2 курс / Нормальная физиология / Основы_физиологии_гемостаза_Струкова_С_М_

увеличивается (вследствие инактивации фактора Va, необходимого кофактора фактора Xa).

Причиной этой резистентности к протеину С была единственная мутация в структуре гена фактора V (замена остатка гуанина в положении 1691

нуклеотида на остаток аденина), которая приводила к замене Arg506 на Gln в

молекуле фактора V. Мутантная форма фактора V была названа фактор V

Лейден (по имени города, в котором впервые была обнаружена эта мутация).

Этот дефект обнаружен у 20-50% больных с рецидивирующими венозными тромбозами и венозными эмболиями.

В структуре нормальной молекулы фактора Vа (состоящей из тяжелой и легкой цепей, стабилизированных ионами Са) активированный протеин С расщепляет три пептидные связи в тяжелой цепи в позициях Arg 306, Arg506 и

Arg 679. Инактивация фактора Vа имеет двухфазный характер: быстрая фаза,

обусловленная расщеплением в позиции Arg 506, приводит к потере 50%

активности фактора, а далее следует медленная фаза, связанная с расщеплением при Arg 306. При длительной инкубации фактора Vа с АРС расщепляется связь при Arg 679. Инактивация мутантного фактора V Лейден существенно затруднена в связи с не способностью АPС расщеплять пептидную связь при

Gln506 мутантного фактора V (вместо Arg506 в молекуле нативного фактора V

) и активировать первую фазу процесса. При лечении тромбофилии

(склонности к тромбообразованию) варфарином у больных с наследственным дефицитом протеина С может развиваться осложнение – микротромбоз сосудов кожи, обусловленое недостаточностью РС. Известно, что время полужизни (t1/2)

РС значительно короче по сравнению с t1/2 других факторов протромбинового комплекса. Варфарин подавляет синтез этих витамин К-зависимых факторов и вызывает, прежде всего, резкое снижение концентрации протеина С. Это приводит к временному повышению свертываемости крови и тромбозу сосудов кожи с последующим инфарктом кожи.

Активированный протеин С, связываясь со специфическим рецептором - EPCR, и активируя PAR-1, приобретает новые противовоспалительные и анти-

апоптотические свойства (рис. 3-35). АРС ингибирует освобождение воспалительных цитокинов (в том числе фактора некроза опухоли – TNF ) в

модели воспаления, вызванного эндотоксином ( см .главу 4). АРС связанный с

131

EPCR активирует PAR-1 и блокирует адгезию лейкоцитов, предотвращает инфильтрацию лейкоцитов в ткани, защищает от резкого снижения кровяного давления при введении эндотоксина. Некоторые из этих свойств обусловлены способностью активированного протеина С в комплексе с EPCR и PAR-1

ингибировать активацию транскрипционного фактора NF- B (ядерный фактор

B) и транслокацию в ядро клетки субъединицы NFBр65, ответственной за синтез провоспалительных цитокинов и адгезивных молекул при развитии воспаления. Противовоспалительными свойствами активированного протеина С объясняется его способность снижать гибель экспериментальных животных и смертность пациентов от тяжелого сепсиса.

Подобно активированному протеину С его рецептор – EPCR, также проявляет противовоспалительную активность, поскольку блокирует вход ионов кальция в клетку, транслокацию NF B в ядро и модулирует экспрессию генов (блокируя синтез медиаторов воспаления). EPCR может освобождаться из активированного эндотелия индуцибельной металлопротеиназой и в растворимой форме (sEPCR) обнаруживается в плазме при воспалении. sEPCR

связывает протеиназу 3, подобную эластазе, и комплеке с ней взаимодействует

синтегрином CD11b/CD18 поверхности активированного лейкоцита,

препятствуя его адгезии на эндотелии. Появление свободной формы рецептора АРС может быть составной частью защитных противовоспалительных механизмов( см.главу 4). Исследование кристаллической структуры sEPCR

выявило значительное подобие структуре белков семейства MHC класса 1/CD1,

большинство из которых участвует в процессах воспаления.

Активированный протеин С оказывает цитопротекторное действие на культивируемые эндотелиальные клетки сосудов мозга, предотвращая их апоптоз, вызываемый гипоксией или действием других повреждающих факторов.

Связывание тромбина с тромбомодулином драматически повышает скорость его нейтрализации плазменными ингибиторами, прежде всего,

антитромбином III, взаимодействующим с углеводной цепочкой (хондроитин сульфатом) тромбомодулина. Комплекс тромбина с ингибитором диссоциирует от тромбомодулина, подвергается интернализации и деградации.

132

АРС, наряду с антикоагулянтной, антивоспалительной и антиапоптотической активностями, стимулирует фибринолитическую активность, вызывая освобождение тканевого активатора плазминогена из его комплекса с ингибитором. Тканевой активатор плазминогена превращает профермент плазминоген в сериновую протеиназу – плазмин. Фибринолиз – деградация фибрина под действием плазмина.

Эффективность работы антикоагулянтных регуляторных систем (блокады образования и активности тромбина), а так же системы фибринолиза,

активаторы которого освобождаются из эндотелия, в значительной мере зависит от состояния эндотелия (особенно эндотелия микрососудов), функции которого существенно нарушаются при воспалении (вызванном бактериальной или вирусной инфекцией, травмой или другими причинами), и других патофизиологических процессах.

Ингибирование АРС осуществляют серпины – ингибитор РС – PCI и α-1 AT. PCI весьма необычный ингибитор-субстрат, т.к. имеет два P1 остатка,

Arg354 и Phe353, поэтому способен узнавать и расщеплять оба класса сериновых протеаз – трипсиноподобных и химотрипсиноподобных.

3.4.Фибринолитическая система

3.4.1.Основные компоненты системы фибринолиза

Фибринолитическая система осуществляет фибринолиз – процесс лизиса сгустка фибрина или тромба. Лизис тромба называют тромболизисом.

Ключевой фермент лизиса фибрина – плазмин, сериновая протеиназа, которая образуется из неактивного предшественника – плазминогена при действии физиологических активаторов: тканевого активатора плазминогена (t-PA) и

активатора плазминогена урокиназного типа (урокиназа или u-PA) (табл. 3-7).

Оба активатора плазминогена принадлежат, как и плазмин, к семейству сериновых протеиназ, имеют общий субстрат – плазминоген и общие

133

ингибиторы – ингибитор активаторов плазминогена типа 1 и ингибитор активаторов плазминогена типа 2.

Плазмин расщепляет: фибрин до растворимых продуктов деградации, белки внеклеточного матрикса, активирует другие протеазы и факторы роста. Кроме фибринолиза плазминоген и плазмин участвуют в целом ряде физиологических и патофизиологических процессов, таких как воспаление, миграция клеток,

ангиогенез, заживление ран, овуляция, эмбриогенез, рост опухоли,

метастазирование и атеросклероз.

Таблица. 3- 7

Основные компоненты системы фибринолиза

Белок	Мол	Концентрация	Функция
	масса,	в плазме
	кДа
Плазминоген	92	2 мкМ	Профермент
			плазмина
Тканевой активатор	70	70 пкM	Фермент-
плазминогена			активатор
(t-PA)			плазминогена
Урокиназа	54	40 пкM	Активатор
(u-PA)			плазминогена
Ингибитор активаторов	52	400 пкM	Ингибитор
Плазминогена –1			t-PA и u-PA
(PAI-1)
a2Антиплазмин	70	1 мкМ	Ингибитор
(a2-АП)			плазмина

134

Ингибитор	60	0,075 мкM	Прокарбоксипеп-
фибринолиза,			тидаза,активируется
активируемый			тромбином в
тромбином (TAFI )			комплексе с ТМ
			в ингибитор фибрино-
			лиза –TAFIа.

Плазминоген (Pmg) – гликопротеин, обнаруживается во многих тканях, но больше всего его в плазме крови. Pmg синтезируется в печени, как одноцепочечный полипептид, содержащий 810 аминокислотных остатков, но в процессе секреции теряет N-концевой 19-тичленный пептид. На N-конце Pmg –

глутамат, именуемый Glu-Pmg. Glu-Pmg состоит из N-концевого

(преактивационного) пептида (Glu1-Lys77), пяти крингл-доменов (К1-К5) и

каталитического протеазного домена (Val562-Asn791) (рис. 3-39).

135

РИС 3-39

Структура плазминогена и активаторов плазминогена:

тканевого активатора плазминогена (t-PA) и активатора плазминогена урокиназного типа (u-PA).

Третичная структура плазминогена состоит из: N-концевого пептида,

отщепляемого плазмином, пяти крингл-доменов и каталитического протеазного домена, в котором локализован активный центр. Структура t-PA содержит: N-

концевой пальцевидный домен фибронектина; домен, подобный эпидермальному фактору роста, два крингл-домена и на С-конце молекулы протеазный домен с активным центром фермента. Структура урокиназы содержит: N-концевой домен, подобный EGF-домену, один крингл-домен и С-

концевой протеазный домен.

3.4.2.Особенности превращения плазминогена в плазмин

Такие же кринглы были обнаружены в других белках системы гемостаза:

протромбине, факторе XII, активаторах плазминогена – t-PA и u-PA. Крингл-

домены Pmg отвечают за связывание с субстратами, кофакторами и рецепторами через С-концевые лизин-связывающие участки с высоким сродством (афинностью) связывания. Вследствие этого связывания происходит

136

конформационное изменение молекулы плазминогена, вызванное лигандом, и

ускорение активации профермента в фермент –плазмин.

Участки наиболее высокого сродства остатков лизина локализованы в крингл-доменах 1 и 4 и отвечают за связывание с фибрином, клетками и компонентами внеклеточного матрикса. Лизин-связывающий участок кринга 1

образован гидрофобным ―карманом‖ (полостью), формируемым шестью остатками Pro33/Phe36/Trp62/Tyr64/Tyr72/Tyr74, на дне которого локализован отрицательно заряженный участок (Asp55/Asp57),отвечающий за связывание лизинов фибрина, а на выходе из кармана – положительно заряженный участок

(Arg35/Arg71) (рис. 3-40).

137

РИС 3-40

Модель связывания С- концевого лизина (Lys) фибрина с лизин-связывающим участком крингла 1 плазминогена

При превращении профермента в плазмин тканевым активатором плазминогена – t-PA, или урокиназой -u-PA, расщепляется пептидная связь

Arg561-Val562, что приводит к образованию протеолитически активного фермента, состоящего из тяжелой (А) и легкой (В) цепей, соединенных двумя дисульфидными связями. Каталитическая триада активного центра плазмина локализована в В цепи и образована His603, Asp646 и Ser741.

Конформационные особенности нативной молекулы Glu-Pmg, создающие компактность структуры, обеспечивают защиту расщепляемой связи Arg561Val562 от легкого доступа активаторов плазминогена. Компактность молекулы

Glu-Pmg обеспечивается внутримолекулярными взаимодействиями между N-

концевым пептидом Glu1-Lys77 и кринглом 5, а также между кринглами 3 и 4,

которые отвечают за создание конформации подобной спирали. Кроме того,

удаление плазмином N-концевого пептида и превращение Glu-Pmg в Lys-Pmg

приводит к разворачиванию структуры молекулы, облегчению связывания с фибрином, более быстрой активации Lys-Pmg (t-PA или u-PA), чем Glu-Pmg и

стимуляции фибринолиза.

t-PA – сериновая протеиназа, синтезируется в эндотелии как одноцепочечный гликопротеин, который расщепляется плазмином до двухцепочечной протеиназы. В третичной структуре t-PA обнаружены N-

концевой пальцевидный домен фибронектина, домен, подобный эпидермальному фактору роста (EGF), два крингл-домена и на С-конце молекулы протеазный домен (276–527 а.о.), в котором локализована триада каталитического центра сериновой протеиназы, образованная His322, Asp371 и

138

Ser478 (рис. 3-36). Домены t-PA отвечают за функции фермента: связывание с фибрином, фибрин-специфическую активацию плазминогена, связывание с рецепторами клеток и быстрый клиренс in vivo. Участки высокого сродства связывания t-PA с фибрином локализованы в пальцевидном домене и втором крингл-домене.

u-PA или урокиназа, подобно t-PA, – одноцепочечный гликопротеин (scu– AP), который расщепляется плазмином до двухцепочечной протеиназы (tcu–AP).

В структуре урокиназы выделяют три домена: N-концевой домен, подобный

EGF-домену, один крингл-домен и С-концевой протеазный домен.

Каталитическая триада – Asp255, His204 и Ser356, локализована в С-концевом протеазном домене. Крингл домен не содержит лизин-связывающих участков,

поэтому u-PA не связывается прямо с фибрином.

3.4.3.Основные стадии фибринолиза

Известны две основные стадии фибринолиза: превращение плазминогена в плазмин и деградация фибрина плазмином (рис. 3-41).

139

РИС 3-41

Основные компоненты и стадии фибринолиза.

Обе стадии фибринолиза: превращение плазминогена (Pmg) в плазмин активаторами – t-PA(тканевой активатор плазминогена) и u-PA (активатор плазминогена урокиназного типа), и расщепление фибрина плазмином до продуктов деградаци (ПДФ), осуществляются на фибриллах фибрина или поверхности клеток, на которых локализованы рецепторы плазминогена (PmgR)

и его активаторов (t-PAR и u-PAR) в области повреждения сосуда. t-PA и u-PA

активируют плазминоген в плазмин, который гидролизует фибрин. Активность плазмина и t-PA блокируется ингибиторами: a2Антиплазмином (a2-АП) и

ингибитором активаторов плазминогена первого типа (PAI-1).

Первая стадия осуществляется преимущественно на фибриллах фибрина

или поверхности клеток в области повреждения сосуда. t-PA активирует

140