2 курс / Нормальная физиология / Основы_физиологии_гемостаза_Струкова_С_М_

Таким образом, в адгезии и агрегации тромбоцитов участвуют адгезивные белки, имеющие рецепторы-интегрины на клетках и множество лигандов, обеспечивающих связывание клеток с компонентами внеклеточного матрикса стенки сосуда и белками крови. Адгезия тромбоцитов к поврежденному участку сосуда обеспечивается лигандами,

взаимодействующими с активированным и экспонированным интегрином

IIb/ 3: самим фон Виллебранда фактором, фибриногеном, а также фибронектином, тромбоспондином и другими лигандами, необходимыми для обеспечения стабильных тромбоцитарных агрегатов.

1.4. Структура и функции тромбоцитов в

первичном гемостазе.

1.4.1. Морфология тромбоцитов

Тромбоциты (кровяные пластинки) – форменные элементы крови,

небольшие (0,5-3,0мкм), дисковидные, безъядерные клетки, образуются из цитоплазмы крупных (2—50мкм) костномозговых клеток – мегакариоцитов.

Гемопоэтический цитокин тромбопоэтин стимулирует развитие мегакариоцитов и образование тромбоцитов. Мегакариоциты происходящие из коммитированной (т.е. ориентированной на одном из ростков кроветворения,

например, мегакариоцитарном) стволовой клетки костного мозга, порождают и

―отшнуровывают‖ тромбоциты в соответствии со сложной, во многом еще не ясной, многоступенчатой программой созревания. Этот процесс приводит к трансформации мегакариоцитов в паукообразные клетки с множеством нитевидных отростков, в которых формируются утолщения, так называемые протромбоциты, и созревают тромбоциты (рис. 1-7).

41

Рис 1- 7.

Схема рождения тромбоцита

Организация тромбоцита начинается с агрегации микротрубочек протромбоцитов в закрученные, замкнутые пучки, определяющие дисковидную форму будущего тромбоцита, и создания мембранного скелета из нитей актина и спектрина. Дисковидная форма стабилизируется связью нитей актина с филамином А и рецептором фактора фон Виллебранда – ГП Ib. Затем в протромбоциты доставляются специфические внутриклеточные компоненты.

Освобождение созревших тромбоцитов из концевых участков протромбоцитов обеспечивается дифференцировкой микротрубочек. Процесс отшнуровки тромбоцитов с помощью мотора – белков микротрубочек, подтверждается присутствием в крови небольшого процента (< 5%) клеток, подобных гантелям (

рис.1-8) . Время жизни тромбоцитов 7-10 дней.

42

Рис .1-8

Электронная микрофотография протромбоцитов в крови здоровых людей

( фото предоставлено Л.И.Бурячковской)

Тромбоциты содержат множество гранул: α-гранулы, плотные гранулы,

лизосомы, а так же органеллы: митохондрии, аппарат Гольджи (рис. 1-9).

Цитоскелет тромбоцита отвечает за изменение формы клетки, секрецию и ретракцию сгустка. Он формируется: 1) субмембранными филаментами актина,

2) пучками микротрубочек, 3) плотной тубулярной системой, которая образуется из эндоплазматического ретикулума мегакариоцита, и 4) системой открытых каналов, так называемой открытой канальцевой или каналикулярной системой. Клетки секретируют содержимое гранул через систему открытых

43

каналов, которые сообщаются друг с другом и внешней средой. Каналы создают широкую поверхность для экзоцитоза и для взаимодействия мембранных рецепторов с агонистами. При связывании агониста, называемого индуктором, с

рецептором на мембране клетки происходит активация тромбоцитов.

Рис.1-9

Морфологические особенности тромбоцитов

1.4.2.Обратимая и необратимая агрегация тромбоцитов

1.4.2.1.Индукторы агрегации тромбоцитов

Индукторы делят на два типа: слабые: АДФ (в низких концентрациях),

адреналин, серотонин, которые вызывают обратимую агрегацию, и сильные:

44

тромбин, коллаген, АДФ (в высоких концентрациях), тромбоксан А2, фактор,

активирующий тромбоциты, которые стимулируют необратимую агрегацию. Под действием индукторов секретируются следующие компоненты:

-из плотных гранул: АДФ, АТФ, серотонин, кальций,полифосфаты;

-из α-гранул: адгезивные белки (фактор фон Виллебранда (vWF), Р-селектин (P- S), фибриноген, фибронектин, тромбоспондин), мембранные ГП и рецепторы (

GPIb, αIIb/β3, ανβ3, PECAM-1, CD40L, ТФ), факторы и ингибиторы свертывания

(факторы: V/Va, VIII, XI, ингибиторы: TFPI, AT), компоненты фибринолиза

(плазминоген (Plg), активатор Plg – u-PA, ингибиторы фибринолиза: PAI-1, α2-

антиплазмин, α2-макроглобулин, TAFI), факторы роста, цитокины, хемокины

(PDGF, EGF, VEGF, bFGF, MIP-1, TGF-β1, -2, IL-1β, IL-8, RANTES), основные белки (тромбоцитарный фактор 4 (PF4), бета-тромбоглобулин (β-TG),

эндостатины);

- из лизосом (только под действием сильных индукторов): кислые гидролазы.

1.4.2. 2. Механизмы агрегации тромбоцитов

Активация тромбоцитов ведет к клеточным ответам, формально различным, но на самом деле неразрывно связанным друг с другом:

1)морфологическим: структурным изменениям, ведущим к формированию тромбоцитарной пробки;

2)биохимическим: освобождению и синтезу специфических компонентов.

Под действием индукторов активированные тромбоциты изменяют форму от дисковидной до сферической; образуют псевдоподии,

объединяются в рыхлые агрегаты. Затем следует секреция содержимого гранул во внешнюю среду через систему открытых каналов. При действии тромбина на тромбоциты уже через 5 секунд после стимуляции происходит изменение формы клетки, централизация гранул, секреция их содержимого в систему открытых каналов и далее во внеклеточную среду.

Сложная система сократительных белков участвует в сохранении формы клетки, главные из которых – актин, миозин, тропонин, актин-

связывающий белок, система микротрубочек. Все эти белки участвуют в реализации действия индуктора.

45

1.4.2.3. Активация тромбоцитов коллагеном

Действие агонистов на тромбоциты осуществляется через специфичесие рецепторы (табл. 1-1). Коллаген субэндотелия служит эффективным субстратом связывания тромбоцитов к поврежденному участку сосуда и активатором клеток, поддерживая их стабильную адгезию, активацию и рост тромба через два основных рецептора – ГП VI

и интегрин 2 1 (ГП IaIIa) (рис. 1-5).

ГП VI – член Ig суперсемейства. Связывание коллагена с ГП VI

тромбоцитов ведет к кластеризации и последующему фосфорилированию

(по ITAM доменам) FcR -цепей (ассоциированных с рецептором) Srk

киназами (Fyn и Lyn). Последние вызывают активацию Syk киназы,

которая, в свою очередь, фосфорилирует адапторные белки LAT и SLP-76.

В конце концов, сигнальный каскад ведет к фосфорилированию и активации PLC 2, повышению концентрации внутриклеточного кальция,

активации PKC, освобождению AДФ и стимулированию эффективной активации тромбоцитов.

Активация коллагеном рецептора ГП VI может ―сдвигать‖ интегрины

21 и IIb/ 3 из низкоаффинного в высокоаффинное состояние, приводя

кактивации тромбоцитов и стабильному прикреплению клеток к поврежденной стенке сосуда.

Адгезия тромбоцитов к коллагену через интегрин 2 1 также стимулирует внутриклеточную сигнализацию, которая ведет к активации

Srk киназ, PLC 2 , повышению концентрации внутриклеточного кальция

([Ca2+]i). Эта реакция приводит к стабилизации адгезии, распластыванию тромбоцитов, их активации и экспозиции на поверхность тромбоцита интегрина IIb/ 3. Интегрин IIb/ 3 через мостики фибриногена рекрутирует еще не адгезированные тромбоциты.

За адгезией и активацией тромбоцитов адгезивными белками следует стадия агрегации активированных тромбоцитов, стимулируемая освобождаемыми клетками или вновь синтезированными индукторами агрегации, и создание активной поверхности для осуществления механизмов свертывания крови.

46

1.4.2.4. Активация тромбоцитов тромбином

Тромбин – трипсиноподобная сериновая протеиназа (КФ 3.4.21.5),

превращает фибриноген крови в фибрин (см. главу 2). В очень низких наномолярных концентрациях (которые на несколько порядков ниже тех,

что необходимы для расщепления фибриногена) тромбин активирует тромбоциты через специфические рецепторы, называемые «рецепторами,

активируемыми протеазами» (РАR). Взаимодействие тромбина с подтипом

1 рецепторов – РАR1, стимулирует агрегацию тромбоцитов, вызывает мультимеризацию ГПIb рецепторов, что повышает эффективность расщепления PAR1. ГП Ib служит кофактором PAR1.В высоких концентрациях тромбин активирует PAR4 на тромбоцитах,что приводит к усилению ответа клеток( см.главу 2).

Рецепторы тромбина PAR1 и PAR4 относится к суперсемейству семидоменных трансмембранных рецепторов, сопряженных с разными подтипами ГТФ-связанных G-белков. В отличие от других членов суперсемейства рецепторов ,связанных с G-белками рецепторы тромбина расщепляется ферментом по амино (N)-концу молекулы. Возникающий в результате гидролиза рецептора новый аминоконцевой пептид, так называемый ―привязанный лиганд‖, служит агонистом этого рецептора (см главу 2). Следующие основные биохимические реакции включаются в активацию тромбоцитов тромбином (рис. 1-10).

47

Рис 1-10

Схема активации тромбоцитов тромбином.

Взаимодействие тромбина с рецепторами PAR-1/4 на мембране тромбоцита стимулирует передачу сигнала внутрь клетки и ее активацию через семейство регуляторных, связывающих гуаниннуклеотиды G-белков – гетеротримеров, состоящих из α-субъединицы и βγ-субъединиц. Активация

PARs и взаимодействие с α-субъединицей, приводит к обмену связанного

GDP на GTP, диссоциации гетеротримера и взаимодействию α-

субъединицы (либо βγ) с белком-мишенью. PAR-1/4 взаимодействуют с α-

субъединицами G12/13-, Gq- и Gi-белков. Связывание PARs с G12/13 ведет к активации малого G-белка Rho и отвечает за изменение формы

48

тромбоцитов, образование псевдоподий. Сигналы, опосредованные белком

Gq ведут к активации фосфолипазы Сβ, запуску гидролиза фосфоинозитидов мембраны до двух вторичных посредников:

водорастворимого инозитол-1,3,4-трифосфата (ИФ3), вымывающегося в цитозоль, и липофильного 1,2-диацилглицерина (ДАГ), который остается в

мембране. ИФ3 вызывает освобождение ионов кальция из плотной тубулярной системы и плазматической мембраны в цитозоль. ДАГ

активирует протеинкиназу С, которая фосфорилирует белки. Более того,

сигналы, индуцируемые тромбином при активации PAR-1/4, ведут к

фосфорилированию протеинкиназ, активируемых митогеном (MAPK),

активации рецепторных тирозинкиназ и других белков, образованию протеинкиназ. Эти процессы отвечают за множество реакций клеток,

включая секрецию гранул, активацию интегринов, агрегацию тромбоцитов,

прокоагулянтную и провоспалительную активности тромбоцитов.

Активированные тромбином тромбоциты секретируют содержимое гранул,

синтезируют и освобождают агонисты агрегации, в том числе тромбоксан А2.. Вследствие активации Са-зависимых протеаз происходит кластеризация рецепторов адгезивных белков, интегринов IIb/ 3 в псевдоподиях,

изменение их конформации и экспонирование на поверхности. Повышается текучесть мембраны, происходит перераспределение фосфолипидов таким образом, что на поверхности мембраны оказываются тромбогенные.

Нарушается связь рецепторов с мембраной, происходит нарушение мембранного скелета, распластывание. Перестройка мембраны превращает ее в активный матрикс для связывания факторов свертывания крови,

образования комплексов кофакторов и проферментов и их активации. На поверхность тромбоцитов мобилизуются Р-селектин и CD40лиганд,

обеспечивающие стабилизацию агрегатов и их связывание с лейкоцитами и активированным эндотелием, а также тканевой фактор, образуемый альтернативным сплайсингом, который провоцирует свертывание крови и тромбообразование .

1.4.2.5.Синтез и функции простагландинов в первичном гемостазе

При повышении концентрации внутриклеточного кальция происходит активация еще одного мембранного фермента – фосфолипазы А2 (ФЛА2).

ФЛА2 освобождает из мембранных фосфолипидов (преимущественно

49

фосфатидилхолина)

арахидоновую

кислоту

(20-ти

углеродная

эйкозотетраеновую кислоту) (рис. 1-11, 1-12).

Рис 1-11

Схема синтеза простагландиновтромбоксана А2 и простациклина.

Фермент циклооксигеназа (COX1), превращает арахидоновую кислоту в циклические эндоперекиси. Затем из эндоперекисей

(простагландины ПГG2 и ПГH2) образуется целое семейство простагландинов. В тромбоцитах под действием фермента тромбоксансинтазы образуется тромбоксан А2 (TxА2), а под действием липоксигеназы образуются лейкотриены, вовлекаемые в процессы свертывания крови и воспаления. Тромбоксан А2 – мощный индуктор агрегации тромбоцитов и сильный вазоконстриктор. ТхА2 связывается со

50