6 курс / Кардиология / Шляхто_Е_Вред_Кардиология_Национальное_руководство_2019

роста, а также покрытая мезотелием «капсула эксплантата», представленная 1-2 слоями фибробластов, через просветы в которой часть клеток мигрирует за пределы эксплантата, формируя периферическую зону роста эксплантатов.

Часто дизайн экспериментов требует более гомогенной культуры кардиомиоцитов, в таких случаях применима техника получения первичных культур неонатальных кардиомиоцитов. Как и для многих иных типов первичных тканевых культур клеток, получение первичных культур неонатальных кардиомиоцитов основано на сочетании методов механической и энзиматической диссоциации образца ткани с последующей экспансией адгезивных клеток. Особенности техники - многоэтапность диссоциации, обусловленная структурой миокарда, содержащей соединительнотканные прослойки, и собственно эндомизий, образуемый коллагеновыми и эластическими волокнами.

Кроме того, миокард высокочувствителен к гипоксии, что заставляет предъявлять особо высокие требования к сохранности исходных образцов ткани (как функции временного промежутка между забором образца и началом выделения клеток). После механической диссоциации образцов ткани миокарда новорожденных крысят дальнейшую энзиматическую диссоциацию проводят с использованием коктейля коллагеназы II и панкреатина. При этом неонатальные кардиомиоциты растут и развиваются на желатиновой подложке в среде, состоящей на первом этапе экспансии клеток in

vitro (первичная питательная среда) из 67% питательной среды Игла в модификации Дульбекко (DMEM) с высоким содержанием глюкозы, 17% питательной среды типа M199, 5% фетальной сыворотки теленка и 10% лошадиной сыворотки, с добавлением пенициллина и стрептомицина, а на втором этапе работы (среда экспансии) - в бессывороточной питательной среде, состоящей из 80% питательной среды Игла в модификации Дульбекко (DMEM) с низким содержанием глюкозы и 20% питательной среды типа M199 с добавлением пенициллина и стрептомицина (рис. 5.1). Возможно применение и иных рецептур питательных сред. При этом рост неонатальных кардиомиоцитов возможен как в стандартных адгезионных культурах, так и в трехмерных культурах, например в толще агарозного геля.

КЛЕТОЧНЫЕ ЛИНИИ

Линии клеток разных типов широко применяют в разных областях молекулярной и клеточной биологии. Существующие коллекции клеточных линий человека и животных широко представлены на рынке биотехнологий, обеспечивая исследователей широким выбором in vitro моделей, обладающих разными биологическими свойствами. В применении к кардиологии наиболее широко используют клетки линий С2С12 (линия скелетных миобластов мыши) и Н9С2 (линия эмбриональных сердечных (желудочковых) миобластов крысы). Кроме того, большой интерес представляет линия HL-1 - производная линии клеток опухоли мышиного предсердия AT-1. Клетки линии HL-1 способны к многократным пассажам in vitro без потери способности к сокращению; при этом они сохраняют присущий дифференцированным кардиомиоцитам комплекс морфологических, генетических, биохимических и электрофизиологических свойств.

К настоящему времени опубликовано около 500 работ, основанных на использовании клеток линии HL-1 в эксперименте, что иллюстрирует потенциал данной стратегии в области исследований биологии клеток сердца. В литературе встречаются упоминания и о применении иных клеточных линий, установленных при помощи методов генетической инженерии из кардиомиоцитов человека и животных, включая линии W1.

ИЗОЛИРОВАННЫЕ КАРДИОМИОЦИТЫ

В некоторых случаях дизайн экспериментов требует использования полностью гомогенной популяции кардиомиоцитов, либо даже отдельных клеток с точно известным фенотипом. Такие требования предъявляют, например, к исследованиям в областях электрофизиологии, транскриптомики, биомаркеров и др. Данная техническая задача может быть решена несколькими способами, основанными на использовании методов многоэтапной гомогенизации и фильтрации, проточной цитометрии/флуоресцентноактивированной клеточной сортировки (FACS) и лазерной захватывающей микродиссекции.

Рис. 5.1. Первичная культура неонатальных кардиомиоцитов крысы

Метод многоэтапной гомогенизации и фильтрации клеток технически прост, но его применение подразумевает высокий уровень вариабельности и гибель значительной части клеток.

Принцип метода проточной цитометрии основан на регистрации флуоресценции и светорассеяния от каждой отдельно взятой клетки в клеточной суспензии. Суспензия клеток под давлением подается в проточную ячейку, где, находясь в ламинарном потоке обтекающей жидкости, клетки выстраиваются в цепочку (гидродинамическое фокусирование), проходят через лазерный луч, а флуоресценцию и рассеянное лазерное излучение каждой клетки регистрируют и обрабатывают. В ходе флуоресцентноактивированной клеточной сортировки пул клеток делится на фракции в соответствии с этими параметрами. Несмотря на то, что данный метод чрезвычайно широко используют в клеточной биологии, флуоресцентно-активированная клеточная сортировка кардиомиоцитов затруднена несколькими факторами, включая значительные размеры клеток, их высокую чувствительность к действию факторов внешней среды (приводящую к массовой гибели кардиомиоцитов в ходе сортировки), цитотоксичное действие по отношению к ним флуоресцентных красителей (например, DRAQ5) или медленное и плохое восприятие их клетками (Hoechst 33342). Неортодоксальный метод решения последней группы проблем - осуществление клеточной сортировки не по параметрам окраски флуоресцентными красителями, а именно по размеру и форме клеток, что дает хорошие результаты.

Метод лазерной захватывающей микродиссекции основан на применении микроскопов с компьютерным управлением, соединенных с системой получения изображений, с соответствующим программным обеспечением и инструментальными средствами рисования. Интересующую область или несколько областей препарата под микроскопом можно выделить мышью или стилусом, вырезать с помощью лазера и отделить без нарушения целостности для дальнейшего анализа в свободной от посторонних элементов среде (рис. 5.2). Несмотря на то, что системы лазерной захватывающей микродиссекции обладают весьма высокой стоимостью и работа с ними требует высокого уровня подготовки, данный метод с успехом используют в работе с кардиомиоцитами, обеспечивая качественное выделение/изоляцию клеток.

Рис. 5.2. Внешний вид системы лазерной захватывающей микродиссекции

ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ КАРДИОМИОЦИТЫ, ПОЛУЧЕННЫЕ ИЗ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК РАЗНЫХ ТИПОВ

Стволовые клетки - это недифференцированные или малодифференцированные клетки, способные поддержать собственную популяцию и продуцировать по крайней мере один тип коммитированных клеток-предшественников. Стволовые клетки разных типов могут дифференцировать в клеточные компоненты различных тканей и органов; для некоторых из них возможна дифференцировка в миогенном и конкретно кардиомиогенном направлении (т.е. миогенный и кардиомиогенный потенциал).

В клеточной биологии используют широкий спектр методов, обеспечивающих направленную дифференцировку стволовых клеток разных типов в различных направлениях, позволяющих получить из недифференцированных плюрипотентных и низкодифференцированных мультипотентных стволовых клеток функциональные клетки; протоколы дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток в кардиомиоцитарном направлении - одни из наиболее простых и эффективных.

Как эмбриональные стволовые клетки (ЭСК, важнейший ресурс клеточных технологий в целом), так и индуцированные плюприпотентные стволовые клетки (иПСК), первичные половые клетки и клетки эмбриональной карциномы (КЭК) могут быть быстро, дешево и чрезвычайно эффективно дифференцированы in vitro в функциональные кардиомиоциты, обладающие всем характерным комплексом генетических, биохимических и электрофизиологических свойств: возбудимостью, сократимостью, проводимостью и автоматизмом. Данный метод основан на сочетании воздействия механических и биологических факторов, а именно: тесных межклеточных контактов и действия диметилсульфоксида (ДМСО) - биологически активного вещества, эффективно проникающего через биологические мембраны. Для умножения числа межклеточных контактов суспензию недифференцированных стволовых клеток переводят в формат «висячей капли», и клетки активно пролиферируют в питательной среде с высоким

содержанием глюкозы, формируя трехмерные так называемые эмбриоидные тельца, достигающие макроскопических размеров (рис. 5.3). В сочетании с добавлением 1% ДМСО к питательной среде этого вполне достаточно, чтобы запустить дифференцировку плюрипотентных стволовых клеток в кардиомиоцитарном направлении.

После переноса сформированных эмбриоидных телец повторно в адгезионную культуру (на желатиновую подложку) продолжается активная пролиферация коммитированных клеток, которые в течение всего нескольких дней достигают высокого уровня дифференцировки, накапливают сократительные белки и начинают спонтанно сокращаться, сохраняя эту способность в течение относительно длительного времени (рис. 5.4, см. цв. вклейку).

Рис. 5.3. Дифференцировка клеток эмбриональной карциномы линии Р19 в функциональные кардиомиоциты. После 2 дней пребывания недифференцированных клеток (показана адгезионная культура - день 0) в висячей капле формируются трехмерные эмбриоидные тельца, которые затем вновь переносятся в адгезионную культуру, где продолжается активная пролиферация коммитированных клеток, достигающих в течение всего нескольких дней высокого уровня дифференцировки (день 4) и начинающих спонтанно сокращаться Кардиомиоцитарная дифференцировка клеток, обладающих более низким уровнем пролиферативной активности и пластичности, прежде всего мезенхимных стволовых клеток (МСК) разного происхождения (например, МСК костного мозга и жировой ткани), возможна с использованием более сложных протоколов, основанных на применении 5-азацитидина - аналога пиримидинового нуклеозида цитидина, но значительно менее эффективна.

Методы исследования

Современные технологии предоставляют возможность проводить исследования клеток при помощи широчайшего спектра методов. В каждом конкретном случае выбор используемого метода или методов зависит от задач исследования, приборной базы, экспертизы исследователя и др. Ниже приведены основные методы исследования, используемые в клеточной биологии, в том числе в применении к кардиологии.

ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЙ И ИММУНОЦИТОХИМИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ

Иммуногистохимический/иммуноцитохимический метод анализа - метод морфологической диагностики, в основе которого лежат визуализация и оценка с помощью микроскопа результатов реакции антиген-антитело в образцах ткани (иммуногистохимический анализ - ИГХ) или клеток (иммуноцитохимический

анализ - ИЦХ). Антигены представлены (экспрессированы) на внешней клеточной мембране или в цитоплазме клеток, а также в межклеточном веществе ткани. Именно совокупность антигенов определяет характерный биомаркерный профиль при проведении ИГХ/ИЦХ анализа конкретных образцов.

Антитела получают из сыворотки крови иммунизованных животных (поликлональные антитела) или из культуры тканей гибридомы, образованной слиянием клеток

плазмоцитарной опухоли и активированных антигеном В-лимфоцитов (моноклональные антитела). Способ окрашивания образцов клеток и тканей при помощи специфических меченных флуоресцентной краской антител с последующим микроскопическим исследованием используют с середины ХХ в. Принципиальное отличие иммуногистохимии от других методов иммунологической диагностики, также использующих реакцию антиген-антитело, - структурная специфичность исследований, т.е. возможность оценки не только наличия сигнала и его интенсивности, но и пространственного распределения сигнала в гистологическом препарате. В отличие от многих других типов клеток, кардиомиоциты несут относительно обширную панель специфических маркеров, многие из которых используют в ИГХ/ИЦХ исследованиях - тропомиозин, тропонин I, актинин, предсердный натриуретический пептид, предсердная и желудочковая форма легкой цепи миозина, тяжелая цепь миозина β, тяжелая цепь миозина 6 (MYH6), коннексин 43, ISL1, Nkx2-5, Т-бокс 1 (TBX1) и др.

Технология проведения ИГХ/ИЦХ исследования состоит из нескольких основных этапов, включающих фиксацию препарата, окраску образцов, отмывкок и микроскопический анализ. При работе с адгезионными культурами подготовка препарата для исследования - весьма простая процедура, заключающаяся в многократном промывании клеток чистым буфером (для отмывки компонентов питательной среды, включая сыворотку, способную блокировать реакцию со специфическими антителами) и кратковременной фиксации клеток 4% раствором парафольмальдегида (ПФА). В некоторых случаях используемые для культивирования клеток in vitro пластиковые поверхности допускают проведение ИГХ/ИЦХ непосредственно, с низким уровнем фонового сигнала. В других случаях требуется предварительный перенос клеток со стандартного пластика на специальный либо на стекло, что, в свою очередь, иногда требует дополнительной обработки культуральной поверхности (желатинизации, коллагенизации и др.).

Несколько более сложна работа с микроскопическими фрагментами ткани/агрегатами клеток, находящимися в суспензии: для предотвращения их разрушения перед окраской необходима дополнительная обработка, заключающаяся в насыщении таких структур концентрированным раствором сахарозы. При работе с тканями проводят их фиксацию большим объемом ПФА; возможна также фиксация всех органов и тканей большого круга кровообращения животных при помощи перистальтического насоса (метод перфузии).

Окраску образцов тканей и клеток проводят с использованием широкого спектра протоколов, оптимизацию которых при использовании коммерческих антител проводит их производитель. Обычно образцы пермиабилизируют раствором Тритона-Х и блокируют раствором сыворотки животных (лошадиной, мышиной или кроличьей), используемой затем для разведения первичных антител до рекомендованной концентрации, которая может широко варьировать. Образцы инкубируют с первичными антителами при комнатной температуре в темноте, затем промывают раствором сыворотки соответствующего животного и инкубируют с конъюгированными с флуорохромами вторичными антителами соответствующих типов, которые также разводят в сыворотке соответствующего животного. После инкубации образцы вновь промывают и при необходимости докрашивают 4',6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI), широко используемым ядерным красителем. Микроскопическое исследование проводят с использованием флуоресцентных микроскопов; изображения регистрируют сопряженной системой видеорегистрации и затем анализируют.

ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОЛИФЕРАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ КЛЕТОК

Функциональные кардиомиоциты взрослых не обладают пролиферативной активностью, однако она присуща неонатальным кардиомиоцитам, клеткам-предшественникам кардиомиоцитов и клеткам на более низком уровне дифференцировки (рис. 5.5, см. цв. вклейку). Снижение уровня пролиферативной активности наблюдают при атрофических процессах и в результате различных патологических воздействий; в культуре in vitro - при неоптимальных условиях культивирования. В связи с этим изучение динамики пролиферации клеток-предшественников кардиомиоцитов и миогенных стволовых клеток в культуре in vitro имеет большое практическое значение.

Ключевые методы оценки пролиферативной активности клеток in vitro - построение кривых роста популяций и расчет времени удвоения популяции клеток, а также количества клеток-предшественников в популяции, анализ распределения клеток по фазам клеточного цикла методом цитофлуориметрии в потоке, инкорпорация бромдезоксиуридина (БДУ), видеомикроскопия и окраска Ki67. Как и в других случаях, выбор конкретных методов исследования определяется особенностями эксперимента.

Метод построения кривых роста популяций позволяет оценить количество вновь образовавшихся клеток. Для этого проводят подсчет общего количества клеток в культуре на каждом пассаже. Построение кривой роста проводят прямым соотношением общего числа МСК в культуре с числом дней культивирования. Время удвоения популяции МСК рассчитывают по формуле:

Тудв = (Т2-Т1) / [(Log10N2 - Log10N1) × 3,32],

где N2 - количество собранных клеток, N1 - количество посаженных клеток, Т2-Т1 - время между пассажами.

Оценку количества клеток-предшественников (колониеформирующих единиц) в популяции проводят методом серийных разведений.

Распределение популяции клеток по фазам клеточного цикла (по содержанию ДНК) изучают с помощью однопараметрического анализа методом цитофлуориметрии в потоке. Метод основан на связывании молекулы ДНК с красителем йодид пропидия (PI), при этом интенсивность сигнала PI прямо пропорциональна количеству ДНК в клетке. Большая часть клеток на диаграммах находится в стадии G0/ G1 и содержит одинарный набор ДНК (пик слева). Клетки в стадии G2/M соответствуют пику справа и содержат удвоенный набор ДНК. Клетки, расположенные между пиками, находятся в стадии S и активно реплицируют ДНК.

Применение метода инкорпорации БДУ основано на способности БДУ заменять тимидин в процессе репликации ДНК и встраиваться в новую ДНК при репликации клеток. Возможно использование красителя БДУ в двух приложениях - цитофлуориметрии в потоке и ИЦХ, как описано в соответствующих разделах. Недостаток метода - высокая канцерогенность БДУ.

Другой способ оценки пролиферативной активности клеток основан на применении сукцинимидильного эфира диацетата карбоксифлуоресцеина (CFSE), представляющего собой нефлуоресцирующий зонд, растворимый в липидах и легко проникающий в клетки благодаря наличию ацетатных группировок. В цитоплазме внутриклеточные эстеразы отщепляют от молекулы CFSE ацетатные группировки, в результате чего образуется флуоресцентный продукт, не способный пассивно диффундировать через мембрану. Образовавшийся флуоресцентный эфир задерживается в цитоплазме и ковалентно

связывается с внутриклеточными молекулами. Благодаря такому связыванию CFSE сохраняется в клетках в течение длительного времени. При каждом цикле клеточного деления флуоресцентная метка наследуется дочерними клетками (относительная интенсивность флуоресценции на клетку снижается вдвое), что позволяет проследить за пролиферацией клеток и идентифицировать до 7-10 клеточных поколений. В отличие от других реагентов, использующихся для оценки пролиферации (БДУ, Н3-тимидин), CFSE не обладает токсичностью и не нарушает функцию и рост клеток. Флуоресценцию клеток регистрируют с помощью проточного цитометра. Поскольку флуоресцентный эфир способен задерживаться в цитоплазме только в случае, если мембрана клетки сохранила свою интактность, CFSE можно также использовать и для оценки жизнеспособности клеток. Живые клетки, накапливающие CFSE, имеют интенсивную флуоресценцию и легко отличаются от тусклых или нефлуоресцирующих некротических клеток.

Аналогичный метод «деления красителя» используют и при оценке пролиферативной активности клеток с помощью PKH26 (Sigma). PKH26 - липофильный флуоресцентный краситель, способный необратимо связываться с клеточными мембранами. Данный краситель широко используют в нескольких приложениях, в том числе и для точной количественной оценки пролиферативной активности клеток in vitro. Окрашивание PKH26 применяют на различных типах культивируемых клеток. Его преимущество заключается в том, что с его помощью можно окрашивать как клетки, находящиеся в суспензии, так и в монослое, что особенно удобно при работе с культурами адгезивных клеток. PKH26 не проникает в окружающие клетки, не оказывает отрицательного эффекта на пролиферацию клеток и их биологическую активность. При делении клеток, инкорпорировавших PKH26, каждая дочерняя клетка получает половину красителя от родительской клетки. При анализе с помощью цитофлуориметрии в потоке возможно определить количество клеток, прошедших различное число циклов деления (до 7). Метод окраски на белок Ki67 (он же MKI67) - широко используемый маркер клеточной пролиферации. Во время интерфазы антиген Ki67 может быть выявлен в ядре, в то время как во время митоза большая часть белка расположена по поверхности хромосом. Белок Ki67 экспрессируется во всех фазах клеточного деления (G1, S, G2 и митоз) и отсутствует в неделящихся клетках (фаза G0).

Для органотипических культур тканей используют также оценочный метод расчета индекса площади (ИП) роста клеток, который рассчитывают как отношение площади всего эксплантата (включая периферическую зону роста) к площади центральной зоны. Значения ИП выражают в условных единицах, сравнивая с контролем.

ИССЛЕДОВАНИЕ ПЛАСТИЧНОСТИ КЛЕТОК

Прогениторные и стволовые клетки на разных уровнях дифференцировки обладают разным уровнем пластичности, в некоторых случаях определяющих и возможность кардиомиоцитарной дифференцировки. Эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) - плюрипотентные, однако, например, для мезенхимных стволовых клеток (МСК) разного происхождения дефолтными путями дифференцировки является дифференцировка в хондроциты, остеоциты, адипоциты и клетки скелетно-мышечной ткани, а минорными путями - в кардиомиоциты, эндотелиоциты, глиальные клетки и нейроны. Выше были приведены принципы, лежащие в основе протоколов дифференцировки стволовых клеток разных типов в кардиомиоциты; дифференцировка таких клеток в иных направлениях подтверждает их пластичность на разных этапах протокола. Традиционный метод контроля уровня пластичности эмбриональных стволовых клеток - формирование ими у лабораторных животных тератомы, доброкачественной опухоли,

способной содержать клетки 1-3 зародышевых листков с включением их дифференцированных дериватов (рис. 5.6, см. цв. вклейку). Для дифференцировки ЭСК в конкретных направлениях используют широкий спектр методов, в целом сходных с приведенными ниже для МСК, обладающих более низким уровнем пластичности и являющихся уже не плюрипотентными, а мультипотентными стволовыми клетками. Для анализа пластичности МСК обычно используют дифференцировку культур этих клеток в дефолтных направлениях - хондрогенном, остеогенном и адипогенном.

Дифференцировку МСК в остеогенном направлении стимулируют добавлением в среду культивирования дексаметазона, аскорбиновой кислоты, β-глицеролфосфата и культивируют в присутствии индукторов дифференцировки в течение 20-21 дней. Дифференцировку МСК в адипогенном направлении стимулируют добавлением в среду культивирования инсулина, дексаметазона и 3-изобутил-1-метилксантина и культивируют в присутствии индукторов дифференцировки в течение 2 нед. Дифференцировку МСК в хондрогенном направлении стимулируют добавлением в среду культивирования (с повышенным содержанием глюкозы) трансформирующего фактора роста β3 (TGF-P3) и культивируют в присутствии индуктора дифференцировки в течение 7-21 дней. Возможно проведение исследования дифференцировки МСК и в нейральном/нейрональном направлении, основанном на добавлении в среду культивирования ретиноевой кислоты (РК) и трихостатина А (ТСА) либо ретиноевой кислоты и β-меркаптоэтанола (βМЕ, 2-МЕ) соответственно, с культивированием в присутствии индукторов дифференцировки в течение 12 и 7 дней соответственно.

Эффективность протоколов направленной дифференцировки клеток обычно оценивают окрашиванием культуры красителем «Alizarin R» (для остеогенной дифференцировки), «Oil Red O» (для адипогенной дифференцировки), толуидиновым синим и гематоксилином (для хондрогенной дифференцировки) соответственно. Количественную оценку проводят после обработки снимков полученных препаратов расчетом относительной площади окрашенной поверхности препарата к площади окрашенной поверхности.

Кроме того, широко используют методы ИЦХ, основанные на применении антител, специфичных для конкретных типов клеток, например антител к коллагену II для клеток хряща, глиофибриллярный кислый белок (GFAP) для незрелых глиальных клеток, нейрофиламент М (NF-M) и Tau-1 для всех нейральных клеток, тубулин-Ш-β (также β-3- тубулин) для незрелых нейронов.

Кроме того, и для качественного, и для количественного анализа эффективности дифференцировки клеток широко используют метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) с обратной транскрипцией (ПЦР-ОТ); при этом применяют праймеры, специфичные к конкретным биомаркерам типов клеток-мишеней.

ИССЛЕДОВАНИЕ СЕКРЕТОРНЫХ СВОЙСТВ КЛЕТОК

Многие механизмы межклеточных взаимодействий основаны на секреции клетками растворимых факторов. Сложные коктейли секреторных факторов определяют ход ремоделирования тканей, адаптации, регенерации, процессы клеточного роста и дифференцировки, программируемой клеточной гибели. Секреторные факторы связываются со своими рецепторами, которые локализуются на поверхности клетокмишеней - тканевых и циркулирующих.

Изучение секреторных свойств клеток, качественных и количественных параметров так называемого секретома клеток - совокупности секретируемых клетками конкретного

типа факторов - имеет большое практическое значение, поскольку белковые факторы могут эффективно использоваться как для модулирования физиологических свойств клеток в культуре in vitro, так и для осуществления специфических разнонаправленных воздействий на ткани и клетки in vivo, в том числе в формате лекарственной терапии. Хорошо известно, что чрезвычайно высокую секреторную активность имеют МСК. Предполагают, что именно на этом, а не на дифференцировке МСК в функциональные кардиомиоциты основан положительный эффект применения МСК в лечении ХСН. Более того, и собственно кардиомиоциты (точнее, некоторые их популяции) секретируют относительно широкий спектр пептидных и белковых факторов разной природы, включая альдостерон, предсердный натрийуретический пептид, интерлейкины 1, 6 и 11(IL1, IL6, IL11), факторы LIF, CT-1, CNTF, BDNF, GDNF, фактор некроза опухолей α,

кардиотрофин и кардиотрофиноподобный цитокин (CLC), ангиотензиноген (AGT) и др.

Один из методов исследования секреторных свойств клеток - проведение ПЦР-ОТ с праймерами, специфичными к генам, кодирующим секреторные белки; однако чаще используют метод иммуноферментного анализа (ИФА). Данный метод был разработан в середине 60-х годов ХХ в.; он основан на специфическом связывании антитела с антигеном, при этом один из компонентов конъюгирован с ферментом. В результате реакции с хромогенным субстратом образуется окрашенный продукт, количество которого можно определить спектрофотометрически. Существует чрезвычайно большое число вариантов этого метода (конкурентные и неконкурентные, гомогенные и негомогенные, прямые и обратные), что обусловлено разнообразием объектов исследования и широким кругом задач. Однако во всех случаях технология ИФА предусматривает стадию узнаваемого тестируемого соединения специфическим к нему антителом (что ведет к образованию иммунного комплекса), стадию формирования связи конъюгата с иммунным комплексом или свободными местами связывания и стадию превращения ферментной метки в регистрируемый сигнал. При этом метод ИФА не только высокоспецифический, но и высокочувствительный: отдельные варианты твердофазного ИФА позволяют выявлять в образце даже единичные молекулы.

ИССЛЕДОВАНИЕ ЭЛЕКТРОФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ КЛЕТОК

Электрофизиология - раздел физиологии, изучающий электрические явления в организме на макро- и микроуровне, от организменного уровня до исследования биоэлектрической активности, опосредованной ионными процессами в синапсах и мембранах отдельных клеток и волокон. Особые свойства кардиомиоцитов определяют важность и обширность этой дисциплины в приложении к данным клеткам. Кардиомиоциты ограничены липопротеиновой мембраной, которая является хорошим электрическим изолятором. Разница зарядов между внешней и внутренней стороной мембраны представляет собой мембранный потенциал. Мембранный потенциал покоя кардиомиоцита клетки всегда отрицателен, его величина постоянна для каждого типа клеток и колеблется в диапазоне от -60 до -95 мВ.

Электрофизиологические параметры имеют свои особенности в волокнах рабочего миокарда и в волокнах водителей ритма. При этом на электрическую (и опосредованно на механическую) активность сердца влияет большое количество факторов самой разной природы, которые модулируют параметры потенциала покоя, потенциала действия (амплитуду, длительность, крутизну нарастания), скорость проведения, крутизну пейсмекерного потенциала. Показательно, что клетки-предшественники кардиомиоцитов

имеют разные электрофизиологические характеристики на разных этапах дифференцировки.

Современные технологии позволяют исследовать электрофизиологические свойства кардиомиоцитов и их предшественников в культуре in vitro не только в физиологических, но и в моделируемых патологических условиях, при воздействии лекарственных субстратов и др. Ключевые методы исследования электрофизиологических свойств клеток - метод фиксации потенциала и так называемый метод пэтч-кламп (метод локальной фиксации потенциала).

Метод фиксации потенциала основан на использовании электронной системы с обратной связью, которая обеспечивает автоматическое поддержание мембранного потенциала. Разность потенциалов по разные стороны мембраны фиксируют на определенном уровне, при этом мембранный потенциал можно ступенчато изменять на определенную величину. Этот метод позволяет измерить ионные токи, протекающие сквозь мембрану через каналы, которые активируются при изменении потенциала.

Еще большую ценность имеет метод «пэтч-кламп», позволяющий осуществлять локальную (точечную) фиксацию мембранного потенциала и измерять токи через одиночные ионные каналы. Данный метод позволяет, в частности, регистрировать токи и потенциалы от клеток очень малых размеров (3-10 мкм), регистрировать токи одиночных каналов амплитудой порядка пикоампер, исследовать действие ЛС при быстром подведении их как к наружной, так и к внутренней стороне мембраны.

МАРКЕРНЫЙ АНАЛИЗ КЛЕТОЧНОГО СТАРЕНИЯ

Старение определяет совокупность изменений, которые постепенно и необратимо приводят к гибели организма. Длительность процессов старения в организме делает затруднительным их изучение in vivo, однако старение организма обусловлено старением в нем клеток, и работа с клеточными культурами дает возможность изучать многие важнейшие механизмы, лежащие в основе старения в целом.

Как известно, соматические клетки высших эукариот, как правило, имеют ограниченную способность к пролиферации, именно в этом состоит одно из ключевых отличий соматических клеток от стволовых. Постепенное снижение скорости пролиферации клеток in vitro (приводящее в конечном счете к ее остановке) называют клеточным (репликативным) старением. Стареющие клетки сохраняют жизнеспособность и метаболическую активность в течение длительного времени, но необратимо теряют способность синтезировать ДНК в ответ на стимуляцию сывороткой или факторами роста.

Важная область исследований - изучение динамики экспрессии генов в стареющих клетках. Показательно, что состояние транскриптома весьма динамично даже в таких высокоспециализированных клетках, как клетки сердечной мышцы. Ориентировочно анализ клеточного старения в образцах проводят не молекулярно-генетическими методами исследования, а с помощью расчета доли в общей популяции клеток, экспрессирующих лизосомальную гидролазу β-галактозидазу - одного из немногих удобных для использования маркеров клеточного старения.

Более специфические биологические маркеры репликативного старения включают компоненты сигнальных путей, которые индуцируют и поддерживают состояние старения (например, ингибиторы циклинзависимых киназ р16 и р21), маркеры