Семинар 7. Условия культивирования и методы хранения микроорганизмов
Для роста микроорганизмов существенное значение имеют не только состав питательной среды, но и такие факторы, как кислотность среды, аэрация, температура, свет, влажность. Развитие микроорганизмов возможно лишь в определенных пределах каждого фактора, причем для различных групп микроорганизмов эти пределы часто неодинаковы.
Температура. Интервалы температур, в которых возможен рост различных микроорганизмов, заметно варьируют. У мезофилов, к которым относится большинство известных нам форм, температурный оптимум лежит в интервале от 25 до 37 °С. У термофилов он значительно выше: от 45 до 80 — 90 °С. Психрофилы хорошо развиваются в интервале температур 5—10 °С. Отклонение температуры от оптимальной неблагоприятно влияет на развитие микроорганизмов, поэтому микроорганизмы выращивают в термостатах или специальных термостатированных комнатах, где с помощью терморегуляторов поддерживается соответствующая оптимальная температура. Мезофильные бактерии, естественным местом обитания которых являются вода и почва, выращивают в интервале от 20 до 30 °С, тогда как бактерии кожных покровов, слизистой или кишечника человека и животных культивируют при более высокой температуре: 35 — 37 °С. Для выращивания психрофилов используют холодильные камеры.
Свет. Для роста подавляющего большинства микроорганизмов освещение не требуется. Напротив, прямые солнечные лучи отрицательно влияют на их развитие, поэтому такие микроорганизмы выращивают в темноте. Свет необходим для роста фототрофных микроорганизмов. Однако естественное освещение используют редко, так как оно непостоянно и плохо контролируемо. Как правило, фототрофов выращивают в люминостатах, т.е. камерах, освещенных лампами накаливания или флуоресцентными лампами дневного света. Необходимая температура в люминостатах создается благодаря вентиляции или холодильному устройству.
Выбор источника освещения определяется спектром его излучения и длинами волн, при которых культивируемые микроорганизмы осуществляют фотосинтез. Для выращивания пурпурных и зеленых бактерий лучше использовать лампы накаливания; для культивирования цианобактерий и микроводорослей нужно применять флуоресцентные лампы дневного света. Помимо спектрального состава света обращают внимание на освещенность, которую измеряют с помощью люксметра.
Активная кислотность среды. Активная кислотность (рН) среды имеет решающее значение для роста многих микроорганизмов. Большинство бактерий лучше всего растет при рН, близком к 7,0, микроскопические грибы, напротив, предпочитают слабокислые среды, поэтому в приготовленных средах всегда следует определить значение рН. Измеряют рН электрометрическим методом на потенциометре. В лабораторной практике удобно использовать различные жидкие или бумажные индикаторы.
Широко применяется, например, жидкий двуцветный индикатор, бромтимоловый синий (бромтимолблау). Его цвет изменяется от желтого к синему при сдвиге рН от 6,0 до 7,6. При рН 7,3 индикатор имеет сине-зеленую окраску.
В случае необходимости рН среды доводят до нужного значения растворами кислот (НСl, Н2SО4), щелочей (NаОН, КОН) или солей, имеющих щелочную реакцию (Nа2СО3, NаНСО3). Для корректировки рН целесообразно иметь стерильные растворы разной концентрации.
Значение рН сред может измениться в процессе стерилизации, поэтому после стерилизации его следует проверить и, если требуется, довести до нужного с помощью стерильных растворов кислоты или щелочи. Активная кислотность питательной среды, благоприятная для начала роста микроорганизмов, часто меняется в процессе их культивирования. Эти изменения могут быть результатом образования продуктов метаболизма или неравномерного потребления отдельных компонентов среды.
Например, при потреблении углеводов в среде накапливаются органические кислоты, снижающие рН среды. В средах с КNО3, как уже отмечалось, рН возрастает за счет более интенсивного потребления нитрат-иона и накопления ионов калия.
Чтобы не допустить чрезмерного изменения рН в культурах микроорганизмов и удержать его на необходимом уровне, используют различные приемы. Иногда в среды добавляют буферные растворы. В микробиологической практике чаще других применяют фосфатные буферы. Однако если рост микроорганизмов сопровождается образованием большого количества кислот, то тех количеств буферного раствора, которые можно добавлять к средам (не более 5 г фосфатов на 1 л среды), оказывается недостаточно, так как противодействие любого буфера изменению рН ограничено. В связи с этим для микроорганизмов, активно изменяющих кислотность среды, применение буферов не эффективно. При культивировании таких микроорганизмов в среды вводят избыточное количество мела, который нейтрализует образующиеся кислоты. Для нейтрализации кислот по ходу развития культуры можно применять 10%-й стерильный раствор NаНСО3.
Поддержание определенного значения рН во время роста особенно важно для тех микроорганизмов, которые в процессе жизнедеятельности образуют кислоты, но не обладают устойчивостью к ним. К их числу относятся молочнокислые бактерии, а также многие псевдомонады. Большие затруднения встречаются, когда нужно поддержать рН в слабощелочных средах, так как для Диапазона рН от 7,2 до 8,5 подходящих буферов не существует. С этой целью иногда приходится периодически или непрерывно доводить рН до нужной величины, добавляя стерильно в среду растворы кислоты или щелочи при постоянном контроле значения рН. В современных ферментерах это достигается с помощью специальных автоматических устройств.
Аэрация. Кислород входит в состав воды и многих соединений, поэтому поступает в клетки в больших количествах. Значительная часть микроорганизмов нуждается в постоянном притоке молекулярного кислорода. Такие микроорганизмы принято объединять в группу облигатных аэробов. Энергетическим процессом у них является аэробное дыхание, а молекулярный кислород играет роль терминального окислителя.
Среди облигатных аэробов выделяют группу микроаэрофилъных микроорганизмов, которые нуждаются в кислороде, но лучше растут, если его парциальное давление меньше, чем в воздухе. Развитие других микроорганизмов, напротив, возможно только в отсутствие кислорода. Получение энергии у них не связано с использованием молекулярного кислорода, а для многих кислород даже токсичен: он угнетает рост или вызывает гибель клеток. Такие микроорганизмы называются облигатными анаэробами. Факультативные анаэробы способны расти как в присутствии, так и в отсутствие молекулярного кислорода. Например, некоторые дрожжи и энтеробактерии в зависимости от наличия кислорода осуществляют аэробное либо дыхание, либо брожение. Неодинаковые потребности микроорганизмов в свободном кислороде учитывают при выборе способа их выращивания.