4 курс / Акушерство и гинекология / Кадырова_Л_В_Дифференцировка_Т_лимфоцитов_в_динамике_беременности
.pdfФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ «ИВАНОВСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ МАТЕРИНСТВА И ДЕТСТВА ИМЕНИ В.Н. ГОРОДКОВА» МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
На правах рукописи
КАДЫРОВА ЛЮДМИЛА ВИКТОРОВНА
ДИФФЕРЕНЦИРОВКА Т-ЛИМФОЦИТОВ В ДИНАМИКЕ БЕРЕМЕННОСТИ
14.03.09 –клиническая иммунология, аллергология
Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук
Научный руководитель: д.м.н., профессор Н.Ю.Сотникова
Иваново – 2014
2
СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ………………………………………………………………………..……4
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ…………………………………………………...13
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ……………………….....34
2.1.Организация работы и объем исследований .……………………………34
2.2.Иммунологические методы исследования .……………………………...35
2.3Статистическая обработка данных…………..……………………………40
Глава 3. ХАРАКТЕРИСТИКА ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ И ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ Т-ЛИМФОЦИТОВ В ДИНАМИКЕ НЕОСЛОЖНЕННОЙ БЕРЕМЕННОСТИ И У ЖЕНЩИН С РАЗВИВШИМСЯ ВПОСЛЕДСТВИИ САМОПРОИЗВОЛЬНЫМ ВЫКИДЫШЕМ………………………………………...42
3.1.Особенности внетимической дифференцировки наивных Т-лимфоцитов в популяциях Т-хелперов и цитотоксических Т-лимфоцитов периферической крови при неосложненной беременности в динамике гестационного процесса………....42
3.2.Особенности дифференцировки клеток памяти в популяциях Т-хелперов и цитотоксических Т-лимфоцитов периферической крови при неосложненной беременности в динамике гестационного процесса………………………………...50
3.3.Особенности дифференцировки Т-хелперов и цитотоксических Т-лимфоцитов периферической крови женщин с развившимся впоследствии самопроизвольным выкидышем……………………………………………………………………………56
3.4.Характеристика внутриклеточной продукции цитокинов и цитолитических молекул наивными клетками и клетками памяти в популяциях Т-хелперов и цитотоксических Т-лимфоцитов периферической крови при неосложненной беременности в динамике гестационного процесса ………………………………..61 Глава 4. СОДЕРЖАНИЕ IL-2 И IL-15 В ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ В ДИНАМИКЕ НЕОСЛОЖНЕННОЙ БЕРЕМЕННОСТИ И У ЖЕНЩИН С РАЗВИВШЕМСЯ ВПОСЛЕДСТВИИ САМОПРОИЗВОЛЬНЫМ ВЫКИДЫШЕМ……………………………………………………………………….69
3
Глава 5. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ………………………73
ЗАКЛЮЧЕНИЕ……………………………………………………………………….93
ВЫВОДЫ……………………………………………………………………...............94
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ……………………………………………...97
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ…………………………………………………………...99 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ……………………………………………………….......100
4
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность научного исследования
В настоящее время известно, что иммунные механизмы играют крайне важную роль в развитии беременности, определяя формирование маточноплацентарного комплекса и обеспечивая сосуществование двух семиаллогенных организмов [9]. Нарушение тех или иных звеньев в сложной цепочке иммунорегуляции ведет к возникновению патологических процессов в системе мать-плацента-плод [171, 9, 182, 47].
Популяция Т-хелперов является важнейшим звеном в запуске реакций адаптивного иммунитета, при этом усиление функциональной активности той или иной субпопуляции Т-хелперов определяет тип иммунного ответа [39]. Цитотоксические Т-лимфоциты являются одним из основных компонентов эффекторной стадии иммунного ответа, осуществляющие цитолитическое действие в отношении различных клеток-мишеней благодаря продукции большого количества цитокинов и цитолитических молекул [39]. В последние годы было показано, что уровень функциональной активности Т-хелперов и цитотоксических Т-лимфоцитов определяется стадией их дифференцировки [105, 86, 77, 95, 171]. При этом различают 4 пула Т-лимфоцитов, которые получили название наивных клеток, центральных, претерминально-дифференцированных и терминально-дифференцированных клеток памяти, характеризующихся различной экспрессией ряда функциональных и адгезионных молекул [30, 19, 95, 171]. Переход клеток на новую стадию дифференцировки определяет путь рециркуляции клеток через лимфоидную ткань, изменяет их цитолитические свойства, продукцию цитокинов и цитолитических молекул [77, 178, 105].
Однако в литературе практически отсутствуют данные о характере дифференцировки Т-хелперов и цитотоксических Т-лимфоцитов при неосложненном течении беременности в динамике гестационного процесса.
5
Известно, что беременность сопровождается инволюцией тимуса, выраженной в снижении его массы и клеточности [210, 43, 84]. Предполагается, что во время беременности механизмом компенсации частичного подавления тимического пути развития лимфоцитов, является процесс экстратимической дифференцировки Т-клеток [35, 42]. Так в работах ряда авторов показано, что экстратимическая дифференцировка лимфоцитов может проходить в лимфатических узлах, дренирующих матку, в децидуальной оболочке матки и в печени [35, 42]. Однако данный механизм поддержания пула Т-лимфоцитов при беременности не исследовался. В настоящее время для изучения функциональной активности тимуса предлагается определять в лимфоцитах кольца реаранжировки генов α-цепи антигенраспознающего рецептора или TREC [65, 186]. В литературе представлены работы о снижении уровня TREC при различных патологических состояниях [160, 54, 78, 104, 188]. Можно предположить, что и при беременности, которая сопровождается транзиторной атрофией тимуса, должен изменяться уровень экспрессии TREC периферическими Т-лимфоцитами. Однако данные об изменении количества TREC при беременности крайне малочисленны.
В связи с этим планируемая работа является актуальной и позволит уточнить особенности поддержания иммунного гомеостаза во время беременности.
Цель работы – установить особенности поддержания иммунного гомеостаза в динамике гестационного процесса с учетом дифференцировки наивных Т-клеток и Т-клеток памяти, на основании чего разработать новый способ прогнозирования раннего самопроизвольного выкидыша.
Задачи научного исследования
1.Выявить особенности дифференцировки клеток памяти в популяциях Т- хелперов и цитотоксических Т-лимфоцитов периферической крови в динамике гестационного процесса.
6
2.Оценить содержание клеток памяти, внутриклеточно продуцирующих цитокины и цитолитические молекулы, в популяциях Т-хелперов (IL-4, IFNγ) и цитотоксических Т-лимфоцитов (Perforin и Granzyme B) в динамике гестационного процесса.
3.Выявить особенности содержания IL-2 и IL-15 в сыворотке периферической крови в динамике гестационного процесса.
4.Оценить уровень ранних тимических эмигрантов на основании изучения содержания CD31+thymic и СD31-central клеток в популяциях периферических Т-хелперов и цитотоксических Т-лимфоцитов и экспрессии ДНК TREC Т- лимфоцитами в динамике гестационного процесса.
5.Разработать способ прогнозирования раннего самопроизвольного выкидыша у женщин с неосложненной на момент обследования беременностью.
Научная новизна исследования
Впервые установлено, что неосложненное течение беременности сочетается с изменением характера дифференцировки наивных клеток и клеток памяти и их функциональной активности, как в популяции Т-хелперов, так и популяции цитотоксических Т-лимфоцитов.
Выявлено, что отличительной чертой дифференцировки клеток памяти у беременных женщин является снижение содержания в периферической крови во 2 и 3 триместрах центральных клеток памяти в популяции Т-хелперов, а в популяции цитотоксических Т-лимфоцитов уменьшение уровня претерминальнодифференцированных клеток памяти в 1 и 2 триместрах.
Установлено, что для беременных женщин характерно изменение продукции цитокинов разными субпопуляциями клеток памяти: в популяции Т- хелперов усилена внутриклеточная продукция IL-4 и IFNγ наивными клетками в 1 триместре, повышена продукция IFNγ в пулах претерминально- и терминальнодифференцированных клеток и IL-4 в пуле терминально-дифференцированных
7
клеток во 2 триместре; в популяции ЦТЛ снижена внутриклеточная продукция перфорина центральными и претерминально-дифференцированными клетками памяти, повышена выработка Granzyme B наивными клетками в 1 триместре, снижена продукция Perforin всеми типами клеток памяти во 2 триместре, снижена продукция Perforin центральными, претерминально- и терминально дифференцированными клетками памяти в 3 триместре.
Показано, что содержание различных пулов клеток памяти и их функциональная активность меняются в зависимости от срока гестации: в популяции цитотоксических Т-лимфоцитов уровень центральных клеток памяти снижается во 2 триместре по сравнению с показателями 1 триместра, в 3 триместре количество претерминально-дифференцированных ЦТЛ повышается по сравнению с таковым во 2 триместре; также во 2 триместре относительно 1 триместра увеличивается внутриклеточная продукция IL-4+ и IFNγ+ терминально-дифференцированными клетками в популяции Т-хелперов; снижается выработка Perforin наивными клетками и терминальнодифференцированными клетками, а также уровень Granzyme B наивными клетками в популяции цитотоксических Т-лимфоцитов; в 3 триместре уменьшается внутриклеточная продукция IFNγ претерминально- и терминальнодифференцированными клетками и IL-4 терминально-дифференцированными клетками памяти в популяции Т-хелперов, но повышается продукция Perforin наивными цитотоксическими Т-клетками.
Установлено, что во время беременности повышается сывороточный уровень IL-2 в 1 и 2 триместрах и IL-15 на протяжении всего гестационного периода.
Показано, что во время неосложненной беременности в отличие от небеременных женщин увеличено содержание наивных клеток в популяции Т- хелперов на протяжении всего гестационного периода и в популяции цитотоксических Т-лимфоцитов - в 1, 2 триместрах, что сочетается со снижением в крови уровня ранних эмигрантов из тимуса в популяциях и Т-хелперов, и ЦТЛ, при этом уровень экспрессии ДНК TREC снижается во 2 триместре.
8
Впервые выявлено, что снижение в 5-8 недель беременности в периферической крови уровня центральных клеток памяти в популяции Т- хелперов на фоне повышения содержания терминально-дифференцированных клеток памяти в популяции Т-хелперов и цитотоксических Т-лимфоцитов, а также повышение сывороточного уровня IL-15 предшествуют развитию самопроизвольного выкидыша в 10-12 недель беременности.
Впервые установлено, что высокое содержание в периферической крови CD45RA+CD62L+ лимфоцитов в популяции периферических Т-хелперов является прогностическим критерием раннего самопроизвольного выкидыша.
Методология и методы исследования
Для достижения поставленной цели в работе было проведено обследование 85 женщин лонгитудинально в динамике гестационного процесса в 1 (5-8 недель гестации), 2 (16-20 недель гестации) и 3 (28-32 недели гестации) триместрах беременности, обратившихся в территориальную женскую консультацию № 2 г. Иваново для ведения беременности. При обследовании женщин использовался комплекс современных иммунологических методов - многоцветная проточная цитометрия, PCR в масштабе реального времени, твердофазный ИФА.
Статистическая обработка результатов исследования проводилась с использованием пакета современных компьютерных программ прикладного статистического анализа.
Положения, выносимые на защиту
Развитие гестационного процесса ассоциируется с изменением дифференцировки и функциональной активности наивных Т-клеток и Т-клеток памяти. Начиная с ранних сроков при неосложненной беременности, в результате воздействия антигенов плодового происхождения и стимулирующего влияния IL- 2 и IL-15, в периферической крови усиливается процесс экстратимической
9
дифференцировки наивных клеток в популяциях Th1, Th2 и цитотоксических Т- лимфоцитов без последующего образования центральных и эффекторных клеток памяти, на фоне угнетения цитолитического потенциала клеток памяти.
Чрезмерная стимуляция антигенами плода на фоне повышения сывороточного уровня IL-15 определяет усиление дифференцировки клеток памяти в популяции Т-хелперов и цитотоксических Т-лимфоцитов до терминальных этапов, что может приводить к развитию цитотоксических реакций, направленных на преждевременное прерывание беременности.
Высокое содержание CD45RA+CD62L+ клеток в популяции CD4+ лимфоцитов периферической крови является прогностическим критерием раннего самопроизвольного выкидыша.
Практическая значимость научного исследования
В гинекологической практике предлагается использовать новый способ прогнозирования раннего самопроизвольного выкидыша, основанный на определении в периферической крови относительного содержания CD45RA+CD62L+ клеток в популяции CD4+ лимфоцитов.
Установлены нормативные показатели содержания наивных клеток, центральных, претерминально-дифференцированных и терминальнодифференцированных клеток памяти в популяциях Т-хелперов и цитотоксических Т-лимфоцитов периферической крови в динамике гестационного процесса.
Внедрение результатов работы в практику
Разработанный «Способ прогнозирования самопроизвольного выкидыша» (положительное решение о выдаче патента от 14.05.2014г) прошел предрегистрационное испытание в гинекологической клиники Федерального государственного бюджетного учреждения «Ивановский научно-
10
исследовательский институт материнства и детства имени В.Н. Городкова» Министерства здравоохранения Российской Федерации.
Нормативные показатели содержания наивных клеток, центральных, претерминально-дифференцированных и терминально-дифференцированных клеток памяти в популяциях Т-хелперов и цитотоксических Т-лимфоцитов периферической крови в динамике гестационного процесса используются в работе врачей акушеров-гинекологов гинекологической клиники Федерального государственного бюджетного учреждения «Ивановский научноисследовательский институт материнства и детства имени В.Н. Городкова» Министерства здравоохранения Российской Федерации и в учебном процессе на кафедре патофизиологии, клинической патофизиологии и иммунологии Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Ивановская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации.
Степень достоверности полученных результатов подтверждается достаточным количеством клинических наблюдений. Обследованы 85 беременных женщин лонгитудинально троекратно в динамике 1-3 триместров гестации и 36 практически здоровых небеременных женщин фертильного возраста.
Личное участие автора
Автором самостоятельно проводился отбор пациенток на основании заключений врачей акушеров-гинекологов. Автор лично осуществлял все этапы иммунологических исследований, проводил систематизацию, статистикоматематическую обработку данных, анализ и описание полученных результатов; сформулированы выводы и практические рекомендации.