17.Этапы выделения чистых культур бактерий, их идентификация.

Чистую культуру бактерий получают для проведения диагно­стических исследований — идентификации,которая достигается путем определения морфологических, культуральных, биохимиче­ских и других признаков микроорганизма.

Морфологические и тинкториальные признаки бактерий изучают при микроскопическом исследовании мазков, окрашенных разными методами, и нативных препаратов.

Культуральные свойства характеризуются питатель­ными потребностями, условиями и типом роста бактерий на плот­ных и жидких питательных средах. Они устанавливаются по мор­фологии колоний и особенностям роста культуры.

Биохимические признаки бактерий определяются на­бором конститутивных и индуцибельных ферментов, присущих определенному роду, виду, варианту. В бактериологической прак­тике таксономическое значение имеют чаще всего сахаролитические и протеолитические ферменты бактерий, которые определя­ют на дифференциально-диагностических средах.

При идентификации бактерий до рода и вида обращают вни­мание на пигменты, окрашивающие колонии и культуральную среду в разнообразные цвета. Например, золотистый пигмент — Staphylococcus aureus (золотистый стафилококк), сине-зеленый пигмент — Pseudomonas aeruginosa.

Для установления биовара (хемовара, серовара, фаготипа) проводят дополнительные исследования по выялвениб соответствующего маркера – определению фермента, антигена, чувствительности к Фагам.

18. Методы культивирования вирусов: лабораторные животные, эмбрионы птиц, клеточные культуры, их оценка (ЦПД, вирусные включения, РИФ, гемагглютинация, гемадсорбция). Индикация вирусов (ЦПД, вирусные включения, гемагглютинация, гемадсорбция). Идентификация вирусов.

Вирусы - облигатные внутриклеточные паразиты, не способные размножаться на искусственных питательных средах = используют биологические модели:

• чувствительных лабораторных животных;

для вирусов, не размножающихся в культурах клеток и куриных эмбрионах.

Требования, предъявляемые к лабораторным животным:

 животное должно быть чувствительным к данному вирусу;

 использование новорожденных/молодых особей;

 использование инбридных (беспородных) животных/гнотобионтов (выращены в безмикробной среде);

 использование здоровых животных одной линии (одного пола, возраста, веса, содержащихся в одинаковых условиях).

Способ заражения животных определяется тропизмом вируса (способностью репродуцироваться в определенных типах клеток):  нейротропен (например, вирус бешенства) – вводится интрацеребрально;  пневмотропен (например, РС-вирусы) – интраназально;

 дерматропен (например, вирус натуральной оспы) – внутрикожно;  пантропен – внутривенно/внутрибрюшинно. Методы индикации вируса в организме лабораторного животного: 1) клинические симптомы заболевания; 2) гибель животного; 3) патоморфологические изменения органов при вскрытии.

• куриные эмбрионы;

Культивирование вирусов методом овокультур – заражение вирусами куриных эмбрионов. Требования, предъявляемые к куриным эмбрионам:

 должны быть из эпидемиологически благополучных хозяйств;

 скорлупа должна быть чистой, непигментированной, без механических повреждений;

 возраст – 5-12 дней (недостаточно противовирусных ингибиторов).

Способы заражения куриных эмбрионов:  закрытый (прокол иглой под контролем овоскопа);  открытый (с удалением части скорлупы). Исследуемый материал вводят в аллантоисную и амниотические полости, хорионаллантоисную оболочку и желточный мешок. Перед заражением скорлупу над воздушной камерой обрабатывают 70% этиловым спиртом и фломбируют (обжигают на пламени). После заражения отверстие в скорлупе заливают расплавленным парафином. Инкубируют при 35-37 ≈ 48 часов.

Методы индикации вируса в куриных эмбрионах: 1) результаты овоскопии – отсутствие подвижности эмбриона, слабая инъецированность сосудов кровью и отсутствие их пульсации; 2) паталогоанатомические изменения на хорион-аллантоисной оболочке – отечность, кровоизлияния, наличие оспинок (узелков); 3) отставание эмбриона в росте и развитии, пороки развития, гибель; 4) положительная реакция гемагглютинации (РГА) – через 5-10 минут при смешивании аллантоисной жидкости и суспензии эритроцитов животного на дне лунки полистеролового планшета образуется осадок в виде «перевернутого зонтика» вследствие склеивания эритроцитов под действием вируса (отрицательная РГА – эритроциты не склеиваются и выпадают в осадок в виде «пуговки»).

• культуры клеток (тканей).

Культура клеток – это клетки многоклеточных организмов (человека, животных), живущие и размножающиеся in vitro. Подразделяются на:  первичные (неперевиваемые);  полуперевиваемые;  перевиваемые. Первичные (неперевиваемые) культуры клеток – клетки, полученные непосредственно из органов и тканей организма. Этапы приготовления первичных культур клеток:

 выделение органа/ткани;  измельчение и гомогенизация ткани до частиц;  разъединение клеток путем трипсинизации;  внесение в пробирку с питательной средой;  инкубирование в термостате – клетки начинают делиться до покрытия поверхности стекла в один слой и прекращают размножаться (контактное торможение). Первичные культуры клеток живут ≈ 7-21 день, при пересевах меняют форму и гибнут. Полуперевиваемые культуры клеток – диплоидные клетки человека, выдерживающие до 50-100 пассажей. Перевиваемые культуры клеток – это клетки, способные к размножению вне организма неопределенно длительное время (злокачественные/опухолевые клетки, выдерживающие бесконечное количество пассажей): Методы индикации вируса в культуре клеток: 1) цитопатическое действие (ЦПД) вируса на клетки – дегенеративные морфологические изменения клеток (мелкозернистое перерождение, округление, фрагментация, образование симпластов); 2) образование вирусом специфических внутриклеточных включений( тельца Бабиша-Негри при бешенстве); 3) бляшкообразование (бляшек – деструктивные клетки, разрушенные вирусом и неспособные окрашиваться красителем нейтральным красным; 4) цветная проба Солка – сохранение первоначального цвета среды (красного) при наличии вируса, тогда как активные незараженные вирусом клетки метаболизируют и изменяют цвет среды (желтый); 5) РГА с культуральной жидкостью; 6) реакция гемадсорбции (РГадс) – адсорбция эритроцитов на поверхности пораженной вирусом клетки; 7) феномен интерференции – в зараженную материалом культуру клеток вносят индикаторный вирус (ВВС – вирус везикулярного стоматита) с известным ЦПД (симпластобразование) – при наличии в культуре клеток исследуемого вируса индикаторный вирус ЦПД не окажет (клетка может поражаться только одним вирусом).

В куриных эмбрионах отмечают видимые изменения в развитии эмбриона: кровоизлияния, образование бляшек на оболочках. С жидкостью, содержащейся в полостях эмбриона, также возможна постановка реакции гемагглютинации.

Реакция гемагглютинации (РГА) основана на способности вирусов вызывать склеивание эритроцитов различных видов животных, птиц и человека. РГА не является серологической, так как склеивание эритроцитов идет без участия иммунной сыворотки. Гемагглютинины вируса, способны вызывать склеивание эритроцитов.

Для постановки РГА необходимы

•  вируссодержащий материал;

• 1% взвесь эритроцитов (кур, морской свинки, человека) в изотоническом растворе натрия хлорида;

• изотонический раствор натрия хлорида (электролит).

Реакцию ставят в лунках планшета. Вначале во все лунки разливают изотонический раствор NaCl. В 1 лунку добавляют 0,5 мл вируссодержащего материала и тщательно перемешивают. Затем последовательно переносят по 0,5 мл полученного разведения из предыдущей лунки в последующую. Таким образом получают двукратные разведения.Из предпоследней лунки 0,5 мл удаляют в дезинфицирующий раствор (контроль - для исключения спонтанной, самопроизвольной гемагглютинации).

После приготовления разведений вируссодержащего материала во все лунки, включая контрольную, добавляют по 0,5 мл 1% взвеси эритроцитов, выдерживают 30-45 мин при комнатной температуре и регистрируют результаты.

• При положительной реакции гемагглютинации осадок эритроцитов зернистый в виде зонтика с фестончатыми краями.

• При отсутствии гемагглютинации осадок эритроцитов плотный, маленький, круглой формы в самом центре лунки.

• В контрольной лунке гемагглютинация отсутствует.

•  Гемадсорбции - способности культур клеток, инфицированных вирусами, адсорбировать на своей поверхности эритроциты определенных видов животных и птиц. Гемадсорбция проявляется скоплением в виде гроздей эритроцитов, адсорбированных на инфицированных вирусом клетках.

19. Микрофлора почвы, воды и воздуха. Принципы санитарно-микробиологических методов исследований. Индикация патогенных микробов в объектах окружающей среды. Косвенные методы - определение общей обсемененности и санитарно-показательных микробов.

Микроорганизмы распространены повсеместно. Они заселяют воздух, почву и воду, участвуют в круговороте веществ в природе, уничтожая остатки погибших животных и растений, повышая плодородие почвы и поддерживая устойчивое равновесие в биосфере.

Основная задача сан. микробиологии - своевременное обнаружение патогенных микроорганизмов в воде, почве, воздухе, которые могут представлять опасность как факторы передачи возбудителей инфекционных заболеваний. Определение патогенных микроорганизмов в объектах окружающей среды является сложной задачей в связи с тем, что их количество не всегда достаточно и непостоянно в межэпидемические периоды, их трудно выделить при посевах даже на специальные питательные среды, так как рост патогенных микроорганизмов подавляется сопутствующей сапрофитной микробиотой.

Cанитарное состояние объекта оценивают косвенным путем - по содержанию санитарно-показательных микроорганизмов (СПМ), представителей нормобиоты человека и теплокровных животных. Обнаружение СПМ в воде, почве, воздухе - индикатор загрязнения объектов окружающей среды выделениями человека и животных, с которыми могут попадать и возбудители инфекций.

СПМ 3 группы:

• Индикаторы фекального загрязнения (представители микрофлоры кишечника человека и животных).

•  Индикаторы воздушно-капельного загрязнения (комменсалы верхних дыхательных путей).

•  Индикаторы процессов самоочищения (обитатели внешней среды).

Санитарно-микробиологический анализ объектов окружающей среды включает определение общего микробного числа (ОМЧ) и наличия СПМ.

Санитарно-микробиологический анализ воды

Задача - оценка ее пригодности для использования в качестве питьевой и для других хозяйственно-бытовых целей с точки зрения инфекционной безопасности для здоровья человека.

•  Общее микробное число воды (ОМЧ) - количество мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов в 1 мл воды. не более 50 клеток/мл.

• содержание СПМ должны отсутствовать в 100 мл воды.

   ◊  К общим колиформным бактериям относят грам минус, не образующие спор палочки родов Escherichia, Enterobacter, Klebsiella и др.

   ◊  Термотолерантные колиформные бактерии. Их присутствие в воде свидетельствует о свежем фекальном загрязнении. Эти бактерии могут попадать в воду вместе с фекалиями человека и животных, и их обнаружение свидетельствует о возможности присутствия в воде возбудителей кишечных инфекций.

   ◊  Сульфитредуцирующие клостридии, к которым относят преимущественно Clostridium perfringens. Обнаружение в среде черных колоний свидетельствует о давнем фекальном загрязнении воды спорами этих бактерий. Не должны обнаруживаться в 20 мл отобранных проб воды.

   ◊  Колифаги - бактериальные вирусы, способные лизировать клетки E. coli; их считают индикаторами загрязнения питьевой воды сточными водами. Должны отсутствовать в 100 мл взятой для анализа питьевой воды.

   ◊  определение цист лямблий. Цисты достаточно долго сохраняются в воде и могут быть причиной заражения людей и развития лямблиоза. Должны отсутствовать в 50 л исследуемой воды.

Санитарно-микробиологический анализ почвы

 СПМ для почвы - общие колиформные бактерии и Enterococcus faecalis. При высокой биологической нагрузке на почву, например в крупных городах с большой плотностью населения, определяют колифаги и Clostridium perfringens. Наличие СПМ в почве - индикатор ее загрязнения фекалиями. Количественное содержание оценивают по индексу - количеству СПМ в 1 г почвы. Почву оценивают как чистую и безопасную при индексе СПМ до 10 клеток/г. >100 клеток/г почву -опасная, может быть фактором передачи возбудителей инфекционных заболеваний.

Санитарно-микробиологический анализ воздуха

Содержание микроорганизмов в воздухе закрытых помещений и атмосферном существенно различается.

Контролю подлежит воздух закрытых помещений.

В лпу определяют ОМЧ - количество клеток бактерий и грибов в 1 м³ воздуха и содержание Staphylococcus aureus в 1 м³ в качестве СПМ. Обнаружение золотистого стафилококка, а также гемолитических стрептококков - индикатор биологической контаминации воздуха микробиотой носоглотки и кожных покровов человека, а также патогенными микроорганизмами. Золотистый стафилококк может вызывать инфекционные заболевания кожи и дыхательных путей.

2 метода отбора проб:

•  Седиментационный метод - простой и доступный, но неточный и дает возможность только ориентировочного учета микроорганизмов в воздухе. Основан на определении микроорганизмов, оседающих вместе с частицами воздушного аэрозоля на открытую поверхность питательной среды и последующем учете образующихся колоний.

•  Более совершенный и точный - аспирационный метод, основанный на принудительном осаждении всех фракций воздушного аэрозоля вместе с микроорганизмами на поверхность питательной среды.

Максимально допустимое ОМЧ воздуха в чистых помещениях - 500 клеток/м³.

Методы санитарно-бактериологического исследования воды и воздуха

Воды-

Пробы воды отбирают с соблюдением правил асептики. Если пробы берут из водопроводной сети , краны предварительно обжигают и воду спускают в течение 10 мин. Отбирают пробу в объеме 0,5 л. Перед посевом из отобранной пробы готовят серийные разведения. Для этого 1 мл воды из отобранной пробы вносят в 9 мл стерильной воды, делая таким образом разведение 1:10. Из пробирки с разведением исследуемой воды 1:10 отбирают 1 мл и переносят в 9 мл стерильной воды, делая таким образом разведение 1:100. Таким же образом можно продолжить разведения до 1:1000 и далее. При посеве 1 мл исходной пробы воды и по 1 мл из каждого разведения вносят в стерильные чашки Петри, куда потом заливают 10-15 мл расплавленного питательного агара. После застывания посевы инкубируют при температуре 37 °С в течение 24 ч.

Для определения степени фекальной загрязненности воды используют определение коли-индекса - количества колиформных бактерий в 1 л воды, который определяют с помощью мембранных фильтров. Для этого 300-500 мл воды пропускают через мембранный фильтр. По окончании фильтрации фильтр помещают на поверхность среды Эндо. После инкубации подсчитывают количество выросших колоний. Их пересевают на среду Эндо, отмечая рост лактозоположительных красных колоний с металлическим блеском. Из них готовят мазок, окрашивают по Граму. В случае обнаружения грамотрицательных палочек ставят тест на оксидазу. Грамотрицательные оксидазонегативные, лактозоположительные бактерии относят к колиформным бактериям. Коли-индекс водопроводной воды должен быть не более 3.

Воздуха -

Седиментационный метод Коха

Стерильные чашки Петри с питательной средой оставляют открытыми в местах отбора проб на 5-10 мин, после чего их закрывают и помещают в термостат на 24 ч при температуре 37 °С. Микробное число воздуха определяют, пользуясь правилом Омелянского, в соответствии с которым считают, что на поверхность питательной среды площадью 100 см² оседает за 5-10 мин столько бактерий, сколько их находится в 10 л воздуха. Зная количество выросших колоний, вычисляют микробное число.

Исходя из диаметра чашки Петри, равного 10 см, ее площадь составляет 78,4 см². Таким образом, если на поверхности питательной среды в чашке Петри выросло N колоний, составляют математическую пропорцию и определяют, сколько колоний может вырасти на площади 100 см², т.е. сколько бактерий находится в 10 л воздуха:

Аспирационный метод

Это более точный метод, его проводят с помощью специальных приборов-воздухоотборников , через которые засасывается определенный объем воздуха. Для определения микробного числа воздуха засасывают 100 л воздуха. Для определения количества СПМ (золотистого стафилококка и грибов) засасывают 250 л воздуха, проводя посевы на кровяной агар для выделения стафилококков и агар Сабуро - для выделения грибов.