

Выделение плазмид из бактерий. Выделение плазмид осуществляется нестерильно, но с соблюдением необходимой чистоты посуды и реактивов.

1. Центрифугируют ночную культуру 1 мин при 12 тыс. об/мин. В одну пробирку на 1,5 мл надо осадить все 3 мл культуры двукратным центрифугированием.

2. Осадок суспендируют в 300 мкл дистиллированной воды.

3. Добавляют к 300 мкл суспензии клеток 300 мкл лизирующего буфера и плавными движениями перемешивают 5 раз (не трясти!). При лизисе суспензия делается светлее, а затем становится густой за счет выхода ДНК в раствор — это очень хорошо видно. Время лизиса в этих условиях не должно превышать 5 мин.

4. Раствор нейтрализуют добавлением 300 мкл 3 М ацетата калия, рН 4,8, и деликатно перемешивают. Для формирования осадка дают постоять во льду 10 мин. Перед центрифугированием еще раз перемешивают и центрифугируют 10 мин при 12 тыс. об/мин. Бактериальная ДНК и обломки клеток образуют на дне плотный осадок. Плазмида остается в супернатанте.

5. Аккуратно отбирают 750 мкл супернатанта и переносят в другую пробирку. Добавляют туда же равный объем 96%-го спирта, перемешивают и тут же центрифугируют 10 мин при 12 тыс. об/мин. В этих условиях осаждаются преимущественно плазмида и клеточная РНК.

6. Супернатант отбрасывают, осадок промывают 0,5 мл 70%-го

7

спирта (осадок заливают, ополаскивают, покачивая пробирку и сразу же центрифугируют 5 мин при 12 тыс. об/мин).

7. Спирт полностью удаляют. Осадок подсушивают 15—20 мин при комнатной температуре и растворяют в 50 мкл воды.

Выделенная таким образом плазмида загрязнена солями и РНК. Наличие большого количества солей отрицательно влияет на активность рестриктаз. Плохо очищенная плазмида может не порезаться или не полностью порезаться (что иногда очень важно). Соли влияют на подвижность плазмиды в агарозном геле и мешают правильно оценить ее размер.

РНК часто мешает увидеть полученные при рестрикции фрагменты, поэтому при выделении плазмиды в больших количествах или для важных целей ее подвергают дополнительной очистке. Для того, чтобы просто посмотреть, есть ли вставка в плазмиде, можно ее не чистить. Достаточно хорошо промыть осадок после осаждения спиртом и рестрикцию проводить в присутствии РНК-азы.

Анализ выделенной ДНК проводится с помощью электрофореза в агарозном геле.

Работа 2.

ТРАНСФОРМАЦИЯ E. Coli ПЛАЗМИДНЫМИ ВЕКТОРАМИ

Перенос новой генетической информации в бактериальные может приводить к появлению генетически и фенотипически измененных (трансформированных) бактериальных клеток. Сам процесс переноса может осуществляться разными способами: перенос с помощью специфического F – фактора (полового или конъюгативного фактора бактерий) называется конъюгацией и сопровождается образованием конъюгативных мостиков из F-пилей и последующей рекомбинацией; перенос фрагментов хозяйской ДНК в клетки новых хозяев с помощью лизогенных бактериофагов называется трансдукцией; прямое поглощение ДНК из раствора бактериальной клеткой с последующей рекомбинацией или без нее

8

называется трансфекцией. В биотехнологии обычно используются трансдукция и трансфекция, но чаще всего различные варианты прямого введения ДНК из раствора, то есть трансфекция.

Само явление трансформации (путем трансфекции ДНК из раствора) наблюдал еще Ф. Гриффитс в 1928 г. при восстановлении вирулентности бескапсульного штамма пневмококка при его обработке препаратами убитого капсульного штамма. Но объяснение этих результатов было дано только в 1944 г. в исследованиях О. Эвери, К. Мак-Леода и М.Мак-Карти. Собственно говоря, эти опыты явились важнейшим доказательством того, что именно ДНК является носителем генетической информации.

В этих опытах частота трансформации и эффективность переноса генетической информации таким способом были чрезвычайно низкими. Впоследствии были изучены условия влияющие на трансформацию, появилось понятие компетентных клеток, то есть обладающих повышенной способностью к поглощению ДНК и трансформации после специальных обработок. В результате были разработаны высокоэффективные методы введения ДНК в бактериальные клетки.

В 1970 г. Мандель и Хига показали, что совместная инкубация Е. coli и ДНК фага λ при 0°С в присутствии СаС1₂ ведет к инфекции (в действительности — к трансфекции). Изучение этого феномена привело к представлению о том, что клетки Е. coli и чужеродная ДНК продуктивно взаимодействуют при двух основных условиях — низкой температуре и наличии в среде двухвалентных катионов. Эффективность трансформации можно повысить многочисленными способами:

• обрабатывая клетки растворителями и сульфгидрильными агентами;

• выращивая клетки в среде с повышенным содержанием Mg²⁺ (10-20 мМ);

• тепловым шоком;

• введением моновалентных катионов;

• добавлением хлорида гексаминокобальта;

• добавлением диметилсульфоксида;

• добавлением иона Rb⁺.

9

Существуют десятки способов получения клеток, готовых для трансформации, — компетентных клеток. Простейшие из них - кальциевые. Для их получения засевают в бульон ночную культуру, выращивают до среднелогарифмической фазы, охлаждают, суспендируют в холодном буфере, содержащем 50 мМ СаС1₂, выдерживают во льду, осаждают и суспендируют в том же буфере, но уже с высокой плотностью. Кальциевые клетки хранят в холодильнике (во льду) несколько дней (до двух недель). Другие методы позволяют готовить замороженные клетки и хранить их несколько месяцев при —70°С.

Доля собственно компетентных клеток (клеток, способных трансформироваться) составляет 0,01—10% от общего числа жизнеспособных клеток. Для нормальной работы их должно быть не менее 5%.

Частоту трансформации определяют по стандартной ДНК, добавляемой в количествах, значительно меньших, чем насыщающие. Выражают частоту трансформации в количестве колониеобразующих единиц на 1 мкг ДНК. В трансформации участвует от 1 из 10⁵ до 1 из 10² молекул ДНК.

Обычно используют 0,01—0,1 мкг ДНК на пробу. Увеличение количества ДНК с какого-то момента не приводит к увеличению эффективности трансформации.

Большинство методик получения компетентных клеток Е. coli обеспечивает перенос ДНК размером 10—15 тыс. пар оснований. Использование ДНК большей длины приводит к резкому снижению эффективности трансформации. Большинство плазмид, в которых осуществляется субклонирование, имеет размер около 3—4 тыс. пар оснований. Сейчас, однако, получены штаммы Е. coli (DH5, DH5а), которые можно трансформировать большими

10

плазмидами — 40—60 тыс. пар оснований, или для этих целей используют в качестве вектора фаг λ либо космиды.

В зависимости от плазмиды и целей работы следует очень тщательно выбирать штамм клеток, используемых для трансформации. Кроме того, что он должен хорошо расти, хорошо трансформироваться и вообще быть удобным в работе, важно воспринимать генотип клетки как существенный элемент генетической конструкции.

Характеристики штаммов, которые нужно учитывать, касаются систем рестрикции и модификации (гены hsd P_, hsd M, hsd S), репарации и рекомбинации (гены rеc А, rеc В, rеc С, sbs В, rec F, rеc К, rec E_, uvr A, uvr B_, uvr С, uvr E, dam), наличия полового фактора F, супрессирующих мутаций, лизогенного фага, маркерных генов, других плазмид и т.д.

Так, например, для трансформации обычно используют штаммы, дефектные по рестрикции, иначе возможно разрушение попавшей в клетку чужеродной ДНК; повторяющиеся последовательности и палиндромы очень трудно размножать в клетках Rec⁺, а ген dam важен при направленном мутагенезе в векторах на основе фага М13.

F-фактор — это эписома, которая может быть свободной (F') или интегрированной (штамм Hfr). F-фактор определяет возможность конъюгации (переноса бактериальной хромосомы) у бактерий и образование F-пилей на поверхности клеток. Фаг М13 может инфицировать Е. coli только в том случае, если у них есть F-пили. В современных конструкциях F-фактор может нести значимые для генноинженерных манипуляций гены, например ген lacZ (с делецией или без нее) и ген lac /, кодирующий белок-репрессор лактозного оперона Е. coli.

В данной задаче для трансформации используются клетки JM-109, генотип которых выглядит так:

recA1 supE44 endA1 hsdR17 gyrA96 relA1 thi(lac-proAB) F[traD36 proAB⁺] lacI^q lacZ M15

11

Обеспечение работы

• Оборудование: ламинар-бокс; суховоздушная качалка (37°С); суховоздушный термостат (37°С); термостат (42°С); центрифуга типа «Эппендорф»; шейкер; вортекс; набор автоматических пипеток (дозаторов) на 2—20 мкл и 200—1000 мкл; чашки Петри; бакпечатки; наконечники для дозаторов на 200 мкл и на 1000 мкл; центрифужные пробирки на 2 мл и на 1,5 мл;; стеклянные палочки для засева колоний; стеклянные шпатели для растирания клеток по агару; лед; очки или экран для защиты от УФ-излучения; резиновые перчатки

• Реактивы: легкоплавкая агароза; тугоплавкая агароза; бульон LB, стерильный раствор 50 мМ СаС1₂+10 мМ трис-HCl, рН 8,0, антибиотики в зависимости от типа плазмиды и штамма бактерии; спирт 70 и 96%; спирт для стерилизации ламинар-бокса.

Ход работы

ТРАНСФОРМАЦИЯ С ПРИМЕНЕНИЕМ ХЛОРИСТОГО КАЛЬЦИЯ

Этот способ трансформации бактерий плазмидной ДНК применяется наиболее часто. Выход трансформантов составляет 10⁵—10⁷ на 1 мкг интактной ДНК и зависит от типа плазмиды и штамма Е. coli.

I. Внесите в 500-мл колбу 100 мл бульона LB и 1 мл ночной культуры бактерий. Выращивайте клетки при 37°С с интенсивным перемешиванием до плотности — 5-10⁷ клеток/мл. Обычно это занимает 2—4 ч. Для одной пробы на трансформацию требуется 3 мл клеток.

Примечание. Соотношение между оптической плотностью и числом жизнеспособных бактерий в 1 мл культуры варьирует от штамма к штамму. Например, для штаммов rес+ (Х1776,

12

ММ284) концентрации 5-10⁷ клеток/мл соответствует D₅₅₀=2, а для штаммов rec~ (DH1, НВ101) концентрации 5-10⁷ клеток/мл соответствует D₅₅₀ = 0,5 или, по другим источникам, D₆₀₀ = 1,0 соответствует 8х10⁸ клеток/мл.. Калибровочную кривую зависимости D₅₅₀ от числа бактерий в 1 мл культуры следует строить для каждого нового штамма Е. coli, применяемого в работе.

2. Охладите культуру во льду (10 мин). Отцентрифугируйте суспензию клеток при 4000 g в течение 5 мин при 4°С.

3.Удалите надосадочную жидкость. Ресуспендируйте клетки в половине начального объема охлажденного во льду стерильного раствора 50 мМ СаС1₂+10 мМ Трис-HCl, рН 8,0.

4. Поместите суспензию клеток в ледяную баню на 15 мин, а затем отцентрифугируйте суспензию .при 4000 g- в течение 5 мин при 4^о.

5. Удалите надосадочную жидкость. Ресуспендируйте клетки 1\15 начального объема охлажденного во льду стерильного раствора 50 мМ СаС1₂+10 мМ Трис-HCl, рН 8,0 Распределите аликвоты объемом 0,2 мл по предварительно охлажденным пробиркам Клетки можно хранить при 4°С 12—24 ч. Для максимальной эффективности трансформации важно: 1) чтобы бактерии находились в логарифмической фазе роста и чтобы во время обработки хлористым кальцием плотность суспензии была низкой; 2) чтобы клетки выдерживались при 4°С 12-24 ч. За это время эффективность трансформации возрастает в 4—6 раз. Через 48 ч она снизится до первоначального уровня.

6. Добавьте ДНК в буфере, применяемом для реакции с лигазами (лигазный буфер), или в буфере ТЕ. Размешайте и инкубируйте смесь во льду 30 мин. Для каждой пробы можно брать до 40 нг ДНК (соответственно 100 мкл лигазного буфера или буфера ТЕ). Увеличение количества

13

ДНК или объема буфера приводит к снижению эффективности трансформации.

7. Перенесите пробы в водяную баню (42 °С) на 2 мин.

8. Добавьте в каждую пробирку по 1,0 мл бульона LB и инкубируйте 30 мин при 37 °С (при тетрациклиновой селекции) или 1 ч (при ампициллиновой или канамициновой селекции), без качания. За это время в бактериях пройдет процесс восстановления и начнется экспрессия генов устойчивости к антибиотикам.

9. Высейте удобное количество клеток на плотную селективную среду, используя методику растирания (распределения) клеток шпателем или методику верхнего агара. В последнем случае трансформантов получается несколько больше.

Если селекцию ведут на устойчивость к тетрациклину, то трансформационную смесь можно целиком высеять в одну чашку. При селекции на устойчивость к ампициллину в чашку следует высевать только часть культуры (найденную эмпирически), так как число вырастающих трансформантов увеличивается не пропорционально высеваемому объему, возможно, из-за накопления в среде токсичных веществ, выделяемых убитыми антибиотиком клетками. Кроме того, при селекции на устойчивость к ампициллину плотность высеваемой суспензии должна быть низкой, а чашки нужно перенести через 16—24 ч из термостата в холодильник (4°С). Дело в том, что ампициллин разрушается β-лактамазой, секретируемой устойчивыми трансформантами, поэтому при густом засеве или длительной инкубации вокруг колоний трансформантов вырастут сателлитные колонии, сформированные чувствительными к антибиотику клетками.