Изобретение
•1955 г. - открытие ДНК-полимеразы
•Принцип ПЦР сформулировал Гобинд Корана в 1971
•1975 г. - открытие Thermus aquaticus
•В 1983 Кэри Мюллису удалось провести
•ПЦР 1985 г. - амплификация
бета-глобина
•В 1993 за изобретение
ПЦР Кэри Мюллису вручена Нобелевская премия по химии
Механизм ПЦР
Основные компоненты:
Праймеры
Tag - полимераза
Смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов
Буфер
Анализируемый образец Дополнительные компоненты:
Внутренние контролиДНК - зонды
Стадии постановки ПЦР
Подготовка пробы биологического материала
Амплификация
Детекция в агарозном геле
Пробоподготовка (подготовка пробы биологического материала)
Упрощенные методики (кипячение, протеолиз)
Классическая методика (получение чистого препарата ДНК/РНК)
Сорбция ДНК (GSCN + сорбция ДНК на носителе)
Использование ионообменников
(Chilex)
На чем основана амплификация
•Использование термостабильной полимеразы (Taq-полимераза)
•Полимераза достраивает
специфические затравки (праймеры)
• Процесс состоит из
повторяющихся температурных циклов
Механизм ПЦР
Температурный цикл амплификации состоит из трех этапов:
Денатурация
Отжиг
Элонгация (синтез)
Детекция
Использование интеркаляторов
-Электрофорез
-Real-time машины
Использование праймеров и ДНК- зондов, меченных флуоресцентными
метками
-гибридизация после амплификации
-гибридизация во время амплификации
Стадии
постановки
«классической»
ПЦР
Как все происходит
Экспоненциальная
амплификация
