и дифференциально окрашивают" любым подходящим методом. Затем их можно покрыть тонким слоем золота в напылительной установке, но если вы имеете достаточно мощный источник света, то напыление можно не производить. Препараты просматривают не заключая и без покровного стекла, используя оборудование, основанное на Opak system фирмы Leitz [50]. Авторы сообщают, что при микроскопии в отраженном свете им удалось увидеть больше деталей, чем в проходящем свете.

6.4.3. Измерение полиморфизма хромосом

Полиморфизмы, или гетероморфизмы (и то и другое обозначает различия между гомологичными хромосомами), — явления очень распространенные. К ним относятся различия, выявляемые в С-сегментах, полиморфизм размеров которых оказался универсальным явлением для животного и растительного мира; значительный полиморфизм обнаруживается также при серебрении ядрышковых организаторов; кроме того, полиморфизм яркости обнаруживается у Q-сегментов хромосом человека.

Полиморфизмы хромосом исследовали в связи с задержкой умственного развития, бесплодием и заболеванием раком у людей, однако в результате этих исследований не было обнаружено никаких четких корреляций. У мышей особенности С-сегментов характеризуют различные линии животных. Размеры окрашенных серебром ядрышковых организаторов до некоторой степени коррелируют с количеством рибосомных генов. На практике полиморфизмы хромосом используются в качестве маркеров для выявления отцовства, выяснения происхождения добавочных хромосом или дополнительного хромосомного набора при трисомии или триплоидии, в качестве маркеров для определения групп сцепления, а также как маркеры пересаженных тканей.

Измерение полиморфизмов хромосом связано с особыми проблемами. Во-первых, малые размеры сегментов заставляют проводить измерения на пределе разрешающей способности микроскопа, что неизбежно ведет к появлению соответствующих ошибок. Во-вторых, результаты окрашивания могут несколько варьировать, так что С-сегменты могут выглядеть более Шли менее крупными в зависимости от интенсивности окрашивания. Данный эффект может усиливаться при фотографировании. В-третьих, гетерохроматиновые сегменты конденсируются не одновременно с эухроматиновыми участками, поэтому относительные размеры сегментов варьируют в зависимости от степени конденсации хромосом.

Многие исследователи не пытаются определять размеры полиморфных С-сегментов, но тем не менее делают в отношении них важные заключения. Официальные рекомендации, существующие для описания полиморфизмов человеческих хромосом [51], предполагают классификацию их по пяти категориям, однако часто бывает трудно распознать более трех (мелкие, средние и крупные). Во всяком случае при отсутствии какого-либо стандарта трудно проводить сравнение полиморфизмов у разных индивидуумов. В качестве стандарта для человеческих хромосом было выбрано короткое плечо 16-й хромосомы (16р) [52], и С-сегменты предлагается классифицировать по отношению к данному плечу. Такого рода стандарты, по-видимому, не были предложены для других видов, хотя подобную процедуру во многих случаях следовало бы делать, если нельзя использовать действительно количественные методы.

Для хромосом с вариабельными С-сегментами можно измерять длину хромосом [53] или содержание ДНК [54], а затем сравнивать их с гомологами или с какими-либо другими хромосомами, не содержащими заметно варьирующих С-сегментов [в человеческом кариотипе к таким относятся хромосома 2 или группа F (хромосомы 19—20)]. Хотя при этом сам по себе вариабельный сегмент и не измеряется, такие методы очень полезны, особенно в отношении С-сегментов.

Многие авторы делают попытки проводить прямые измерения размеров С-сегментов, соотнося их с размерами целых хромосом. Такие определения можно проводить с помощью простых профилей [55] или путем интегральных измерений целых хромосом [56]. Недавно для решения данной проблемы были применены анализаторы изображения [57]. Однако какой бы метод не использовался, в дополнение к описанным выше проблемам существует еще одна — где провести границу С-сегмента. Сравнение разных подходов к решению данной проблемы проводится в работе Мэзона и др. [56].

В некоторых случаях видно, что С-сегменты разделяются на субъединицы, число которых можно использовать для определения размера сегмента [58]. Для демонстрации субъединиц Вегнер и Павловитский [59] предложили использовать отражательную микроскопию. Метод подсчета субъединиц в С-сегментах достаточно объективен и не имеет тех недостатков, которые присущи методам, основанным на измерениях. В то же время не очевидно, что все субъединицы в сегментах эквивалентны [58], и, кроме того, в большинстве случаев в С-сегментах вообще не обнаруживается подразделения на субъединицы.

Метод измерения окрашенных серебром ядрышковых организаторов отличается от метода измерения С- сегментов в двух аспектах. Преимуществом первого метода является высокая степень контраста между черным организатором и бледно-желтой окружающей областью, благодаря чему уменьшаются проблемы, связанные с интенсивностью окраски. Но с другой стороны, размеры ядрышковых организаторов очень малы, из-за чего измерять их еще более трудно, чем С-сегменты. Успешные измерения посеребренных ядрышковых организаторов были выполнены с помощью системы анализа изображения с высоким разрешением Zeiss MicroVideomat (Zeiss, Oberkochen) [60]. С помощью данной установки окрашенные серебром области измерялись с ошибкой всего лишь в 1%.

Задача определения полиморфизмов в( хромосомах человека по флуоресценции акрихина отличается от задачи измерения полиморфизмов в случае С-сегментации и серебрения ядрышковых организаторов, поскольку

211