4 курс / Акушерство и гинекология / Кадырова_Л_В_Дифференцировка_Т_лимфоцитов_в_динамике_беременности
.pdf31
дифференцировки Т-лимфоцитов посвящены гипертензивным расстройствам во время беременности [4, 24, 17]. Так, в работе Гасановой Д.Д. (2012) в периферической крови беременных женщин с гипертензивными расстройствами в популяции Т-хелперов отмечалось увеличение доли терминальнодифференцированных клеток памяти с фенотипом CD45RA+CD62L- [7], которые способны быстро активироваться и осуществлять эффекторную функцию непосредственно при контакте с антигеном без длительного процесса его презентации [171, 95, 205]. Одновременно в работе Лазаревой Ю.Ю. (2013) выявлено также увеличение в крови женщин с гипертензивными расстройствами во время беременности терминально-дифференцированных клеток памяти в популяции цитотоксических Т-лимфоцитов [17].
Цитокины традиционно были предметом особого внимания со стороны исследователей, занимающихся проблемами иммунологии репродукции. Практически вся последняя декада была посвящена гипотезе о ведущей роли цитокинов в регуляции иммунного ответа матери во время беременности [9]. Показано, что продукция цитокинов с наступлением беременности значительно меняется [22, 9, 184, 25]. Однако, несмотря на обилие работ в этой области, механизмы поддержания цитокинового баланса во время беременности остаются до конца нераскрытыми.
Рядом авторов было показано, что дифференцировка клеток памяти происходит при контакте с антигеном и контролируется рядом цитокинов, таких как IL-2, IL-4 и IL-15 [95, 74, 106, 108, 137, 116], которые способствуют выживанию клеток и медленной гомеостатической пролиферации [180]. Так по литературным данным показано, что IL-7 и IL-15 регулирует выживаемость и самообновление в отсутствие антигена мышиных CD8+ Т клеток памяти [34, 155], тогда как наивные клетки и CD4+ клетки памяти требуют IL-7 и TCR лигандов [172, 173], но не отвечают на IL-15 [155]. Другие авторы утверждают что, человеческие CD4+ Т-клетки памяти могут пролиферировать в ответ на IL-15 TCR-независимым образом и с медленной кинетикой [125], при этом отмечая разную роль IL-15 в поддержании гомеостаза CD4+ Т-клеток памяти у человека и
32
мышей. Это связано с тем, что цитокины участвуют в осуществлении практически всех этапов гестационного процесса [9].
Особого внимания при беременности заслуживают IL-2 и IL-15, которые относятся к цитокинам, регулирующим клеточный иммунитет [11]. Рецепторы этих цитокинов имеют общую β-цепь (CD122), однако, как, показывают проведенные исследования, их присутствие в микроокружении Т-лимфоцитов в результате активации приводит к формированию различных субпопуляций: присутствие IL-2 приводит к преимущественному формированию эффекторных Т-клеток с фенотипом CD62L low, а в присутствии IL-15 формируется пул CD62L hi Т-лимфоцитов [72]. Видимо, направленность дифференцировки Т-лимфоцитов определяется силой сигнала, проведенного через молекулу CD122: слабый сигнал приводит к образованию центральных клеток памяти, а сильный к образованию эффекторных клеток [193]. Однако, несмотря на то, что IL-15 способствует дифференцировке Т-клеток в долгоживущие клетки памяти, его присутствие необходимо и для выживания короткоживущих эффекторных клеток [115]. Основными продуцентами IL-2 являются Т-хелперы, имеющие функциональные признаки Т-хелперов 1-го типа. Кроме того, синтезировать IL-2 способны также дендритные клетки [114]. В отличие от IL-2, IL-15 синтезируется различными типами клеток, в частности, моноцитами/макрофагами, эпителиальными клетками [11]. IL-2 представляет собой секреторный цитокин, тогда как IL-15 находится в основном в виде мембранной формы [208]. IL-2 и IL-15 стимулируют пролиферацию активированных антигеном Т-лимфоцитов. В дополнение к этому IL-15 может поддерживать пролиферацию цитотоксических Т-клеток памяти, но не наивных Т-лимфоцитов и увеличивает жизнеспособность Т-хелперов [206].
Однако в настоящее время имеются лишь единичные работы об изменении уровня IL-2 и IL-15 при патологии беременности [13, 22, 175]. Так, ранее было показано, что при угрозе прерывания беременности отмечалось увеличение содержания IL-2 в сыворотке крови по сравнению с показателями группы женщин с неосложненным течением беременности [13]. Другие исследователи отмечали снижение сывороточного уровня IL-2 при угрозе прерывания беременности в 1
33
триместре гестации [22]. Помимо этого, в литературе имеются данные о более высоком значении уровня IL-15 у беременных женщин 3 триместра гестации с развившейся преэклампсией по сравнению с таковым у беременных женщин с нормальным артериальным давлением [175].
Таким образом, анализ литературы показал, что в настоящее время полностью отсутствуют исследования о содержании Т-хелперов и цитотоксических Т-лимфоцитов, находящихся на различных этапах дифференцировки, и проявлении ими функциональной активности при неосложненной беременности в динамике гестационного процесса. В то же время изучение сложного каскада иммунологических событий, развивающихся в процессе гестационного процесса, и как показывают проведенные исследования, сопровождающиеся динамическим изменением клеточного профиля и цитокинового фона, будет способствовать углублению наших знаний о регуляции иммунного ответа при беременности и позволит уточнить патогенетические механизмы развития различной акушерско-гинекологической патологии.
34
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Организация работы и объем исследования
Работа выполнена на базе Федерального государственного бюджетного учреждения “Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства имени В.Н. Городкова” Министерства здравоохранения Российской Федерации (директор д.м.н. А.И. Малышкина). В работе проводилось лонгитудинальное обследование беременных женщин, вставших на диспансерный учет в территориальной женской консультации № 2 г. Иваново, в течение гестационного процесса в 1-3 триместрах. Лабораторные исследования проводились в лаборатории клинической иммунологии - зав. лабораторией заслуженный врач РФ, д.м.н., профессор Н.Ю. Сотникова.
На каждую пациентку заполнялась специально разработанная “карта обследования беременной женщины”, в которую выкопировывались данные анамнеза, результаты исследований и наблюдений из индивидуальной карты беременной и родильницы, истории родов. Каждая женщина давала письменное информированное согласие на участие в исследованиях.
Всего было обследовано:
-36 небеременных женщин (контрольная группа);
-85 беременных женщин (основная группа), обследованных лонгитудинально троекратно.
При ретроспективном анализе в зависимости от последующего характера течения гестационного процесса среди женщин основной группы были выделены подгруппы женщин:
35
-с неосложненным течением беременности 1 триместра гестации (5-8 недель гестации) n=76;
-с неосложненным течением беременности 2 триместра гестации (16-20 недель гестации) n=74;
-с неосложненным течением беременности 3 триместра гестации (28-32 недели гестации) n=71;
-с развившимся впоследствии самопроизвольным выкидышем (10-12 недель гестации) n=9.
Контрольная группа представлена практически здоровыми женщинами фертильного возраста, с реализованной репродуктивной функцией. Отбор проводился во время планового профилактического осмотра.
Осложнений беременности у женщин основной группы на всем протяжении гестационного процесса выявлено не было. Беременность у всех женщин с неосложненным течением гестационного процесса закончилась своевременными родами.
Материалом для исследования служила периферическая венозная кровь из локтевой вены.
Исследования были одобрены локальным этическим комитетом Федерального государственного бюджетного учреждения «Ивановский научноисследовательский институт материнства и детства имени В.Н. Городкова» Министерства здравоохранения Российской Федерации.
2.2.Иммунологические методы исследования
-Получение сыворотки периферической крови
Для исследования сывороточного содержания различных биологических продуктов кровь в количестве 1 мл отбирали в сухую центрифужную пробирку, оставляли на 10-15 мин до полного свертывания, сгусток крови осторожно обводили по стенке пробирки длинной иглой и центрифугировали при 1500 об/мин 10 мин. Отделившуюся от сгустка сыворотку аликвотами по 200 мкл
36
разливали в пробирки типа Эппендорф и хранили до проведения исследования в холодильнике при -200 С. При необходимости сыворотки хранили при -800С.
- Выделение мононуклеарных клеток
Для исследований методом проточной цитофлюориметрии и полимеразной цепной реакции в реальном масштабе времени (RT-PCR) кровь забирали в центрифужные пробирки, содержащие 2,7 % раствор ЭДТА из расчета 3 мл крови на 1 мл раствора ЭДТА. Выделение лимфоцитов из периферической крови осуществляли традиционным методом скоростного центрифугирования при 1500 об/мин в градиенте плотности фиколл-урографина (d-1,078) [59].
- Проточная цитофлюориметрия
Поверхностный фенотип лимфоцитов и содержание клеток, внутриклеточно продуцирующих IL-4, IFNγ в популяции CD4+ лимфоцитов и Perforin и Granzyme B в популяции CD8+ лимфоцитов, определяли с помощью моноклональных антител (мАТ) методом проточной цитофлюориметрии на цитометре FACSCanto II с использованием программного обеспечения FACSDiva (Becton Dickinson, США). В качестве флюорохромных меток использовали флюоресцеин изотиоционат (FITC), фикоэритрин (РЕ), аллофикоцианин (APC) и перидининхлорофил протеин 5.5 (PerCP-Cy5.5). Фирма-производитель и клон используемых в исследовании мАТ указаны в таблице 2.2.1.
Процедуру окрашивания и фиксации клеток проводили стандартным способом в соответствии с указаниями фирмы-разработчика. При проведении проточной цитофлюориметрии клетки использовали в конечной концентрации 1 х 106 кл/мл. К 50 мкл суспензии клеток в концентрации 1 х 106 кл/мл одновременно добавляли 20 мкл мАТ, меченных PerCP-Cy5.5, 20 мкл мАТ, меченных APC и 20 мкл мАТ, меченных FITC, инкубировали в темноте при комнатной температуре в течение 30 минут, затем клетки отмывали в 1 мл фосфатного буфера (PBS), содержащего 0,1% азид натрия, и фиксировали в соответствии со стандартной процедурой.
Содержание клеток, внутриклеточно продуцирующих IL-4, IFNγ в популяции CD4+ лимфоцитов и Granzyme B, Perforin в популяции CD8+
37
лимфоцитов, оценивали, используя процедуру внутриклеточного окрашивания клеток с применением коммерческого набора FIX & PERM cell permeabilization reagents (Invitrogen, США) для пермеабилизации клеточной мембраны.
|
|
|
|
|
Таблица 2.2.1. |
|
Панель моноклональных антител, использованных в исследовании |
||||||
|
|
|
|
|
|
|
№ |
мАТ |
Клон |
Изотип |
Фирма- |
Флюорохром |
|
п/п |
производитель |
ная метка |
|
|||
|
|
|
|
|||
|
|
|
|
|
|
|
1. |
Human CD8 |
RPA-T4 |
Mouse |
eBioscience, США |
PerCP-Cy5.5 |
|
|
IgG1 |
|
||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
2. |
Human CD4 |
OKT4 |
Mouse |
eBioscience, США |
PerCP-Cy5.5 |
|
|
IgG2b |
|
||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
3. |
Human CD45RA |
HI100 |
Mouse |
eBioscience, США |
APC |
|
|
IgG2b |
|
||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
4. |
Human CD62L |
DREG56 |
Mouse |
eBioscience, США |
FITC |
|
|
IgG1 |
|
||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
5 |
Human CD31 |
WM59 |
Mouse |
eBioscience, США |
PE-Cy7 |
|
|
IgG1 |
|
||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
6. |
Human IL-4 |
4D9 |
Mouse |
Beckman Coulter, |
РЕ |
|
|
IgG1 |
Франция |
|
|||
|
|
|
|
|
||
|
|
|
|
|
|
|
7. |
Human IFNγ |
4S.B3 |
Mouse |
eBioscience, США |
РЕ |
|
|
IgG1 |
|
||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
8. |
Human |
GB11 |
Mouse |
eBioscience, США |
PE |
|
|
Granzyme B |
IgG1 |
|
|||
|
|
|
|
|
||
|
|
|
|
|
|
|
9. |
Human Perforin |
G9 |
Mouse |
eBioscience, США |
PE |
|
|
IgG2b |
|
||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
10. |
Mouse IgG1 |
- |
Mouse |
Becton Dickinson, |
FITC |
|
|
|
|
IgG1 |
США |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
38
11. Mouse IgG2a |
- |
Mouse |
Becton Dickinson, |
PE |
|
|
IgG2a |
США |
|
FITC – флюоресцеинизотиоцианат PE – фикоэритрин
APC –аллофикоцианин PerCP-Cy5.5–перидинин-хлорофил протеин 5.5
При проведении процедуры внутриклеточного окрашивания клетки, предварительно меченные анти-CD4+, анти-CD8+, анти-CD62L+ и антиCD45RA+ мАТ, в соответствии со стандартным протоколом, сначала фиксировали в течение 15 мин в 100 l фиксирующего буфера А из набора FIX & PERM cell permeabilization reagents.
Далее клетки инкубировали со 100 l пермеабилизирующего буфера В и с анти-IL4-мАТ, c анти-IFNγ-мАТ, с анти-GrB-мАТ, с анти-Perf-мАТ для внутриклеточного окрашивания. В дальнейшем клетки фиксировали в соответствии со стандартной процедурой и использовали для проведения цитометрического анализа.
Для анализа неспецифического окрашивания использовали Simultest Control (мышиные IgG1-FITC + IgG2a-PE) ("Becton Dickinson", США). Для наложения оптимального окна дискриминации (гейта) для лимфоцитов на точечном графике прямого и бокового светорассеяния клетки метили анти-CD45-FITC и анти-CD14-PE мАТ ("Becton Dickinson", США). При анализе лимфоцитарный гейт включал не менее 95-98% клеток с фенотипом CD45+CD14-. В каждом образце анализировали не менее 10000 клеток. Анализ результатов проводили в программе "CELLQuest Pro” (Becton Dickinson, USA).
-Определение уровня ДНК TREC методом RT-PCR
Процедуру выделения ДНК из лимфоцитов проводили стандартным методом согласно инструкции с использованием комплекта реагентов для выделения нуклеиновых кислот «ПРОБА-НК-ПЛЮС» фирмы «ДНК-технология» (Россия).
39
Для определения экспрессии ДНК TREC в общей фракции периферических лимфоцитов использовали метод полимеразной цепной реакции (PCR) в масштабе реального времени. В работе использовали набор реагентов для определения гена TREC (ООО «Синтол», Россия), для определения гена 18s rRNA (Biosourse, США). Анализ производился на приборе iQCycler (Bio-Rad, США). При анализе данных использовали стандартный полуколичественный Ct-метод определения уровня экспрессии ДНК специфических генов.
Для этого в каждом образце одновременно определялся пороговый цикл амплификации Ct для ДНК TREC и 18s rRNA, который использовался в качестве гена домашнего хозяйства. Затем уровень экспрессии ДНК TREC нормализовали относительно экспрессии ДНК 18s rRNA. Для этого рассчитывался показатель Ct
по формуле: Ct=Ct-TREC - Ct-18s rRNA, где
Ct TREC – цикл начала амплификации для гена TREC,
Ct 18s rRNA – цикл начала амплификации для гена 18s rRNA.
Для полуколичественной оценки результатов RT-PCR, уровень экспрессии ДНК TREC в группе беременных женщин нормализовали относительно соответствующего показателя в контрольной группе. Для этого рассчитывался коэффициент RQ (related quantity) по стандартной формуле [79].
RQ= 2^ (-
Ct), где
Ct = Ct беременные женщиныCt контроль
Таким образом, все результаты представлены как n-кратные различия между соответствующими показателями в группе беременных женщин и небеременных доноров.
ПЦР ставили с использованием набора реагентов TaqMan Universal PCR Master Mix («Applied Biosystems», США) в объеме 25 мкл: 1 цикл - 50ºС 2 мин, 95ºС 10 мин; 45 циклов - 95ºС 15 сек, 60ºС 1 мин, использовали прибор “7300
Real-Time PCR System” («Applied Biosystems», США).
-Определение содержания цитокинов методом ELISA
40
Содержание цитокинов в сыворотке периферической крови определяли методом ELISA на микропланшетном ридере Multiscan EX (Labsystems, Финляндия). Анализ и интерпретацию результатов осуществляли в соответствии с рекомендациями фирмы-разработчика. В таблице 2.2.2 представлена характеристика использовавшихся в работе тест-систем для проведения ELISA.
|
|
Таблица 2.2.2 |
||
Характеристика тест-систем для ELISA, использованных в работе |
||||
|
|
|
|
|
Исследуемый |
Фирма-производитель |
Чувствительность |
|
|
показатель |
|
системы |
|
|
|
|
|
|
|
IL-2 |
INVITROGEN, США |
от 4.0 пг/мл |
||
|
|
|
|
|
IL-15 |
INVITROGEN, США |
от 11 пг/мл |
||
|
|
|
|
|
2.3. Статистическая обработка данных
Статистическая обработка данных проводилась по общепринятым методам вариационной статистики после проверки рядов на нормальность распределения по критериям Колмагорова-Смирнова, Лиллифорса и Шапиро-Уилка [26]. В тех случаях, когда распределение значений показателей соответствовало нормальному, достоверность различий показателей в группах определялась по t- критерию Стьюдента. В тех случаях, когда распределение не соответствовало нормальному, использовали непараметрический U-критерий Манна-Уитни.
Расчет нормативных показателей содержания наивных клеток, центральных, претерминально-дифференцированных и терминальнодифференцированных клеток памяти в популяциях CD4+ и CD8+ лимфоцитов периферической крови проводился на основе 95% доверительного интервала.
Статистический анализ осуществлялся в пакете прикладных лицензионных программ “Statistica 6.0.”, “Microsoft Office 2007”, “MedCalc”.
Общее количество проведенных лабораторных исследований составило
3312 (табл. 2.3.1.).