Плазмиды
Внехромосомные кольцевые двуспиральные малые молекулы ДНК, длиной в 1-1000 тысяч пар нуклеотидов автономно размножающиеся в бактериальной клетке. Количество идентичных плазмид в клетке
изменяется от одной до нескольких тысяч.
Функции плазмид в клетке:
-перенос генетического материала при конъюгации — F-плазмида;
-плазмиды бактериоциногенности контролируют синтез белков, летальных для других бактерий — Col-плазмиды;
-устойчивость к тяжёлым металлам;
-устойчивость к антибиотикам (R-плазмиды);
-синтез энтеротоксинов — Ent-плазмиды;
-устойчивость к УФ-излучению;
-синтез антигенов, обеспечивающих адгезию бактерий на клетках в организме человека и животных — плазмиды антигенов колонизации;
-система рестрикции-модификации.
Генетическая карта плазмиды pBR322 (41 т.п.н.)
Открыта Боливаром Ф. и Родригесом Р.
Уже не используется коммерчески. Плазмида несет гены устойчивости к двум
антибиотикам: ампициллину (ген bla) и тетрациклину (ген tet), а также уникальные сайты для BamHI, EcoRV и SalI в гене Теt, один PstI- сайт в гене Bla, один сайт для EcoRI, находящийся за пределами кодирующих последовательностей, и сигнал начала репликации, обеспечивающий
репликацию исключительно в Е.coli.
Система рестрикции-модификации
-эндонуклеаза рестрикции и метилтрансфераза представляют собой отдельные ферменты, но в некоторых системах обе эти функции совмещены в одном мультисубъединичном белке.
-защиту обеспечивает метилирование или глюкозилирование оснований
ДНК, обычно аденина или цитозина. Этот процесс известен под названием
модификации.
Эндонуклеаза EcoRV в комплексе с расщепленным фрагментом ДНК.
Ферменты, позволяющие получать рекомбинантные молекулы ДНК
Высокоспецифичные ферменты, способные узнавать и расщеплять
(гидролизовать) ДНК в строго определенном месте, называются
рестрикционными эндонуклеазами или рестриктазами.
схема действия фермента рестриктазы EcoRI
С липкими концами |
|
(выступают 5’- концы) |
схема действия фермента рестриктазы SmaI |
|
С тупыми концами |
Для устранения разрыва после рекомбинации фрагментов ДНК используют другой фермент - ДНК-лигазу, катализирующий образование фосфодиэфирных связей между концами полинуклеотидных цепей, которые удерживаются вместе водородными связями при соединении липких концов. ДНК-лигаза сшивает и тупые концы.
Некоторые рестриктазы и расщепляемые ими последовательности
Типичный ферментативный гидролиз ДНК ведут в объеме 20 мкл, используя 0.1-1 мкг ДНК, 1 единицу фермента и буфер для его работы.
Единица активности фермента – количество рестриктазы, необходимое для полного расщепления 1мкг ДНК фага λ за 1 ч при рекомендованных условиях.
Состав буфера: Трис-HCl рН 7.5 10 мМ MgCl2
NaCl
1 мМ DТT
Дитиотреитол (DTT) добавляют в раствор белка для того чтобы поддерживать его SH группы в восстановленном состоянии
Электрофорез в агарозном (0,4-2,0%) геле
Электрофорез - это электрокинетическое явление перемещения частиц дисперсной фазы в жидкой или газообразной среде под действием внешнего электрического поля
Камера для горизонтального электрофореза 15х15 см
Напряженность поля 2-6 V/см
Определение размера фрагмента ДНК методом электрофореза
|
Бромистый этидий |
|
|
интерколятор |
|
• |
Используются маркеры размера |
|
|
||
|
– Это 2х цепочечные фрагменты ДНК |
|
|
известного размера |
|
|
– Расстояние пробега может быть |
pairs |
|
измерено прямо в геле с помощью |
|
|
линейки |
|
|
base |
|
|
– Или с помощью диаграммы |
|
• |
агарозном геле обратно пропорциональна |
Nucleotide |
Электрофоретическая подвижность ДНК в |
|
|
|
логарифму ее молекулярной массы |
|
|
|
|
Migration versus size
100000
10000
1000
100
0 |
2 |
4 |
6 |
8 |
Distance migrated in cm
Контроль реакции рестрикции ДНК методом электрофореза
Reaction Conditions:
1X NEBuffer 4
Incubate at 37°C.
1X NEBuffer 4:
20 mM Tris-acetate
50 mM potassium acetate
10 mM Magnesium Acetate
1 mM Dithiothreitol pH 7.9 @ 25°C
Полимеразная цепная реакция
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – это метод амплификации ДНК in vitro, с помощью которого в течение 2-3 часов можно размножить определенную последовательность ДНК (из одной-двух копий) в количестве, превышающем исходное в сотни миллионов раз.
•Амплификация (увеличение) - увеличение числа копий ДНК.
•In vivo, в клетке амплификация происходит в результате репликации ДНК,
•In vitro, в искусственных условиях увеличения числа копий ДНК добиваются с помощью полимеразной цепной реакции.
Полимеразная цепная реакция
Для проведения ПЦР в простейшем случае требуются следующие компоненты:
•ДНК-матрица, содержащая тот участок ДНК, который требуется амплифицировать.
Два праймера - олиго- или полидезоксирибонуклеотида со свободным 3’-ОН- концом, комплементарного противоположным концам разных цепей матричной
ДНК.
•Термостабильная ДНК-полимераза — фермент, который катализирует реакцию полимеризации ДНК. Полимераза для использования в ПЦР должна сохранять активность при высокой температуре длительное время, поэтому используют
ферменты, выделенные из термофилов — Thermus aquaticus (Taq-полимераза),
Pyrococcus furiosus (Pfu-полимераза), Pyrococcus woesei (Pwo-полимераза) и
другие.
•Дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (dATP, dGTP, dCTP, dTTP).
•Ионы Mg2+, необходимые для работы полимеразы.
•Праймеры - короткие синтетические олигонуклеотиды длиной 18 - 30 оснований. Каждый из праймеров комплементарен 3’-концевым последовательностям одной из цепей двухцепочечной матрицы и ограничивает начало и конец амплифицируемого участка.