16.Методы изучения ферментативной активности бактерий и использование ее для идентификации бактерий.

Ферменты – это высокоспециализированные белки, специфически катализирующие многочисленные химические реакции, происходящие в микробной клетке.

Классификация бактериальных ферментов:  По механизму действия:

 оксидоредуктазы катализируют окислительно-восстановительные реакции (перенос электронов);

 трансферазы катализируют реакции, идущие с переносом молекул или атомных группировок от одних соединений к другим;

 лиазы катализируют реакции негидролитического расщепления органических веществ, сопровождаемые отщеплением от них H2O, CO2 и NH3;

 гидролазы катализируют реакции гидролитического расщепления и синтеза органических веществ, идущие с участием H2O;

 изомеразы осуществляют внутримолекулярные перемещения радикалов и атомов, превращая органические соединения в их изомеры;

 лигазы катализируют реакции синтеза сложных органических соединений из простых.

 По локализации:

 экзоферменты – ферменты, выделяемые наружу, в окружающую среду; расщепляют сложные органические вещества до более простых молекул, которые способны проходить через ЦПМ;

 эндоферменты функционируют внутри клетки, осуществляя дальнейшее расщепление питательных веществ, а также участвуют в синтезе структур бактериальной клетки.

 По субстрату воздействия:  сахаролитические;  протеолитические;  липолитические.  По концентрации в окружающей среде:  конститутивные – это ферменты микроорганизов, всегда синтезирующиеся с постоянной скоростью и присутствующие в клетке в постоянных концентрациях

 индуцибельные – это ферменты, концентрация которых резко изменяется в зависимости от наличия или отсутствия в среде субстрата;

 репрессибельные – это ферменты, синтез которых подавляется в результате избыточного накопления продукта реакции, катализируемой данным ферментом.

Ферменты патогенности – это ферменты, субстратами для которых являются вещества, входящие в состав клеток и тканей макроорганизма, способствующие проникновению, распространению и размножению микроорганизмов, т.е. проявлению патогенных свойств (нейраминидаза, гиалуронидаза, коагулаза).

Методы изучения ферментативной активности. В бактериологической практике для идентификации бактерий определяют сахаролитическую и протеолитическую активность ферментов. Для определения сахаролитических ферментов используют среды с сахарами:

 среды Гисса (пестрый ряд):  жидкие – пептонная вода, индикатор Андреде (кислый фуксин), углеводы, спирты;

 полужидкие – пептонная вода, 0,5% агар-агар, углеводы, спирты;

 короткие – содержащие моносахара и дисахара (глюкоза, мальтоза, лактоза, сахароза, маннит);

 длинные – короткий ряд + моносахара (арабиноза, ксилоза, рамноза, галактоза и др.), полисахариды, спирты

.  среда Ресселя – двухсахарный агар (лактоза, глюкоза) и индикатор бромтимоловый синий, Олькеницкого – трехсахарный агар (лактоза, сахароза, глюкоза), индикатор нейтральный красный и соль Мора для выявления H2S.

Под действием сахаролитических ферментов бактерий углеводы и многоатомные спирты расщепляются до кислоты/кислоты и газа. Для обнаружения газа в жидкие среды помещают поплавки, которые при образовании газа всплывают, а в полужидких – заметно появление пузырьков. Для обнаружения кислоты добавляют индикатор, который под ее действием изменяет цвет.

 среды Эндо, Левина, Плоскирева – МПА с лактозой и индикаторами – фуксином, метиленовым синим и нейтральным красным соответственно. У бактерий, ферментирующих лактозу (лактоза+), колонии окрашиваются в цвет индикатора и приобретают металлический блеск, у лактоза минус бактерий колонии остаются бесцветными.

Для определения протеолитических ферментов используют:  определение конечных продуктов распада белков (индол, H2S, аммиак); Сероводород, индол и аммиак определяют, помещая под пробку пробирки с растущей на МПБ культурой индикаторные бумажки:  индол , окрашивает в розовый цвет индикаторную бумажку, пропитанную щавелевой кислотой;  H2S, реагируя с ацетатом свинца на индикаторной бумажке, превращается в сульфат свинца и окрашивает бумажку в черный цвет;  о наличии аммиака свидетельствует посинение лакмусовой бумажки.  способность разжижать желатин (в виде воронки, перевернутой елочки);  способность свертывать или пептонизировать плазму крови и молоко.