6 курс / Клинические и лабораторные анализы / Лабораторная_диагностика_туберкулеза_Ерохин_В_В_ред_

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

•Культивирование на жидких средах и молекулярно-генетиче- ские методы рассматриваются в качестве международных золотых стандартов, включаемых в лабораторную практику, но не исключают традиционные культуральные методы.

•Обработка диагностических образцов для посева на плотные или жидкие среды, манипуляции с положительной культурой (на плотных и жидких средах) для идентификации или определения лекарственной чувствительности нуждаются в соблюдении мер безопасности и технической оснащенности, обеспечивающих необходимый минимум для работы в условиях среднего риска заражения туберкулезом.

•Исследования на лекарственную чувствительность подходят для среднего лабораторного уровня и нуждаются в мерах безопасности, обеспечивающих необходимый минимум для работы в условиях высокого риска заражения туберкулезом.

•Определение чувствительности к препаратам основного ряда должно проводиться для подтверждения\исключения МЛУ МБТК.

•Определение чувствительности к препаратам резервного ряда должно проводиться для всех изолятов МБТК с МЛУ.

•Решение о внедрении новых технологий в области диагностики туберкулеза должно приниматься после проведения исследований в референс-центрах и в тесном сотрудничестве со специалистами в области лабораторной диагностики туберкулеза.

Заключительная часть (5 мин)

Эффективность применения методов последнего поколения в лабораторной диагностике туберкулеза основана на комплексном использовании культуральных и молекулярно-генетических методик. Решающими преимуществами этих методов являются быстрота выполнения анализа. Именно это и является основой при выборе методологических подходов, пригодных для выявления бактерий рода Mycobacterium.

Использование комплексного подхода к диагностике способствует быстрому определению индивидуальных спектров лекарственной устойчивости возбудителя, на основе которых назначается адекватный режим химиотерапии. В результате сокращаются сроки абациллирования пациента, время пребывания больного в стационаре, снижаются материальные затраты, реабилитация больного проходит в более короткое время, что способствует повышению эффективности лечения и предотвращению распространения лекарственно-устойчивых штаммов микобактерий.

228

	Современные приборы, применяемые при микробиологиче-
	ских и молекулярно-генетических исследованиях, в значительной
	степени автоматизируют проведение большинства этапов иссле-
	дований, минимизируя трудозатраты и возможность негативного
	влияния «человеческого фактора» на качество исследования, а
	также риски инфицирования персонала.
	Необходимо учитывать, что непрерывное развитие технологий
	в области диагностики туберкулеза неизбежно приведет к появле-
	нию новых методов, позволяющих с минимальными трудозатра-
	тами и в кратчайшие сроки проводить выявление, идентификацию
	и определение ЛУ. Усовершенствованные методы лабораторных
	исследований на первом этапе будут внедряться на уровне рефе-
	ренс-лабораторий, а в случае подтверждения высокой эффектив-
	ности методики, и в лабораториях более низких уровней.
	Рекомендуемая литература
	1. Лунин В.Г., Тополян А.А., Колупаев В.Е., Сердобинский Л.А.
	Организация работы лаборатории, использующей для проведе-
	ния исследований метод полимеразной цепной реакции с де-
	текцией в режиме реального времени. Методические рекомен-
	дации. – Тверь: Триада, 2008. – 24 с.
	2. Методические указания (МУ 1.3.1888-04) «Организация работы
	при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного
	патогенными биологическими агентами III–IV групп патоген-
	ности».
	3. Методические указания (МУ 3.5.5.1034-01) «Обеззараживание
	исследуемого материала, инфицированного бактериями I–IV
	групп патогенности, при работе методом ПЦР» – М., 2001.
	4. Приказ МЗ РФ от 21.03.03 № 109 «О совершенствовании про-
	тивотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации»
	5. Приказ МЗиСР от 29 декабря 2010 г. 1224н «Порядок оказания
	медицинской помощи больным туберкулезом в Российской		материалы
	Федерации»
	6. Ребриков Д.В., Саматов Г.А., Трофимов Д.Ю. и соавт. ПЦР «в
	реальном времени». Под ред. Д.В. Ребрикова, – изд 2-е, испр.		Лекционные
	возможности проведения работ с возбудителями инфекцион-
	и доп. – М.: БИНОМ. Лаборатория знаний. – 2009. – 223 с.
	7. Санитарно-эпидемиологические правила (СП 1.2.1318-03) «По-
	рядок выдачи санитарно-эпидемиологического заключения о
	ных заболеваний человека I–IV групп патогенности (опасно-		1.
	сти), генно-инженерно-модифицированными микроорганиз-		РАЗДЕЛ
	мами, ядами биологического происхождения и гельминтами».

229

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

8.Санитарно-эпидемиологические правила и нормативы СанПиН 2.1.3.2630-10 «Санитарно-эпидемиологические требования к организациям, осуществляющим медицинскую деятельность». – М., 2010.

9.Санитарно-эпидемиологические правила и нормативы СанПиН 2.1.7.2790-10 «Санитарно-эпидемиологические требова-

ния к обращению с медицинскими отходами». – М., 2010. 10.Санитарно-эпидемиологические правила СП 1.3.2322-08 «Без-

опасность работы с микроорганизмами III–IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней».

11.Санитарно-эпидемиологические правила СП 3.1.1295-03 «Профилактика туберкулеза от 25.06.2003 г.

12.Санитарные правила (СП 1.2.036–95) «Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I–IV групп патогенности». Госкомсанэпиднадзор России. Москва, 1995.

13.Семина Н.А., Ковалева Е.П., Акимкин В.Г., Храпунова И.А., Селькова Е.П. Профилактика внутрибольничного инфицирования медицинских работников. Практическое руководство // М.: Издательство РАМН, 2006. – 152 с.

14.Указание первого заместителя Министра здравоохранения Российской Федерации, Главного государственного санитарного врача Российской Федерации № 1013-У от 25.08.2003 г. «Об организации исследований по диагностике тяжелого острого респираторного синдрома (SARS) и других инфекционных заболеваний методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в центрах госсанэпиднадзора».

15.Федеральный закон «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения», (В редакции ФЗ от 30 декабря 2001, №196ФЗ). – М.: 2002. – 48 С.

16.Черноусова Л.Н. Алгоритм микробиологических исследований для диагностики туберкулезной инфекции. Методическое пособие для врачей (сокращенный вариант) // Туберкулез и болезни легких. Нью-терра. – 2011. – №11. – С. 58–67

17.Черноусова Л.Н., Севастьянова Э.В., Андреевская С.Н., Ларионова Е.Е., Смирнова Т.Г. Алгоритм микробиологических исследований для диагностики туберкулезной инфекции. Методическое пособие для врачей №УМО-17-28/248 от 12.07.2011 М. – 2011. – С. 52

18.Шухов B.C., Рюмина И.И. Безопасность на рабочих местах в лечебно-профилактических учреждениях / Профилактика риска профессионального инфицирования вирусами гепатитов

230

В, С, ВИЧ // Пособие для медицинских работников. – М., 2008.

– 79 с.

19.Automated real-time nucleic acid amplification technology for rapid and simultaneous detection of tuberculosis and rifampicin resistance. Xpert MTB/RIF system. Policy statement. WHO/HTM/TB/2011.4 20. Laboratory Services in Tuberculosis Control. Parts I–III. –

Geneva, WHO, 1998.

21.Rapid implementation of the Xpert MTB/RIF diagnostic test. Technical and operational “How to” Practical considerations. WHO/HTM/TB/2011.2

22.Stop TB Partnership. The Global Plan to Stop TB 2011–2015: transforming the fight towards elimination of tuberculosis. Geneva, World Health Organization, 2010 (WHO/HTM/STB/2010.2).

23.The public health service national reference tuberculosis and the national laboratory network. Minimum requirements, role and operation in a low-income country. International union against tuberculosis and lung disease, 1998

24.WHO. 62nd World Health Assembly. Prevention and control of mul- tidrug-resistant tuberculosis and extensively drug-resistant tuberculosis. WHA62.15. 8th plenary meeting, May 22, 2009. A62/VR/8. http://www.who.int/tb/features_archive/wha62_15_tb_resolution/e n/index.html. (Accessed 12 January 2012)

25.WHO. Guidelines for the programmatic management of drug-resis- tant tuberculosis. 2011 Update. WHO/HTM/TB/2011.6. Geneva, Switzerland: WHO, 2011.

26.WHO. Policy guidance on drug susceptibility testing (DST) of sec- ond-line anti-tuberculosis drugs. WHO/HTM/TB/2008.392

27.WHO. Policy Statement on Non-commercial Culture and DST Methods for rapid screening of Patients at Risk of Multidrug-resistant Tuberculosis. WHO, Geneva, 2010. Available at:http://www.who.int/tb/dots/laboratory/policy/en/print.html).

28.WHO. Policy Statement. Molecular Line Probe Assay for Rapid Screening of Patients at Risk of Multidrug-resistant (MDR) TB. Geneva, WHO,2008. Availableat:http://www.who.int/tb/dots/laboratory/policy/en/print.html).

Материально-техническое обеспечение

Мультимедийная или проекционная демонстрационные системы, экран, лазерная указка; набор тематических слайдов.

РАЗДЕЛ 1. Лекционные материалы

231

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Раздел 2. МЕТОДИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ К СЕМИНАРАМ

Очная часть

Модуль 1. Основные биологические характеристики микроорганизмов рода Mycobacterium

Тема 1.4. «Обзор микробиологических методов изучения микроорганизмов рода Mycobacterium и их место в диагностике туберкулеза»

Количество аудиторных часов – 1

Примерный план семинарского занятия

Вопросы, прорабатываемые на семинаре:

•виды диагностических материалов, правила их сбора и доставки

•основные методы лабораторной диагностики туберкулеза

•роль современных микробиологических методов в диагностике и лечении туберкулеза

•сравнительные чувствительность и специфичность различных методов Цель семинара – формирование современных представлений о

правилах микробиологической диагностики туберкулеза, роли и значении методов в комплексном микробиологическом обследовании больного на этапах диагностики и лечения, возможности и ограничениях различных методов.

При планировании семинара необходимо учесть время для разбора ключевых понятий и дефиниций: бактериоскопические методы, культуральные методы, методы идентификации, методы определения лекарственной чувствительности и т.д.

Вводная часть (5–10 мин)

Ведущий семинара предлагает слушателям разобрать понятия о диагностической и аналитической чувствительности методов, их специфичности. Раскрыть подходы к использованию этих знаний для практических условий и определить область применения этих знаний. Внимание слушателей фиксируют на значении комплексности и последовательности использования микробиологических методов в обследовании пациентов, их роли в диагностике туберкулеза.

Основная часть (30 мин)

Работу в группе начинают с того, что ведущий просит слушателей представить свое видение роли и значения лабораторных ме-

232

	тодов исследования в диагностике туберкулеза и лабораторном со-
	провождении больных. Далее следует задать вопрос о значении
	этих же бактериологических методов (БМ) для национальной про-
	граммы. Следует так же определиться с вопросом о месте и роли
	БМ в различных эпидемиологических программах. Какие методы
	и в каких эпидемиологических программах могут быть использо-
	ваны наиболее продуктивно с точки зрения результатов реализа-
	ции таковых программ. Следует также определить вместе с курсан-
	тами – какие методы бактериологической диагностики являются
	необходимыми и почему, какие их них наиболее продуктивны и
	почему. Определить сроки выполнения методов, их соотносимость
	с другими методами. Определив важные дефиниции, следует сфор-
	мулировать понятия о специфичности и чувствительности мето-
	дов, начиная с методов сбора, регистрации и транспортировки ди-
	агностических материалов.
	Ведущий семинара обращает внимание курсантов на важность
	первого преаналитического этапа в лабораторном обследовании
	пациентов – методов сбора адекватного диагностического мате-
	риала: как и какой диагностический материал должен быть собран
	от больного для достижения корректного и быстрого результата.
	Преподаватель предлагает к обсуждению алгоритмы лаборатор-
	ного обследования пациентов 2–3-х учреждений (анонимно). Ал-
	горитмы обсуждаются слушателями курса, рассматриваются воз-
	можные причины ограничений при назначении (выполнении) тех
	или иных исследований (экономические, материально-техниче-		СЕМИНАРАМ
	ские, ограничения в профессионализме или штатах лаборатории
	и др.). Определяются наиболее приемлемые алгоритмы для лабо-
	раторий разного уровня. По выбору преподавателя рассматрива-
	ется (совместно корректируются) алгоритм лабораторных иссле-		К
	дований практической лаборатории, представитель которой
			МАТЕРИАЛЫ
	является участником интерактивного обсуждения на семинаре.
	Традиционными микробиологическими методами диагно-
	стики туберкулеза являются бактериоскопические и культураль-
	ные исследования. Эти методики сформировались более 50-ти лет		МЕТОДИЧЕСКИЕ
	назад. Более современными методами считаются культивирование
	МБТ в автоматизированных системах, ПЦР-диагностика IS6110
	ДНК фрагмента и некоторые др. Современные методы обяза-
	тельно должны сочетаться с классическими бактериологическими
	методами, так как в ряде случаев имеют существенные ограниче-		2.
	ния в их применении.
			Раздел

233

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Следует также определить место в алгоритме исследований классических и современных бактериологических методов исследований и место активно развивающихся молекулярно-генетиче- ских методов, а так же их взаимосвязь и взаимодополняемость. Предлагается рассмотреть вопрос с точек зрения лабораторной эффективности и экономической целесообразности. Следует учесть также, что в ряде случаев те или иные диагностические методы имеют существенные ограничения в их применении.

Необходимо обратить внимание слушателей на важность качественного сбора диагностических материалов в достаточном для проведения комплексных исследований объеме. Привести примеры из практики, когда работа по нормализации сбора и доставки диагностического материала (мокроты) значительно увеличивала в итоге результативность исследований.

Переходя к методам световой микроскопии по ЦН, следует определить ее преимущества (быстро, специфично и доступно) и недостатки (чувствительность ограничена возможностью обнаружения от 5000 микробных клеток в 1 мл материала). Следует обсудить с курсантами возможные пути увеличения результативности этого вида исследований на примере увеличения кратности исследований (при серийных исследованиях результативность бактериоскопии повышается: при исследовании 1-го препарата на 80– 83%, 2-ого – на 10–14% больше и при исследовании 3-его препарата – еще на 5–8% больше). Обратить внимание, что таким образом кратные исследования повышают диагностическую чувствительность метода.

Возможно (в зависимости от степени подготовленности целевой аудитории) будет необходимо кратко остановиться на основных причинах, определяющих высокую эффективность бактериоскопических исследований в ЛПУ ПМСП и ПТУ, а также путях ее достижения.

Принимая во внимание, что в основном на курсе будут присутствовать бактериологи из ПТУ, следует обсудить общие характеристики и преимущества бактериоскопического выявления КУМ с окраской флюорохромами для люминесцентной микроскопии. Обратить внимание слушателей, что данный метод позволяет достичь наилучших результатов микроскопии (повышение эффективности микроскопии на 10–15%).

В последнее время в практике нашла применение и LED-мик- роскопия. Ее использование еще достаточно ограничено. Возможно, что часть слушателей имеют недостаточные знания о ее

234

преимуществах и особенностях. В этой связи рекомендуется более подробно остановиться на рекомендациях по данному виду микроскопии.

Вместе с тем, следует подчеркнуть, что бактериоскопические методы обладают высокой специфичностью (89–100%), а по числу ложнопозитивных результатов метод люминесцентной микроскопии и метод ЦН практически не различаются. Следует отметить, что при микроскопическом исследовании препарата нельзя определить видовую принадлежность выявленных КУМ: метод позволяет дать заключение лишь о наличии или отсутствии в препарате кислотоустойчивых микроорганизмов. Видовая же идентификация МБ возможна только при выделении из диагностического материала культуры МБ.

Метод посева, или культуральный метод выявления МБ отличается большей чувствительностью, чем метод микроскопии и имеет ряд преимуществ. Он позволяет обнаруживать МБ в исследуемом материале от нескольких десятков жизнеспособных особей возбудителя. Культуральное исследование позволяет верифицировать туберкулез на более ранних стадиях заболевания. Предлагается обсудить преимущества культуральных исследований, а также цель бактериологического обследования. Обсуждается чувствительность и специфичность лабораторных методов диагностики (представлено в табл. 1).

Табл. 1

Чувствительность и специфичность лабораторных методов диагностики туберкулеза

	Характеристика ме-		Микроскопия		Культуральные		ПЦР IS
	тода		Световая	Люминес-	Классиче-	BACTEC	6110
				центная	ские	MGIT 960
		Чувств.	5000	1000	30–50	20–30	10–50
	Аналитиче-		КУМ/мл	КУМ/мл	КУМ/мл	КУМ/мл	КУМ/мл
	ская	Специф.	95–97%	95–97%	97%	92–95%	92–97%
	Диагности-	Чувств.	50–78	70–80	72–82	75–88	75–92
	ческая (%)	Специф.	92–95	92–95	92–95	88–92	94–99
	Время анализа		2–3 часа	1 день	31 дн.	12 дн.	2 дня
					(24–80)	(5–42)

Раздел 2. МЕТОДИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ К СЕМИНАРАМ

235

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Обсуждается роль методов определения лекарственной чувствительности микобактерий. Определение спектра и степени чувствительности МБ к ПТП имеет важное значение для тактики химиотерапии больных, контроля эффективности лечения, определения прогноза заболевания и эпидемиологической оценки распространения туберкулеза с лекарственной устойчивостью. Кроме того, мониторинг лекарственной устойчивости позволяет оценивать эффективность противотуберкулезной программы в целом, являясь интегральным показателем работы всех составляющих противотуберкулезных мероприятий.

В связи с распространением ВИЧ инфекции обсуждается значение методов дифференциации микобактерий комплекса M.tuberculosis. Принимая во внимание, что используемые питательные среды не являются строго селективными, последующая дифференциация выделенных МБ признается обязательной. Признано, что первичная идентификация МБ комплекса M.tuberculosis от НТМБ осуществляется по культуральным характеристикам. Более точная идентификация осуществляется генетическими, биохимическими, иммунохроматографическими методами и др.

Эффективность использования лабораторно-диагностических методов предлагается оценить в следующих задачах.

Ситуационная задача 1.

Рассчитать чувствительность, специфичность методов микроскопии и культуральных исследований на примере некоторых районов области Х. Известно общее число обследованных пациентов, число больных с подтвержденным диагнозом, число положительных исследований по микроскопии и культуральным исследования.

Комментарии к задаче 1.

Для начала напомнить дефиниции. Далее следует узнать число впервые выявленных больных и рассчитать искомые значения характеристик для каждого из методов.

Ситуационная задача 2.

Рассчитать индикатор «Доля впервые выявленных (Вв) больных туберкулёзом с положительным результатом микроскопии мокроты, выявленных в ОЛС (%)» и на примере конкретных районов определить эффективность работы ЛПУ.

236

Комментарии к задаче 2.

Источник информации для расчета показателя: Форма № 7-ТБ «Сведения о впервые выявленных больных и рецидивах заболеваний туберкулезом».

Методика расчета показателя:

Целевое значение показателя – 60%

Заключительная часть (5 мин)

Бактериовыделение, получаемое в результате бактериологических исследований, является исключительно важным фактом в верификации диагноза инфекционных заболеваний. Данное наблюдение позволяет быть уверенным, что бактериологическая диагностика останется важным компонентом в комплексной диагностике ТБ и микобактериозов в перспективе. Использование бактериологических методов должно постоянно оцениваться по их эффективности, что является обязательным элементом контроля качества проводимых исследований.

Подводя итог, обращается внимание слушателей на основные особенности методов лабораторной диагностики туберкулеза, их возможности в диагностике, правила их использования, их место и значение в алгоритме обследования больных туберкулезом на разных этапах стационарного и амбулаторного лечения.

Рекомендуемая литература

1.Литвинов В.И., Макарова М.В., Краснова М.А. Нетуберкулезные микобактерии. – М.: МНПЦБТ, 2008. – 256 с.

2.Национальное руководство ФТИЗИАТРИЯ. Под общей ред. М.И. Перельмана. – М.: ГЕОТАР-Медиа, 2007. – 512 с.

3.Определитель бактерий Берджи. – М., "Мир", 9-е издание, 1997, т.2, С. 606–612

4.Оттен Т.Ф., Васильев А.В. Микобактериоз.– СПб: Медицинская пресса, 2005. – 224 с.

5.Руководство по медицинской микробиологии. Частная медицинская микробиология и этиологическая диагностика инфекций. Книга II. Под ред. Лабинской А.С., Костюковой Н.Н., Ивановой С.М. – М.: Издательство БИНОМ, 2010. – 1152 с.

6.Туберкулез. Патогенез, защита, контроль: пер. с англ./под ред. Барри Р. Блума.– М.: Медицина, 2002.– 696 с.

7.Emerging Infections 5. Ed. by W.M. Scheld, W.A. Craig, J.M. Hughes/ ASM Press, Washington, 2001. – chp9. – P. 137–152.

Раздел 2. МЕТОДИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ К СЕМИНАРАМ

237