- •Структура занятия.
- •Теоретическая часть:
- •Указания к занятию. Методические рекомендации:
- •Выполнение опыта:
- •Проведение анализа.
- •4. Закрепление знаний, умений и навыков.
- •5. Контроль конечного уровня знаний, умений.
- •Клинико-диагностическое значение.
- •Задача 1.
- •Задача 2.
- •Задача 3.
- •6. Домашнее задание:
И Н С Т Р У К Ц И Я
по выполнению практической работы № 50 по теме
«Обмен белков. Определение содержания мочевины в сыворотке крови колориметрическим методом на основе реакции с диацетилмонооксимом»
Цели занятия:
-
Закрепить теоретические знания по теме «Химия и обмен белков».
-
Закрепить умения и навыки в работе с набором реактивов, приготовлении растворов.
-
Сформировать умения в постановке реакции преципитации.
-
Провести биохимическое исследование – определение содержания мочевины в сыворотке крови колориметрическим методом на основе реакции с диацетилмонооксимом.
Исходный уровень знаний и умений.
Учащийся должен знать:
-
Основные этапы обмена белков, их биологическую роль.
-
Роль лабораторной диагностики в исследовании белкового обмена пациента.
-
Патологические состояния обмена белков.
-
Пути метаболизма аминокислот, медико-биологическое значение.
-
Защитные реакции по обезвреживанию аммиака. Синтез мочевины. Локализацию процесса. Реакции. Ферменты.
-
Значение реакций детоксикации аммиака в норме и при патологии.
-
Технику приготовления растворов и реактивов.
-
Технику дозирования, пипетирования, инкубации проб.
-
Технику работы с водяной баней.
-
Технику работы на ФЭКе, спектрофотометре; меры предосторожности в работе с приборами, водяной баней, реактивами.
-
Иметь понятие о контроле качества лабораторных исследований.
Учащийся должен уметь:
-
Работать с набором реактивов.
-
Работать с пипетками, дозатором.
-
Работать на спектрофотометре, ФЭКе.
-
Провести биохимическое исследование по предложенной методике.
-
Дать начальную интерпретацию полученным результатам.
-
Уметь решать ситуационные задачи.
Структура занятия.
-
Теоретическая часть:
-
Повторение теоретического материала по теме «Химия и обмен белков».
-
Вводное слово преподавателя.
Мочевина представляет собой диамид угольной кислоты (NH2)2CO, образующийся в печени в процессе обезвреживания аммиака. Мочевина входит в остаточноазотную фракцию; азот мочевины у практически здоровых людей составляет 40-60% всего остаточного азота, выраженного в мг/100 мл. Разность между остаточным азотом и азотом мочевины представляет так называемый резидуальный азот. Под остаточным азотом понимают тот небелковый азот, который определяется в надосадочной жидкости, получаемой после осаждения белков сыворотки (плазмы) крови ТХУ фосфорно-молибденовой и фосфорно-вольфрамовой кислотами.
При острой почечной недостаточности, когда остаточный азот крови может быть в пределах нормы, резко увеличивается концентрация мочевины (уремия), так как выделение её с мочой нарушается. Для оценки тяжести состояния определяют отношение азота мочевины к остаточному азоту и эту величину выражают в процентах. В норме данный показатель составляет 48%, а при почечной недостаточности может достигать 90%.
Снижение уровня мочевины характерно для заболеваний печени (паренхиматозная желтуха, острая дистрофия печени, цирроз).
-
Указания к занятию. Методические рекомендации:
-
Внимательно изучите инструкцию.
-
Приготовьте всё необходимое для проведения анализа.
-
Осмыслите ход выполнения лабораторной работы.
-
В работе желательно использовать параллельные пробы с целью самоконтроля за качеством работы.
-
Соблюдайте меры предосторожности в работе с реактивами, биологическим материалом, на спектрофотометре.
-
При работе с градуированной пипеткой используйте резиновую грушу с переходником.
-
Соблюдайте дезинфекционный режим в работе.
-
Практическая часть.
-
Приготовление рабочего реагента (используется набор реактивов «Абрис+»).
Опыт 1. Приготовление рабочего реагента.
Выполнение опыта:
Смешать растворы диацетилмонооксима, железа солянокислого и тиосемикарбазида в соотношении 1:1:1. Рабочий реагент стабилен не менее 8 часов при комнатной температуре в герметично закрытом флаконе.
-
Лабораторная работа: «Определение содержания мочевины в биологических жидкостях колориметрическим методом на основе реакции с диацетилмонооксимом».
ПРИНЦИП: Мочевина образует с диацетилмонооксимом в сильнокислой среде в присутствии тиосемикарбазида и ионов Fe3+ комплексное соединение красного цвета, по интенсивности окраски которого определяют её концентрацию.
Оборудование: штатив с пробирками, водяная баня, центрифуга, пипетки, химические стаканы; спектрофотометр.
Реактивы: цветной реагент, содержащий диацетилмонооксим; тиосемикарбазид; соль Fe (III); стандартный раствор мочевины, раствор ТХУ – 30%.
Материал для исследования: сыворотка крови, моча.
Проведение анализа.
Отмерить |
Опытная проба, мл |
Калибратор, мл |
Контроль, мл |
Сыворотка крови |
0,01 |
- |
- |
Рабочий раствор цветного реагента |
2,0 |
2,0 |
2,0 |
Дистиллированная вода |
- |
- |
0,01 |
Калибратор |
- |
0,01 |
- |
Смешать и инкубировать в кипящей водяной бане в течение 10 мин. По окончании инкубации пробы охладить в проточной воде и измерить оптическую плотность пробы (Епр.) и калибратора (Екал.) против контрольного раствора при длине волны 540 (500-560) нм, кювета – 1 см. Окраска стабильна в течение 15 мин.
Расчёт:
, ммоль/л,
где Cкал. – концентрация мочевины в калибраторе; Eпр. – оптическая плотность опытной пробы; Eкал. – оптическая плотность стандартной пробы.
Примечание: Если определяют мочевину в гемолитических или липемических сыворотках, то пробу необходимо депротеинировать 10% раствором ТХУ. В центрифужную пробирку вносят 0,4 мл дистиллированной воды, 0,1 мл сыворотки и 0,5 мл 10% раствора ТХУ. Содержимое смешивают и центрифугируют 5-10 мин. при 3000 об/мин. Затем 0,01 мл надосадочной жидкости переносят в новую пробирку, добавляют 2,0 мл рабочего раствора цветного реагента. Далее определение проводят, как при анализе без депротеинирования
Мочу перед анализом разводят дистиллированной водой в соотношении 1:50, 1:100 и исследование проводят в той же последовательности, как описано для сыворотки..
Расчёт:
, ммоль/л,
где K – коэффициент разведения; Vсут. – объём суточной мочи, л.
Референтные пределы: в сыворотке крови – 2,5-8,1 ммоль/л; моча суточная – 430-710 ммоль/ сут.