- •Особенности строения бактериального генома.
- •Изменчивость бактерий. Генотип. Фенотип. Модификационная изменчивость.
- •3. Мутации бактерий.
- •4. Рекомбинация у бактерий. Типы рекомбинаций.
- •5. Плазмиды, их свойства.
- •6. Механизмы передачи генетической информации: трансформация, трансдукция, коньюгация.
- •7. Медицинская биотехнология. Генетическая инженерия.
- •8. Ферменты бактерий, классификация, механизм действия. Контроль биосинтеза ферментов.
- •9. Практика. Характеристика третьего этапа. Использование ферментативных свойств микроорганизмов для их идентификации.
- •10. Дифференциально-диагностические среды. Экспресс-методы определения ферментативной активности микроорганизмов.
- •11. Внутривидовая идентификация (эпидемиологическое маркирование).
- •12. Генетические методы диагностики инфекционных заболеваний.
- •2. Определение плазмидного профиля бактерий.
- •3. Риботипирование.
- •Методы, используемые для обнаружения микроба без выделения его в чистую культуру.
- •Определение наличия микроба в исследуемом материале при помощи микрочипа.
- •Полимеразная цепная реакция
7. Медицинская биотехнология. Генетическая инженерия.
Биотехнология (от греч. bios - жизнь, tecen - искусство, logos - наука) представляет собой область знаний, которая возникла и оформилась на стыке микробиологии, молекулярной биологии, генной инженерии, иммунологии, химической технологии и ряда других наук. Рождение биотехнологии обусловлено потребностями общества в новых, более дешевых продуктах для народного хозяйства, в том числе для медицины и ветеринарии, а также принципиально новых технологиях.
Целью биотехнологии являются получение продуктов из биологических объектов или с их применением, а также воспроизводство биоэффектов, не встречающихся в природе. В качестве биологических объектов чаще всего используются одноклеточные микроорганизмы, животные и растительные клетки, а также организм животных, человека или растений.
Выбор этих объектов обусловлен следующими причинами.
Клетки являются своего рода биофабриками, вырабатывающими в процессе жизнедеятельности разнообразные ценные продукты: белки, жиры, углеводы, витамины, аминокислоты, антибиотики, гормоны, антитела, антигены, ферменты, спирты и т.д. Многие из этих продуктов, крайне необходимых в жизни человека, пока недоступны для получения небиотехнологическими способами.
Клетки чрезвычайно быстро воспроизводятся. Так, бактериальная клетка делится через каждые 20-60 мин, дрожжевая - через 1,5-2 ч, животная - через 24 ч, что позволяет за относительно короткое время искусственно нарастить на сравнительно дешевых и недефицитных питательных средах в промышленных масштабах огромные количества биомассы микробных, животных или растительных клеток.
Биосинтез сложных веществ, таких, как белки, антибиотики, антигены, антитела, значительно экономичнее и технологически доступнее, чем другие виды химического синтеза. При этом исходное сырье для биосинтеза, как правило, проще, дешевле и доступнее, чем сырье для других видов синтеза. Для этого используются отходы сельскохозяйственной, рыбной продукции, пищевой промышленности, растительное сырье, например рыбная мука, меласса, дрожжи, древесина и др.
Биотехнология использует следующие продукты одноклеточных:
• сами клетки как источник целевого продукта;
• крупные молекулы, которые синтезируются клетками в процессе выращивания, - ферменты, токсины, антигены, антитела, пептидогликаны и др.;
• первичные метаболиты - низкомолекулярные вещества (мол. масса менее 1500 Д), необходимые для роста клеток - аминокислоты, витамины, нуклеотиды, органические кислоты и др.;
• вторичные метаболиты (идиолиты) - низкомолекулярные и макромолекулярные соединения, не требующиеся для роста клеток, - антибиотики, алкалоиды, токсины, гормоны и др.
Биотехнология использует эту продукцию клеток как сырье, которое в результате технологической обработки превращается в конечный, пригодный для использования продукт. Помимо микроорганизмов, животных и растительных клеток, биотехнология в качестве биологических объектов использует органы и ткани человека и животных, растения, организм животных и человека. Например, для получения инсулина используется поджелудочная железа крупного рогатого скота и свиней, гормона роста - гипофизы трупов человека, иммуноглобулинов - организм лошадей и других животных, препаратов крови - кровь доноров и т.д.
Так, например, дрожжи используют в хлебопечении, пивоварении, виноделии, получении соков, кормового белка, питательных сред для выращивания бактерий и культур животных клеток. Из бактерий в биотехнологии чаще всего используют род Acetobacter - для превращение этанола в уксусную кислоту, углекислый газ и воду; род Bacillus - для получения ферментов (B. subtilis), средств защиты растений (B. thuringiensis); род Clostridium - для сбраживания Сахаров в ацетон, этанол, бутанол; молочнокислые бактерии (Lactobacillus и др.); псевдомонады, например РР. denitrificans, - для получения витамина В12; Corynebacterium gentamicum - для получения аминокислот и др. Из грибов в биотехнологии для получения разнообразных антибиотиков применяют род Streptomyces, Penicilium chrysogenium, Cefalosporum acremonium, Streptomyces spp. и др. Естественно, широкое применение в получении диагностикумов, вакцин, иммуноглобулинов, пробиотиков, фагов и других микробных препаратов находят патогенные и вакцинные штаммы болезнетворных микробов, а также условно-патогенные микроорганизмы.
Многие микроорганизмы - бактерии, дрожжи, вирусы - используются в качестве реципиентов чужеродного генетического материала с целью получения рекомбинантных штаммов - продуцентов биотехнологической продукции. Так получены рекомбинантные штаммы E. coli, продуцирующие интерфероны, инсулин, гормоны роста, разнообразные антигены; штаммы B. subtilis, вырабатывающие интерферон; дрожжи, продуцирующие интерлейкины, антигены вируса гепатита В; рекомбинантные вирусы осповакцины, синтезирующие антигены вируса гепатита В, вируса клещевого энцефалита, ВИЧ и др.
Генетическая инженерия является сердцевиной биотехнологии. Она по существу сводится к генетической рекомбинации, т.е. обмену генами между двумя хромосомами, которая приводит к возникновению клеток или организмов с двумя и более наследственными детерминантами (генами), по которым родители различались между собой. Метод рекомбинации in vitro или генетической инженерии заключается в выделении или синтезе ДНК из отличающихся друг от друга организмов или клеток, получении гибридных молекул ДНК, введении рекомбинантных (гибридных) молекул в живые клетки, создании условий для экспрессии и секреции продуктов, кодируемых генами. Гены, кодирующие те или иные структуры, или выделяют (клонируют) как таковые (хромосомы, плазмиды), или прицельно выщепляют из этих генетических образований с помощью ферментов рестрикции. Эти ферменты, а их уже известно более тысячи, способны резать ДНК по многим определенным связям, что является важным инструментом генной инженерии. В последнее время обнаружены ферменты, расщепляющие по определенным связям РНК, наподобие рестриктаз ДНК. Эти ферменты названы рибозимами. Сравнительно небольшие гены могут быть получены с помощью химического синтеза. Для этого вначале расшифровывают число и последовательность аминокислот в белковой молекуле вещества, а затем по этим данным узнают очередность нуклеотидов в гене, поскольку каждой аминокислоте соответствуют три нуклеотида (кодон). С помощью синтезатора создают химическим путем ген, аналогичный природному гену. Полученный одним из способов целевой ген с помощью ферментов лигаз сшивают с другим геном, который используется в качестве вектора, для встраивания гибридного гена в клетку. Вектором могут служить плазмиды, бактериофаги, вирусы человека, животных и растений. Экспрессируемый ген в виде рекомбинатной ДНК (плазмида, фаг, вирусная ДНК) встраивается в бактериальную или животную клетку, которая приобретает новое свойство - продуцировать несвойственное этой клетке вещество, кодируемое экспрессируемым геном. В качестве реципиентов экспрессируемого гена чаще всего используют E. coli, B. subtilis, псевдомонады, нетифоидные серовары сальмонелл, дрожжи, вирусы. Методом генной инженерии созданы сотни препаратов медицинского и ветеринарного назначения, получены рекомбинантные штаммы-суперпродуценты, многие из которых нашли практическое применение. Уже используются в медицине полученные методом генной инженерии вакцины против гепатита В, интерлейкины-1, 2, 3, 6, инсулин, гормоны роста, интерфероны α, β, γ, фактор некроза опухолей, пептиды тимуса, миелопептиды, тканевый активатор плазминогена, эритропоэтин, антигены ВИЧ, фактор свертывания крови, моноклональные антитела и многие антигены для диагностических целей.