Методы культивирования и идентификации Культивирование

B aclllus anthracis по способу дыхания относят к факультативным анаэробам, хорошо растет на универсальных средах (МПБ, МПА, МТГЖ, картофеле, молоке). Оптимальная температура роста на МПА 35-ЗТС, в бульоне 32-33⁰С. При температуре ниже 12 и выше 4-5⁰С не растет Оптимум РН сред 7,27,6. На поверхности МПА в аэробных условиях при температуре ЗТС 17-24-часовые культуры состоят из серовато-беловатьгх тонкозернистых с серебристым опенком, похожих на снежинки колоний, имеющих шероховатый рельеф и характерных для ТИПИЧНЫХ вирулентных штаммов В-форма). Диаметр колоний не превышает 3-5 мм.На сывороточном агаре и свернутой лошадиной сыворотке в присутствии 10-50⁰/0 углекислоты колонии гладкие полупрозрачные (&форма), а также слизистые (мукоиднъте), тянущиеся за петлей (М-форма), состоящие из капсульных палочек.В МПБ Bacillus anthracjs через 16-24 ч на дне пробирки образует РЫХЛЫЙ белый осадок, надосадочная жидкость остается прозрачной, при вслряхивании бульон не мутнеет, осадок разбивается на мелкие хлопья В-форма).При посеве в столбик желатина на 25-е сут появляется желтовато-белый стержень. Культура напоштнаег елочку, перевернутую верхушкой вниз. Постепенно верхний слой желатин начинает разжижаться, принимая сначала форму воронки, затем мешочка.Васч//и.ч anfhracts при росте в молоке вырабатываег ослоту и через 24 дня свертывает его и пептонизирует сгустокВозбудитељ хорошо размножается в 8-12-суточных куриных эмбрионах, вызывая их гибель на

24 дней с момента заражения

Цдешмфикация

Расхождения между стандартной микробиологической идентификацией и результатами LRNПЦР наблюдались для 23 изолятов, которые были извлечены после длительного хранения. MLVA и MLST были выполнены, чтобы помочь в устранении расхождений и идентификации этих изолятов. Для шести УСТОЙЧИВЫХ к тмма-фагам ГЩР-положшрльных изолятов все шесть хромосомных локусов MLVA были успешно амплифигщрованы, что подтверждаег идентификацию этих изолятов км устойчивых к гамма-фамм В. anthracis. Помимо устойчивости к рамма-фагам, эти изолягы бьџти типичными В. anthracis. Эм изоляты имели типичную морфологию колоний, были негемолитическими, чувствительными к пенициллину и кластеризовались с В. anthracrs с помощью MLST. Все мегоды, использованные в лом исследовании, убедительно подтверждают их идентификацию как В. anthraus- Устойчивые к гамма-фагам В anthmcis, хотя и встречаются редко, ранее были задокументированы [15]

Для 16 из 17 чувствительных к гамма-фагу и пенициллину ПЦР-негативных изолятов анализ 'MLST подтверждает идентификацию этих изолятов как В. cereus, которые тесно связаны друг с другом и с В. anthmcis на основе их STs и положения в кладе I (как описано РпеМ et al.) [14] В то время В. cereus и В. thumgensis невозможно отличить по MLST, клада 1 состоит п№химудественно из штаммов В. anthracis и В. cereus. Данные MLVA также подтвердили иденпфжацию этих изолятв как В. cereus. В предыдущих отчетах было задокументировано существование чувствительных к тамма-фагам изолятов В. cereus, подобных этим, но они редко встречаются [7]. Поскольку недавно была охарактеризована идентификация гамма-фагового гецептора В. anthracis, было бы интересно секвенировать ген gamR этих изолятв и соотнести эти результаты с чувствительностью к ммма-фатм [16].

Один ПЦР-озрицалельный, чувствилельный к гамма-фагу изолят 2000031002, собранный в 1960 году в Бельгийском Конт, дал наиболее своеобразные результаты. Эгот изолят был чувствителен к пенициллину, амплифрщировал все шесть хромосомных локусов MLVA (хотя четыре размера аллелей были необычными) и кластеризовался со штаммами В. anthracis с помощью MLST. Ранее было задокументировано, что ограниченное количество маркеров MLVA будет усиливаться у В. cereus или В. были идентифицированы thurmgiensis [12] и небольшое количество близкородственных изолятов, не относящихся к В. anthracls, которые амплифицирутот все шесть ХРОМОСОМНЫХ локусов (хотя аллели были размерами, ранее не наблюдавшимися у В. anthraus) [Р. Кет, личное сообщение]. Однако этот изолят был слабо гемолитическим и подвижным (данные не показаны), Кроме того, этот изолят был ШАРотрицательным по обоим плазмидным маркерам с помощью ГП-Џ) LRN в режиме реального времени, а таюке не амплифицировал плазмидные маркеры MLVA. Хотя этот изолят обладает нескольюами характеристиками совместимыми с В. anthracis, основанными на специфичности ГИДР (как описано ранее и в этом исследовании), необычных размерах илелей VNTR и отсутствии предыдущей документации о подвижных изолятах В. anthracis, этот изолят, скорее всего, является очень необычным В. cereus.

Изоляты в этом исследовании представляют собой небольшое подмножество более крупной коллекции Bacillus spp., которая была восстановлена после длительного хранения (от 20 до 50 лет), и для многих изолятов в этой коллекции доступна ограниченная описательная информация [8], Для изученных нами изолягов мы предполагаем, что устойчивые к гамма-фагам В. anthracis были патогенными при первом выделении, но потеряли плазмиды рХО1 и рХО2 во время хранения [8] Мы предполагаем, что изоляты человеческого и животного происхождения были полностью вирулентными при первом выделении, поскольку для возникновения заболевания необходимы обе ПЛоМИДЫ. Марстон и др. показано, что многие из изолятов в оригинальной коллекции потеряли одну или обе Пјтмиды вирулентности во время хранения Кроме того, изолятъг из окружающей среды, скорее всего, были вирулентными на момент сбора, поскольку эти Изоляты со временем теряли плазмиду по той же схеме, что и ютинические изолят в ЭтОм исследованирг Для изолятов В. cereus сложнее установшъ их патогенность, поскольку изоляты В cereus мојуг проявлять широкий спектр вирулентности и вызывать различные инфекции [17], Несколько мегодов предполаткуг, что изоляты, тесно связанные с В. anthracis, имеют тенденцию быть юггиническими (по сравнению с окружающей средой) по своей природе [13, 18, 19]. Однако данные MLST показали, что клинические изоляљт, включая изоляты, ассоциированные с тяжелым заболеванием, не ЯВЛЯЮ1СЯ клональными или ограничены клад В. anthracis[20]. Таким образом, патогенность не может быть с уверенносљю выведена на основе их филогенетического родства

В дополнение к отрицательному результату на хромосомный маркер, ни один из чувствительных к гамма-фагу изолятв В. cereus не был ПОЛОЖШРЛЬНЬГМ по ПЦР ни на один из плазмидньтХ маркеров. Их первоначальная идентификация, скорее всего, была основана на фенотипических характеристиках, поскольку молекулярные методы, такие как ПГЏ) были недоступны на момент сборщ и профили плазмид этих изолятов было нелепо определить. Хотя В апотгасв и В. cereus очень тесно связаны, они сильно различатогся по своей патогенности, которая обычно объясняется наличием факгоров, кодируемых плазмидой. Для В anthraos зги факторы вирулентности кодируются на рХО1 и рХО2; однако недавние сообщения показали, то другие виды могуг содержать гены и плазмиды, сходные с рХО1 и рХО2 [1-6]. Возможность горизонтального переноса шти отверждения плазмид подчеркивает важность использования хромосомного маркера для идентификации В, anthracis.