2.1. Митохондрии как первичный объект повреждения и индукции пероксидативного состояния в клетке

Как уже отмечалось в п.1.1.1, в ответ на рост рО₂ в земной атмосфере живая природа реализовала систему защитных механизмов, предохраняющих клетку от избыточного накопления в ней токсических продуктов ПОЛ. Антиоксидант-ная система защиты, по общему мнению исследователей (Барабой и др., 1992; Gutteridge, 1995 и др.), является иерархической и осуществляется не менее чем на трёх уровнях (Лю, Ефимов, 1976; Лю, Шайхутдинов, 1991).

Первая и основная ступень защиты – антикислородная. За счёт активности дыхательных ферментов и специальной группы соединений, депонирующих избыточный О₂, данная ступень поддерживает внутри клеток довольно низкие значения рО₂, порядка 1-5 мм рт. ст., достаточные, однако, для тканевого дыхания и энергообеспечения. Выводы о глубокой внутриклеточной гипоксии в большинстве нормальных тканей с достаточно высокой оксигенацией внеклеточного пространства считаются надёжными, так как однозначные результаты получены различными методами и в независимых исследованиях (Ярмоненко, Эпштейн, 1977). Действительно, в ряде последующих работ подтверждено, что измеренное в цитозоле клеток (кардиомиоциты, гепатоциты и др.) значение рО₂ составляет всего 0,4-4,0 мм рт. ст. (Gaeski, Honig, 1986; Makiguchi et al., 1987). Непосредственно же около митохондрий предположительно рО₂ 1 мм рт. ст., а в их матриксе – 0,01-0,1 мм рт. ст., т.е. на уровне критического рО₂ для цитохромоксидазы как терминального фермента дыхательной цепи (Иванов, 1996). По ещё одним сведениям (см. Скулачев, 2001), цитохромоксидаза может восстанавливать О₂ даже при в 100 раз меньших его концентрациях, чем в воде при нормальном атмосферном давлении.

Анткислородная линия защиты не в состоянии, вероятно, полностью предотвратить возможные негативные последствия избыточного ПОЛ, поскольку необходимые для него свободные радикалы образуются в процессах нормального метаболизма и индуцируются различными агентами. Кстати, особенности электронной структуры молекулы О₂, выступающей в роли акцептора электронов, предопределяют синтез О , Н₂О₂ и НО˙ в качестве нормальных промежуточных продуктов превращения О₂ + 4 е + 4 Н⁺ → 2 Н₂О. Эта реакция складывается фактически из 4-х одноэлектронных переходов, в ходе которых и порождаются указанные АФК (Бохински, 1987):

О₂ + 1 е → О ;

О + 1 е + 2 Н⁺ → Н₂О₂;

Н₂О₂ + 1 е + Н⁺ → Н₃О₂ → Н₂О + НО˙;

НО˙ + 1 е + Н⁺ → Н₂О

: О₂ + 4 е + 4 Н⁺ → 2 Н ₂О.

Поэтому существуют последующие более «тонкие» ступени защиты – анти-радикальная и антиперекисная, надёжная работа которых зависит от исправного функционирования антикислородной линии защиты. При безупречном действии последней роль третьей из названных ступеней может даже казаться незначительной или действительно быть таковой. Примером тому служат мыши с недостаточностью клеточной GPX, которые развиваются нормально, не обнаруживая повышенную чувствительность к гипероксии. У таких мышей не выявлено каких-либо изменений в утилизации экзогенной Н₂О₂, содержании карбонильных групп в белках и пероксидации липидов (Ho et al., 1997).

С другой стороны, дефекты в антикислородной линии защиты могут определять гипероксию и пероксидацию в клетке, неэффективность всей анти-оксидантной системы. Правда, на случаи возникновения подобных ситуаций природой, похоже, предусмотрен механизм усиления последующей антипере-кисной ступени, как бы нацеливающей последнюю на возрастающую на неё нагрузку. Принципиально такая возможность, на наш взгляд, заложена сущес-твованием в 5´-фланкирующей области гена GPX человека так называемого элемента реакции на О₂ – ORE1, а также нескольких копий сайтов связывания фактора транскрипции АР-1 (Jornot, Jurnod, 1997). Здесь важно выяснить, на какой диапазон изменений рО₂ «рассчитана» реакция указанного элемента. Авторы цитируемой работы, исследуя на культуре эндотелиальных клеток механизмы ORE1-опосредованной индукции гена GPX в условиях гипероксии, установили: при повышении содержания О₂ (до 95 %) в атмосфере увеличи-ваются скорость транскрипции гена GPX и концентрация мРНК-GPX. Однако само действие и (или) эффективность такого механизма при реально возможных in vivo значениях внутриклеточной гипероксии требуют ещё доказательств.

2.1.1. Среди внутриклеточных органелл и многих биополимеров, подвергающихся воздействию канцерогенных факторов, изменение лишь некоторых из них ответственно за опухолевые последствия. Реальным первичным объектом такого воздействия с указанным исходом представляются, прежде всего, митохондрии – основные потребители О₂ в клетке. Обоснованию этой точки зрения в своё время был посвящён ряд обстоятельных обзорно-теоретических работ (Wenner, Tomei, 1981; Игнатова, 1984). «Митохондриальной» концепции на основе собственных систематических данных придерживается и Сигер (Seeger, 1985). Им показано, что в опухолевых клетках повреждены мембраны митохондрий и разрушена дыхательная цепь, окислительные процессы снижены и преобладают процессы брожения; любые липофильные вещества, способные вызывать повреждение митохондрий и инактивацию цитохромов, приводят к злокачественной трансформации клеточных культур. По данной логике, экзогенные ингибиторы дыхания также представляют собой канцерогены, непосредственно снижающие эффективность антикислородной ступени защиты. Действительно, в отношении ротенона – известного ингибитора митохондриального транспорта электронов – имеются прямые доказательства индукции им опухолей (Gosalvez, 1983). Но если объектом приложения того же роте-нона и других подобных ему ингибиторов, а также экзогенных прооксидантов окажутся уже состоявшиеся опухолевые клетки, то последние, скорее всего, подвергнутся апоптозу типа А2 или окислительному цитолизу (см. п.7.1) вследствие установления в них более высоких, чем до воздействия указан-ных агентов, уровней АФК и ПОЛ. Отдельные факты такого рода известны (Теплова и др., 1999).

Несколько раньше убедительные литературные и собственные факты о воздействии на митохондрии химических канцерогенов различных классов представили Кобляков и Рябых (1977). Уже на ранних стадиях гепатоканце-рогенеза ими обнаружены такие эффекты, как торможение дыхания и нару-шение структуры митохондрий. В этом отношении особенно показательны следующие данные (Boitier et al., 1995). Через 19 мес после применения диэтилнитрозамина в митохондриях гепатомы складываются выраженный дефицит комплекса I и снижение активности комплекса III дыхательной цепи. Одновременно в этих органеллах снижается активность антиоксидантных ферментов, а концентрации О и Н₂О₂ соответственно повышаются. Ответственными за инактивацию комплексов I и III дыхательной цепи являются, предположи-тельно, супероксидные радикалы.

Чен с соавт. (Chen et al., 1984), сравнивая различные параметры митохондрий в опухолевых и нормальных клетках культур различных линий, выявили значительные различия по одному или нескольким признакам: числу, длине, размеру, морфологии, распределению, подвижности, мембранному потенциалу, градиенту рН и др. По некоторым из них оценивались жизненные функции митохондрий и нарушения механизма дыхания у опухолевых клеток, а такие изменения митохондрий, как снижение их числа, дефектное дыхание, изменение топографии рассматриваются ими в качестве сопутствующих опу-холевой трансформации. На уменьшение количества и размера митохондрий, упрощение их ультраструктуры и полиморфность в опухолевой клетке по сравнению с нормальной ранее указывали и другие исследователи (Шапошников, Киселев, 1978; Голубев, 1981; Azgiles, Azcon-Bieto, 1988), причём снижение мощности митохондриальной системы представляют как коканцерогенный фон, способствующий малигнизации клеток и, возможно, приводящий к ней (Гобеев и др., 1978).

Согласно материалам международного симпозиума (Амстердам, 1985), связь между митохондриями, ядром и клеточной мембраной вновь поднимает старый вопрос об участии митохондрий в канцерогенезе. Более того, концепция использования при химиотерапии противомитохондриальных веществ основана на представлении о том, что митохондрии в раковых клетках дефектны. В последующие годы корреляция канцерогенеза с недостаточностью митохон-дриального дыхания подтверждалась неоднократно. Так, в исследованных гли-омах человека выявлены изменения структуры крист и плотности матрикса митохондрий, а переключение энергетического метаболизма в глиомах на гликолиз связывается с низким содержанием в них нормально функционирующих митохондрий (Oudard et al., 1997). В ряде других работ обобщены данные о снижении в опухолевых клетках количества и качества митохондрий, рассмотрены различные аспекты канцерогенеза, включая мутагенез, поддержание озлокачествлённого фенотипа и участие в этих процессах митохондрий (см., например, Capuano et al., 1997; Cavalli, Liang, 1998; Reed, 1999). К разряду подобных событий относится и то, что мутации в гене SDHD, кодирующем один из белков комплекса II дыхательной цепи митохондрий, играют важную роль в патогенезе определённых опухолей, в частности, при наследственной паранглиоме, которая характеризуется развитием доброкачественных васкуляризованных опухолей головы и шеи (Baysal et al., 2000).

Внутри митохондрий объектом прямой атаки некоторых канцерогенных факторов могут быть не только дыхательные ферменты, но и ДНК Последняя, как известно, кодирует ряд необходимых для сборки и функционирования митохондрий белков, в том числе ферментов дыхательной цепи. В результате подавляются синтез ряда митохондриальных цитохромов, транспорт электронов и окислительное фосфорилирование. Так, полициклические ароматические соединения разных канцерогенных потенций связываются с мтДНК в десятки и сотни раз больше, чем с ядерной (Wilkie et al., 1983). Индекс ковалентного свя-зывания метаболитов канцерогенного гексахлорбутадиена для яДНК из почек мышей, получавших данный препарат, составляет 27, а для ДНК из печени – всего 6. Для мтДНК же из почек и печени тех же животных этот индекс очень высок и равен соответственно 7500 и 500 (Schrenk, Dekant, 1989). Одна из причин подобной предпочтительности состоит в том, что «вилки репликации мтДНК как наиболее уязвимое место для воздействия канцерогенов и митогенов присутствуют в клетках на протяжении всего клеточного цикла, что не наблюдается для репликативных вилок в ядре» (Игнатова, 1984). Кроме того, яДНК менее уязвима для повреждающих факторов вследствие защищённости различными белками и суперскрученности.

Считают также, что мтДНК более чувствительна к химическим канцеро-генам из-за окруженности её липидсодержащей мембраной, способной акку-мулировать липофильные канцерогены, в частности 3,4-бензпирен. Более того, митохондриальные ДНК, ДНК- и РНК-полимеразы тесно ассоциированы с этой мембраной и потому могут подвергаться воздействию накапливаемых в ней канцерогенов, что приведёт к нарушению синтеза и транскрипции мтДНК (Виленчик, 1985). Подробнее эффекты взаимодействия химических канцерогенов с митохондриями рассмотрены в п.6.2 нашей предыдущей монографии (Лю, Шайхутдинов, 1991).

Известны факты высокой чувствительности мтДНК и к некоторым лечеб-ным химиопрепаратам, Например, после воздействия на клетки яичников китайского хомячка цисплатином содержание аддуктов в мтДНК почти на порядок превышало таковое в яДНК. Кроме того, в мтДНК в отличие от яДНК отсутствовала репарация. Количественные оценки аддуктов получены с помощью иммунологического детектирования ДНК и подтверждены методом электронной микроскопии с коллоидным золотом (Olivero et al., 1996). Чувстви-тельность мтДНК к канцерогенам и антиканцерогенам, многократно превышающая таковую яДНК, установлена и в ряде других работ (Ames et al., 1993; King, 1995).

По указанным выше причинам экспрессия митохондриальных генов, в том числе кодирующих компоненты системы окислительного фосфорилирования, в опухолях нарушается. Например, по данным Нозерн-блотинга, в опухолях почек различных типов и в полученных из них стабильных клеточных линиях стационарная концентрация мРНК – транскриптов мтДНК снижена по срав-нению с нормальной почечной тканью (Faure-Vigny et al., 1996). С другой стороны, отмечаются факты модификации ядерного генома опухолей фраг-ментами мтДНК. Так, исследование блот-гибридизацией по Саузерну мтДНК-подобных вставок в яДНК показало, что содержание и мобильность их в опухолях мыши и крысы существенно выше, чем в гомологичных нормальных тканях (Hadler et al., 1998).

Некоторые из ферментов митохондрий в клетках неоплазмы (цитохром с, цитохромоксидаза, сукцинатдегидрогеназа, малатдегидрогеназа и др.) характе-ризуются, как правило, пониженной активностью (Дмитриева, 1977; Гобеев, Березов, 1979 и др.). Причины падения активности этих ферментов разные, но главные – это их прямая или косвенная инактивация, а также уменьшение содержания некоторых из них в митохондриях. Особого внимания среди дыха-тельных энзимов заслуживает терминальная цитохромоксидаза. В составе электроно-транспортной цепи она «работает» на антикислородной линии защиты, способствуя установлению низких значений внутриклеточного рО₂. А по некоторым данным (Налбадян, 1984), цитохромоксидаза обладает и SOD-актив-ностью. Перехватывая О , она защищает в своём микроокружении «собственные» липиды в реакции ПОЛ. Торможение процессов ПОЛ возрастает при увеличении концентрации цитохромоксидазы и полностью устраняется различными её ингибиторами. По этим фактам цитохромоксидаза выполняет, по существу, двойную антиоксидантную функцию на двух первых ступенях защиты. Поэтому инактивация или повреждение её в составе антиоксидантной системы должны быть особенно «чувствительными» с точки зрения возможных пероксидативных последствий в клетке.

Нарушение антикислородной ступени защиты может начаться уже на стадии «митохондриального» старения клетки (см. п.1.3) и затем в ускоренном темпе продолжиться при трансформации её в опухолевую под влиянием канцерогенных факторов. К этому нарушению, возможно, причастны белковые ингибиторы дыхания, которые, по данным ряда исследований, синтезируются опухолевой клеткой. Они влияют на энергетические процессы нормальных клеток, угнетая в них дыхание и потребление О₂, т.е. создают энергетическую ситуацию, наблюдаемую в опухолях. Продолжая исследование природы обнаруженных ингибиторов дыхательных белков, Рапопорт с соавт. (Rapoport et al., 1979) установили их идентичность липооксигеназе (LOX), выделенной из ретикулоцитов крови анемичных кроликов. В присутствии этого фермента одновременно с LOX-действием происходит необратимая инактивация некоторых SH-ферментов. По данным этих авторов, существуют LOXs другого типа в лёгких, селезёнке, почках и эпителиальных опухолях. Механизм подавления LOX дыхательных ферментов тогда окончательно не был установлен.

Позже той же исследовательской группой показано, что LOX обратимо ингибирует цитохром-с-оксидазу в митохондриях и субмитохондриальных частицах сердца быка путём химической модификации фосфолипидов (Rapoport, Schewe, 1986), активация же митохондриальной 12-LOX ведёт к дезынтеграции митохондрий при созревании ретикулоцитов в эритроциты (Schnurr et al., 1996). Более того, было сформулировано общее положение об участии LOX в программированной деградации разных внутриклеточных органелл в процессе дифференцировки не только ретикулоцитов, но и ряда других специализи-рованных типов клеток (Van Leyen et al., 1998). Перед началом деградации органелл LOX интегрируется в их мембраны и, увеличивая проницаемость, способствует высвобождению содержимого органелл, доступности их белков для действия протеаз.

Приведённые выше убедительные факты снижения количества и качества митохондрий в опухолевых клетках объясняют сравнительно низкую энергети-ческую эффективность их дыхания по сравнению с таковой клеток гомологич-ных нормальных тканей (Голубев, 1981; Chen et al., 1984; Seeger, 1985; Azgiles, Azcon-Bieto, 1988; Schmidt et al., 1991; Baggeto, 1992; Luciakova, Kuzela, 1992; Capuano et al., 1997 и др.). Отрицать это принципиально важное изменение и его последствия для судеб соответствующих клеток, считая их ошибочными, по крайней мере, не логично. К тому же, следует иметь в виду, что данные сдвиги объективно начинают возникать уже в доканцерогенезный период, на стадии старения клеток (см. главу 1), более выражено проявляясь в ходе и после их трансформации.

Таким образом, доказательность многих исследований о недостаточности окислительного фосфорилирования в митохондриях опухолевых клеток не вы-зывает сомнений. Тем не менее, иногда гипотезы с противоположным мнением продолжают высказываться. Например, Рэй и Рэй (Ray, Ray, 1997), признавая резкое изменение в злокачественных клетках части дыхательной цепи (митохондриального комплекса I), полагают всё же, что именно это обстоятельство приводит к избыточному образованию АТР в указанных клетках и создаёт тем самым необходимые энергетические условия для их роста, размножения и окончательного становления свойств злокачественности. Следует, однако, приз-нать, что повышение продукции АФК при канцерогенезе через первичное повреждение митохондриального дыхания есть, хотя и главный, но не единст-венный путь. Некоторые канцерогены сами являются источником ферментатив-ного возникновения из них АФК (О ). К таковым относится, в частности, 4-нитрохинолин-N-оксид, причём образование аддукта супероксидного радикала, 5,5-диметил-1-пирролин-N-оксида, ингибируется SOD (Fann et al., 1999).

Приведённым выше фактам, вообще говоря, противоречат данные о том, что в клетках различных опухолей (лимфомы, гепатомы, рака предстательной железы и др.) наряду со снижением числа митохондрий и активности дыхательных ферментов возрастает экспрессия кодирующих их митохондриальных генов. Подробная информация на этот счёт приведена недавно в статье Николаева с соавт. (2001) и в цитируемых ими работах. В частности, отмечается повышение уровня экспрессии генов субъединицы 2 цитохром-с-оксидазы, субъединицы 4 NADH-дегидрогеназы, субъединицы 6 ATP-синтетазы, цитохрома b и некоторых других. Увеличение транскрипционной активности указанных генов при снижении в трансформированной и опухолевой клетках количества митохондрий связывается с необходимостью поддержания в них нуж-ной скорости дыхания, с созданием и (или) поддержанием злокачественного фенотипа этих клеток. Здесь действительно просматривается ответная «компенсирующая» реакция клеток на ослабление в них окислительного фосфорилирования, но какие конкретно особенности или обстоятельства внутри опухолевых клеток индуцируют указанный адаптивный ответ, пока точно неизвестно.

Можно предполагать, что в митохондриях, как и в ядре, экспрессия некоторых генов рО₂- или АФК-зависима. Известны, по крайней мере, несколько работ (Murphy et al., 1984; Suzuki H. et al., 1998), в которых рассматривается О₂-зависимый механизм регуляции количества дыхательных ферментов. По этой логике, в опухолевой клетке с её относительной гипероксичностью (см. п. 2.1.3) экспрессия каких-то митохондриальных генов окислительного фосфорилирования и должна возрастать. Однако в тех же условиях опухолевой клетки эти адаптивно-защитные меры оказываются малоэффективными, так как синтезируемые ферменты дыхательной цепи частично подвергаются прямой или косвенной (через ПОЛ внутренней мембраны митохондрий) инактивации.

Есть ещё работа (Макаренко и др., 1992), в которой обнаружена исходно достоверная разница в содержании митохондриальных цитохромов в ткани печени между низко- и высокоустойчивыми к гипобарической гипоксии кры-сами. Как оказалось, у первых содержание цитохромов b, c, c₁ и a было достоверно выше, чем у вторых. Связь степени устойчивости к гипоксии с количеством дыхательных ферментов представляется нам естественной, но проявляется она косвенно, через уровень внутриклеточного рО₂. При более высоком содержании цитохромов утилизация О₂ митохондриями должна происходить интенсивнее, соответственно снижается и рО₂ в клетке. Если такая клетка к тому же оказывается в условиях гипобарической гипоксии, то устойчивость её к последней будет, очевидно, низкой по сравнению с клеткой, где указанного снижения рО₂ при малом содержании цитохромов не происходит. Приведённая интерпретация рассматриваемого факта согласуется с зависимостью содержания дыхательных ферментов в клетке от уровня рО₂, и наоборот. По той же причине опухолевые клетки с недостаточностью их дыхания и относительной гипероксией должны быть устойчивы к гипоксии.

2.1.2. Некоторые эффекты, связанные со снижением интенсивности дыха-ния и другими особенностями биоэнергетики предопухолевых и опухолевых клеток, можно прогнозировать. Прежде всего, следует ожидать в них дальней-шего уменьшения потребления О₂ митохондриями (в сравнении с таковым в клетках при нормальном их старении) и как принципиально важное следствие этого более выраженного повышения внутриклеточного рО₂. Данное представ-ление поддерживается хорошо известными в прошлом работами. Так, иссле-дование пространственного распределения рО₂ внутри нервной клетки с помощью математической модели показало чрезвычайно высокую чувствитель-ность внутриклеточного рО₂ к изменению интенсивности дыхания (Иванов, Кисляков, 1974). Эта зависимость оказалась нелинейной: незначительное уменьшение интенсивности дыхания приводило к резкому возрастанию рО₂ в центре нейрона. Ничто не мешает экстраполировать возможность подобного эффекта в принципе в любой клетке организма. К такому же выводу пришёл Березовский (1975), полагая, что в животных клетках ослабление дыхания резко увеличивает внутриклеточное рО₂. На возможность накопления О₂ благодаря нарушениям транспорта электронов через цитохромные системы указано также Манойловым (1968) и Лукьяновой ссоавт. (1982).

На достоверную связь между интенсивностью митохондриального дыхания (содержанием митохондрий) и потреблением О₂ клеткой убедительно указы-вают и такие факты (Hoppeler et al., 1987). В состоянии покоя потребление О₂ в изолированной мышце кошки с преобладающим гликолитическим метаболиз-мом (тип I) в 3-5 раз меньше, чем в мышце с преимущественным окислитель-ным метаболизмом (тип II) и мышце I, трансформированной в II под действием низкочастотной электростимуляции (тип III). Оказалось, что объём митохон-дрий в мышце типа I составляет лишь 1/2 от их объёма в мышце II и 1/3 от объёма митохондрий в мышце III. Значительных различий (в величинах площадей наружной и внутренней мембран, приходящихся на единицу объёма) в структуре митохондрий у различных видов мышц не обнаружено. С указанных позиций стоит обратить внимание на то, что критика концепции Варбурга часто сводится к утверждению: дыхание в опухолевых клетках достаточно активно, не повреждено, хотя и несколько ниже по интенсивности, чем в нормальных клетках. Между тем, согласно изложенному выше, этого «несколько ниже» (в пределах, например, 15-30 %) должно быть достаточно для создания в трансформируемых и опухолевых клетках гипероксии.

Характер изменения величины рО₂ в самих «дышащих» опухолевых клет-ках от потребления ими О₂ принципиально не отличается от указанного выше. Об этом свидетельствуют следующие материалы (Zander et al., 1978). Клетки карциносаркомы инкубировали при рО₂, равном 660 мм рт. ст. Потребление ими О₂ регулировали путём изменения температуры от 4 до 40^оС. Уже при 37^оС внутриклеточная концентрация О₂ оказалась низкой, а вокруг каждой опухо-левой клетки образовывалась зона, в которой рО₂ было значительно ниже, чем в остальном пространстве, Эта гипоксическая область расширялась до 3,2 мкм вокруг сферической клетки диаметром ~14 мкм, если потребление О₂ увели-чивалось с повышением температуры до 40^оС. При 4^оС потребление О₂ было минимальным, и в этом случае внутриклеточная концентрация О₂ становилась равной внеклеточной.

Таким образом, подобно тому, как в любой ёмкости с входным и выходным патрубками для протекания какого-либо газа давление будет снижаться при увеличении потребления этого газа и, наоборот, повышаться при уменьшении его расхода, рО₂ внутри клетки и потребление ею О₂ находятся в обратной зависимости. Последняя носит односторонний характер, т. е. справедлива, если реализуется только лишь по «инициативе» самой клетки путём изменения ею потребления О₂. Указанная, по существу, тривиальная зависимость отражает фундаментальный закон диалектического материализма – закон сохранения вещества и энергии применительно к обсуждаемым здесь связанным биохими-ческим процессам в клетке.

2.1.3. Из постулируемой нами модели следует, что в клетках неоплазмы воспроизводится состояние фиктивной гипоксии, при которой даже избыток О₂ не может быть эффективно использован для дыхания, а степень повышения рО₂ в значительной мере определяется степенью инактивации дыхательных ферментов и деградации митохондрий. Конкретные схемы, приводящие к состоянию гипероксии и пероксидации при различных видах канцерогенеза, рассмотрены нами ранее (Лю, Шайхутдинов, 1991), а также в соответствующих главах данной монографии. Таким образом, «гипоксия» при гипероксии явля-ется, по-видимому, характерным состоянием истинно опухолевой клетки. Последующие поколения её также будут опухолевыми, если в них каким-то образом могут быть воспроизведены важные по данной модели условия под-держания трансформированного состояния – повышенное внутриклеточное рО₂ и активация ПОЛ, приводящие, в конечном счёте, к дестабилизации всех мемб-ранных структур и принудительному перепрограммированию части генома.

Следует особо отметить, что в своей биохимической теории рака Варбург прошёл мимо указанных идей, особенно ключевой идеи о внутриклеточной гипероксии, детерминируемой снижением интенсивности дыхания. От утверж-дения о неполноценности дыхания он не перешел к мысли о накоплении в клетке кислорода вследствие уменьшения его потребления митохондриями. Более того, согласно точке зрения Варбурга, возникновение опухолей связано с фактическим постоянным недостатком О₂, вызванным теми или иными затруд-нениями в снабжении О₂, развитием в этих условиях высокой гликолитичес-кой активности, которая компенсирует возникший дефицит энергии. В таком состоянии теория Варбурга была не способна обобщить и объяснить многие принципиальные факты канцерогенеза и механизм злокачественного пере-рождения клеток в целом.

Пространственно-временнόе распределение общего снижения дыхания в митохондриях опухолевой клетки, по-видимому, никем ещё не исследовалось. Если исходить из того, что с физико-химической и структурной точек зрения в составе митохондрий выделяется элементарная единица митохондриальной активности (см. Струков, Пауков, 1969; Озернюк, 1978), то указанная дыхатель-ная недостаточность определяется числом инактивируемых и, следовательно, выключаемых из системы параллельно функционирующих элементарных час-тиц по производству АТР. Согласно давним исследованиям, каждая такая элементарная частица в виде грибовидного отростка на внутренней мембране митохондрий состоит из трёх частей: сферической головки диаметром 80-100 Å, где локализуется АТР-аза, цилиндрической ножки длиной 50 Å и диаметром 30-40 Å и основания со сторонами, равными 40-110 Å, в котором расположены ферменты цепи переноса электронов. Грибовидные отростки расположены на мембране регулярно через каждые 110-115 Å в количестве 2000-4000 на 1 мк² (Fernandez-Moran et al., 1964). Периодически повторяющиеся наборы дыхатель-ных ферментов (дыхательные ансамбли), составляющие свыше 25 % массы митохондриальных белков, были выделены Грином с соавт. (Green et al., 1967). Эти частицы способны катализировать реакции переноса электронов от NADH и сукцината на О₂. При соответствующей обработке из частиц Грина выделены 4 олигоферментных функциональных комплекса дыхательной цепи.

Процесс «выбивания» отдельных элементарных частиц митохондриальной активности экзогенными или эндогенными канцерогенными факторами вначале определяется, по-видимому, случайными обстоятельствами и, в частности, зависит от характера распределения этих факторов в мембранах со встроенными в них элементарными «генераторами» АТР. Однако после того как в клетке устанавливается состояние гипероксии и пероксидации, выпадение липидо-зависимых элементарных частиц должно (по крайней мере, в пределах одной митохондрии) распределяться по площади указанных мембран более или менее равномерно. Но в любом случае снижение дыхания в малигнизируемой и опухолевой клетках может происходить только дискретно, пропорционально количеству выводимых из строя элементарных структурных единиц митохон-дриальной активности.

Обсуждаемой модели канцерогенеза, казалось бы, противоречат известные материалы, согласно которым рО₂ в опухолях относительно низкое, причём в направлении от глубинных областей к периферии оно повышается (Шапот, 1975). Подавляющее большинство исследователей считает, что гипоксия является чуть ли не врождённым свойством опухолевых клеток, постоянно якобы находящихся в режиме фактического кислородного голодания. Между тем, низкое рО₂ внутри неоплазм может быть лишь результатом их нерегулируемого роста, объёмного расположения и относительности бедности капиллярной сети, но не отражением какого-то характерного свойства самих опухолевых клеток вообще. Если доставка О₂ к клеткам внутренних участков опухоли лимитиро-вана ограниченным кровоснабжением, которое для некоторых экспериментальных неоплазм связано с их размерами обратной зависимостью (Siracka et al., 1979), то клетки опухоли, периферийные и прилежащие к нормально действующим кровеносным сосудам, снабжаются кислородом в достатке. Именно эти клетки в соответствии с излагаемым нами механизмом являются активными, истинно опухолевыми в отличие от внутренних и удалённых от сосудов действительно гипоксических и некротических клеток. Щелкунов (1971), характеризуя развитие раковых эпителиев в зависимости от степени их контакта с кровеносными капиллярами, отмечал, что динамика роста этих малигнизи-рованных тканей в органе определяется лишь положением указанных капилляров. Соответственно их положению и идёт направленный рост неоплазмы, протекающий неравномерно. Наиболее интенсивно разрастаются те участки эпителия, которые лежат в непосредственном соседстве со стенкой крове-носных капилляров.

Аналогичные наблюдения приводят и другие исследователи. Так, методом, основанным на послеоперационной перфузии, выявлены пролиферативные зоны в аденокарциноме почки человека. В диффузионную жидкость, приво-димую в движение насосом, добавляли Н- или С-тимидин. Пролиферативные зоны определяли на радиоавтографах. Установлено, что размножающиеся клетки в различных зонах опухоли располагались преимущественно около поддер-живающей стромы. Индекс метки уменьшался в направлении от сосудов к периферии солидных опухолевых тяжей и был наиболее интенсивен в участках опухоли, прилежащих к нормальной ткани почки (Rabes et al., 1978). В другой работе (Hirst, Denekamp, 1979) в опытах на мышах с перевиваемой карциномой КНН показано, что опухоли образуют вокруг сосудов муфты, состоящие из 6-7 слоев клеток и окружённые очагами некрозов. Показатели пролиферации клеток во внутренней, промежуточной и наружной зонах муфт, каждая из которых состояла из 2-3 слоев клеток, различаются существенно. Так, фракция пролиферирующих клеток во внутренней зоне составляет 100 %, а индекс меченых клеток – 52; в наружной зоне эти показатели равны соответственно 58 % и 12. Длительность всех фаз клеточного цикла во внутренней зоне муфт короче, чем в наружной.

При изучении в динамике ультраструктурной перестройки кровеносных капилляров мозга животных с имплантированными в правое полушарие пилю-лями с диметилбензантраценом в эндотелиальных клетках обнаружен ряд стру-ктурных изменений. Они свидетельствовали об активном участии располо-женных вблизи канцерогена капилляров в развитии предракового процесса, заканчивающегося образованием у большинства животных опухолей вокруг указанной пилюли с канцерогеном (Марданова, 1980). Следовательно, нормально действующие кровеносные сосуды необходимы как на стадии возникновения, так и для поддержания активного размножения и роста опухолевых клеток, локализованных вблизи этих сосудов. О зависимости роста опухолевой массы от наличия и развития полноценных мелких сосудов показывает и такой расчёт. В различных опухолях один эндотелиоцит, секретируя фактор роста сосудистого эндотелия и, следовательно, поддерживая развитие сосудов, обеспечивал существование 5-50 опухолевых клеток. На основании этих и других данных автором работы (Folkman, 1998) предложен общий механизм регуляции массы ткани эндотелиоцитами сосудов.

В целом развиваемые нами представления приводят к выводу о том, что на периферии опухолей и вдоль нормально функционирующих в них кровеносных сосудов должен существовать определённый, непрерывно воспроизводимый слой гипероксических опухолевых клеток, величина рО₂ в которых постоянно превышает таковую в гомологичных им нормальных клетках. Эта особенность клеток активных зон опухолей должна, как видно из предыдущего, отражать принципиальнейший момент в возникновении и характере роста новообразований. Она предопределяет, в частности, устойчивое распространение опухолевого процесса «вширь» за счёт незатухающей активности периферийного слоя. О толщине его можно лишь догадываться, однако представляется всё же, что слой этот достаточно тонкий и в каждой конкретной неоплазме варьирует как в процессе её роста, так и в разных участках по её периферии. Например, по давним сведениям (Франкфурт, 1975), в гепатоме 22 мышей периферийные участки опухоли с высоким индексом метки занимают лишь слой толщиной в 20-30 клеток. Очевидно, чем больше объём опухоли, тем меньшую долю в нём будет занимать узкий активно растущий периферийный слой. При анализе усреднённых проб из опухоли указанный малообъёмный активный слой окажется, скорее всего, скрытым. С изложенным выше согласуются и данные по изучению роста in vitro клеток астроцитарной глиомы крысы в течение 50-311 ч (Bru et al., 1998). Опухоли, возникавшие в культуральной среде, росли главным образом за счёт образующих их контур клеток. Локальная кривизна опухолевой поверхности определялась способностью делиться именно периферийных клеток, а сверхнеровный рост опухолей связан, несомненно, с различной активностью периферийного слоя на разных его участках.

И ещё. Активный неконтролируемый рост периферийных клеток опухоли воспринимается сначала как феномен, не совместимый с упомянутым выше снижением в их митохондриях числа элементарных единиц по производству ATP. Однако имеющиеся факты говорят об обратном, т. е. о том, что падение уровня ATP – необходимый регуляторный момент для начала и облегчения репликации ДНК, а повышение уровня ATP в ядерном компартменте угнетает репликацию ДНК и клеточную пролиферацию (см. п. 1.1.2). Данное положение подтверждается и следующим фактом. Иммортализованные фибробласты че-ловека (линия KMST-6) под влиянием ATP (0.4 ммоль/л) заметно снижали скорость пролиферации, синтез же их ДНК оказывался супрессированным (Li J.-W., 2000).

2.1.4. Превышение рО₂ в клетке сверх уровня нормальных вариаций как следствие менее интенсивного дыхания и некоторого выравнивания рО₂ внутри и вне её создаёт угрозу глобального токсического воздействия повышенных концентраций О₂ на все структуры клетки. Это действие выражается в том, что О₂ наряду с другими факторами непосредственно причастен к усилению свободнорадикального окисления фосфолипидов, возрастанию различных, в том числе перекисных, свободных радикалов и самих липидных перекисей. Фосфолипиды вследствие известной химической «слабости» легко подвергаются окислительной деструкции молекулярным О₂. Подобный исход при гипероксии наиболее опасен для мембран ввиду способности О₂ в высоких концентрациях растворяться во внутренних, гидрофобных их участках (Butterfield, McGraw, 1978)., которые содержат больше, чем наружные, легко окисляемых фракций фосфолипидов. Исследование диффузии и растворимости О₂ в липидных бислоях липосом по спиновому обмену между иминоксильной меткой и О₂ обнаружило уширение линий поглощения спиновой метки в спектре ЭПР. Уширение оказалось пропорциональным величине Dα – произведению коэффициента диффузии и растворимости О₂. Наибольшее значение величина Dα принимает в центральной зоне бислоя и наименьшее – вблизи полярных концов молекул липидов (Windrem, Plachy, 1980), что подтверждает прежние данные о харак-тере распределения растворённого О₂ в биологических мембранах.

Активация ПОЛ биологических мембран под влиянием гипероксии была в своё время подтверждена во многих работах (Владимиров, Арчаков, 1972; Turrens et al., 1982 и др.). Этот процесс протекает с участием различных АФК – О , ¹О₂, ОН˙, Н₂О₂, что давно уже доказано с помощью разных физико-хими-ческих методов (Fridovich, 1979; Афанасьев, 1984; Cerutti, 1985). Скорость же образования АФК в ходе многочисленных ферментативных и неферментативных реакций и самоокисления различных соединений прямо зависит от рО₂ (концентрации О₂): при повышении последних она увеличивается, а при понижении – уменьшается (Fridovich, 1975; Скулачев, 2001). У позвоночных живот-ных скорость образования АФК тесно связана также со скоростью потребления О₂ и пропорциональна количеству митохондрий в клетках (Ames et al., 1995).

С другой стороны, недостаточное митохондриальное дыхание (потребление О₂), ответственное за гипероксию в предопухолевых и неопластических клет-ках, должно приводить к повышению в этих клетках содержания различных АФК, так как увеличение концентрации О₂ стимулирует внутриклеточную про-дукцию его активных форм митохондриями, микросомами, пероксисомами, ферментами цитозоля, а также в ходе неферментативных процессов окисления, прежде всего липидов. Одним из таких фактов можно считать, например, сооб-щение о повышенном содержании в клетках рака молочной железы женщин АФК и MDA, с чем связываются сниженный уровень кофермента Q₁₀ и высокая экспрессия ферментов SOD, GPX и каталазы в опухолевой ткани в сравнении с окружающей неопухолевой (Portakal et al., 2000).

Подобные прооксидантные состояния вызываются химическими канцеро-генами, различного рода излучениями, гипербарической оксигенацией, инги-биторами антиоксидантных ферментов (Cerutti, 1985). Например, известный канцероген афлатоксин В₁ после однократной внутрибрюшинной инъекции значительно повышает уровень ПОЛ печени крыс. Подкожная же предобра-ботка бифлавоноидом тернатином (25 мг/кг) более чем на порядок уменьшала индуцированные афлатоксином возросшие концентрации MDA. Эффект тер-натина был сходен с действием витамина Е (300 мг/кг), и он признан как превентивный агент при индукции рака печени афлатоксином В₁ (Souza et al., 1999). Введение в/б крысам линии Wistar канцерогена N-метил-N-нитро-N-нитрозогуанидина повышало уровень ПОЛ в печени, что приводило к снижению содержания GSH и активностей GPX и глутатион-S-трансферазы. Предварительное же введение экстракта листьев чеснока и лука-перея значительно уменьшало интенсивность ПОЛ, повышало уровни антиоксидантов и активность детоксифицирующих ферментов в желудке, печени и крови животных (Arivazhagan S. et al., 2000). Важно отметить здесь, что после контакта организма животного с канцерогеном достоверное падение уровня компонентов антиоксидантной защиты в крови и мембранах клеток различных тканей происходит уже на самых ранних стадиях канцерогенеза, задолго до появления неоплазм (Сидоренко и др., 1999). Согласно развиваемой нами кислородно-перекисной концепции канцерогенеза, прооксидантные состояния рассматриваются как необходимое условие для злокачественной трансформации клеток (Лю, Ефи-мов, 1976; Лю, Саприн, 1980; Лю, Шайхутдинов, 1991).

Существенно, что различные промоторы канцерогенеза (форболовые эфиры и др.) также индуцируют в клетках окислительный стресс. Кобляков (1998) после анализа и обобщения множества работ о механизме действия индукторов суперсемейства цитохрома Р-450 как промоторов канцерогенеза пришёл к выводу: «уже на ранних стадиях канцерогенеза в инициированных клетках существуют условия для поддержания более высокого уровня АФК по сравнению с нормальными окружающими клетками, что может являться одним из факторов, определяющих избирательный рост инициированных клеток на каких-то стадиях промоции». Эти признания подтверждают наше давнее более кардинальное положение, лежащее в основе упомянутой кислородно-перекис-ной концепции канцерогенеза: при длительном воздействии избыточные количества АФК и продуктов ПОЛ могут быть не только промоторами канцерогенеза, но и его инициаторами. В поддержку данного представления впослед-ствии высказались и другие исследователи. Так, в статье «Кислород – наш основной канцероген?» (Joenje, 1983) также обсуждался вопрос о бластомогенности О , ¹О₂, ОН˙ и Н₂О₂ в предположении, что они, в основном, оказывают генотоксическое действие, предупреждаемое в норме клеточной антикислородной защитной системой. По данным обзора (Marnett, 1987), посвящённого роли пероксидных свободных радикалов в метаболической активации опухолевых процессов в коже, эти радикалы могут выступать как инициаторами, так и промоторами канцерогенеза.

С указанных позиций неудивительно, что АФК действительно вызывают трансформацию клеточных культур, являются опухолевыми промоторами и канцерогенным фактором (Cerutti, 1985). Например, О оказался полным канцерогеном (Zimmerman, Cerutti, 1984; Cerutti, Tramp, 1991). Н₂О₂ вызывает опухоли двенадцатиперстной кишки у мышей различных линий, причём частота этих опухолей находится в обратной зависимости от активности каталазы (Vuillaume, 1987). Здесь же показано накопление О и Н₂О₂ в различных опухолевых клетках, а также в лейкоцитах при воспалении. Антирадикальные и антиперекисные соединения тормозили рост перевиваемых неоплазм у мышей. Известный генератор свободных радикалов бензоилпероксид увеличивает частоту развития опухолей кожи у мышей после инициации канцерогенеза диметилбензантраценом, а при аппликации этого генератора на кожу животных с доброкачественными опухолями последние превращались в злокачественные (O’Connell, 1986).

Приведём ещё несколько не очень давних фактов. Радикалы семихинонов, О и ОН˙ участвуют в индукции и промоции колоректального рака, причём начальными агентами здесь являются желчные кислоты, группа витамина К и комплексы железа. Эти метаболиты способны нарушать нормальный механизм генерации свободных радикалов. Комплексы железа, высвобождающиеся из гемоглобина под влиянием липоперекисей или Н₂О₂, могут быть ответственными за генерацию в желудочно-кишечном тракте активных свободных радикалов (ОН˙ и др.). Последние, как и липоперекиси, взаимодествуют с ДНК (Blakeborough, 1989). Участие реактивных форм О₂ показано на развитии рака ротовой полости у лиц, жующих табак или бетель. На разных стадиях канцерогенеза происходит всплеск генерации О , обусловленный различными механизмами. Понимание онкогенной роли радикалов О₂ помогает обосновать отбор агентов для подавления образования радикалов в щелочной жевательной смеси и слюне жующих; устранения токсических радикалов О₂ в пределах клеток слизистой, экспонированных с канцерогенами или опухолевыми промоторами из табака и бетеля; ингибирования радикалов О₂, секретируемых лимфоцитами, которые инфильтрируют очаги повреждения слизистой (Stich, Anders, 1989). Представляют также интерес сведения об индукции опухолей почек у сирийских хомячков при введении эстрадиола и особенностях изменения при этом активности ферментов, инактивирующих свободные радикалы. Оказалось, что при хроническом введении эстрадиола уровень флуоресцирующих продуктов ПОЛ в почках увеличивается почти в 2 раза, т.е. в данном случае при канцерогенезе идёт значительное развитие окислительного стресса (Roy, Liehr, 1989).

Таким образом, способность АФК в повышенной концентрации выполнять роль про- и канцерогенного агента является точно установленным фактом, что подтверждается материалами постоянно публикуемых обзоров по данной проблеме (Krämer, 1994; Rautalahti, Huttunen, 1994; Забежинский, Анисимов, 1998; Halliwell, 1999 и др.). Вообще же, любые факторы, способствующие установле-нию устойчивого прооксидантного состояния, можно рассматривать как про-канцерогенезные. Одним из таких факторов может быть, например, анаста-моз. Так, гистоавторадиографическое изучение оставшейся после резекции части желудка крыс Wistar показало, что в месте анастомоза со стороны желудка наблюдалось увеличение индекса метки (животным перед забоем вводили ³Н-тимидин). В этой же области развивались аденоматозные и диспластические изменения, а в ряде случаев – раковые опухоли с высоким уровнем пролиферации по периферии. Поэтому возрастание пролиферативной активности клеток слизистой оболочки желудка в области анастомоза было естественным отнести к канцерогенным факторам (Meyer et al., 1984).

Ряд гипотез, постулирующих важную роль АФК в индукции опухолей в связи с низкой активностью Mn-SOD, выдвигали ранее Оберли с соавт. (Oberley et al., 1981; Oberley, Oberley, 1984). Однако их модель, несмотря на наличие некоторых точек соприкосновения с нашей концепцией онкогенеза, в целом существенно отличается от последней, в том числе в принципиальном воп-росе – объяснении первопричин, ведущих к избыточности АФК. Слабое про-явление Mn-SOD в опухолях может объясняться по-разному. Так, если этот фермент действительно кодируется на митохондриальной ДНК (Береговская, Чеботарев, 1989), то указанную «слабость» логично представить как следствие снижения в клетках неоплазмы количества и качества митохондрий, нарушения в последних структуры и функции ДНК. В условиях окислительного стресса возможна также просто инактивация Mn-SOD, например, перокси-нитритом (McMillan-Crow et al., 1998; Quijano, Radi, 1998), образующимся при взаимодействии О с NO. В наиболее активной периферийной зоне неоплазмы NO может оказаться по нескольким причинам: секреция его атакующими опухоль фагоцитами и клетками близлежащего эндотелия; образование самой опухолью по ферментативным и неферментативным путям (см. п.2.3.2).

Так или иначе, сведения о пониженном уровне Mn-SOD в опухолях иногда дополняются новыми. Например, в астроцитомах активность Mn-SOD была значительно ниже, чем в нормальной мозговой ткани, а в астроцитомах стадии III-IV активность этого фермента снижена по сравнению с таковой в астроци-томах стадии I-II (Wang et al., 2000). Свою давнюю позицию снова подтвердили и Oberley T. D. с сотруд., показав более низкий уровень Mn-SOD и Cu,Zn-SOD в раковой ткани поджелудочной железы человека, чем в ткани эпителия с доб-рокачественными опухолями. Эти и другие подобные факты стали для ука-занной группы исследователей основанием для утверждения: окислительный стресс наступает уже на ранних стадиях канцерогенеза (Bostwick et al., 2000). Такое же в принципе положение, напомним, было выдвинуто и нами ещё в 1976 году (Лю, Ефимов, 1976).

С нашей точки зрения, возможный дефицит содержания и активности Mn-SOD следует рассматривать, скорее всего, как побочный результат трансформации клеток и как лишь второстепенный, дополнительный фактор повышения в них уровня О и поддержания прооксидантной ситуации. Отчасти это мнение подтверждается работой, авторы которой (Van Driel et al., 1997), показав более низкое содержание Mn-SOD в раковой опухоли толстой и прямой кишок человека, чем в нормальной слизистой оболочке и аденоме кишки, считают: «сниженная экспрессия пероксиддисмутазы не служит прогностическим признаком, развивается вторично и прямо не связана с возникновением рака».

С упомянутой выше гипотезой о роли низкоактивной Mn-SOD в канцерогенезе не согласуются и такие данные последних лет. У 3-5-месячных крыс LEC (Long-Evans Cinnamon), выживших после острого гепатита, в конце концов, развивается рак печени, причём активность каталазы и GPX у них снижена, активность же Mn-SOD повышена (Hayasaki, 1996). В процессе злокачествен-ной трансформации клеток HDR-3 эмбрионов сирийского хомячка, индуци-рованной облучением, происходит последовательное увеличение активности Mn-SOD, количеств самого фермента и его мРНК, так что полностью малигнизированные клетки имеют более высокие уровни Mn-SOD, чем предопухолевые или нормальные. Указанные эффекты, по мнению Отеро и соавт. (Otero et al., 1996), возникают в ответ на образование клетками неоплазмы TNF-α. Из сказанного выше следует, что присутствие SOD, включая Mn-SOD, на определённом концентрационном уровне есть всё же фактор антиканцерогенезный и противоопухолевый. Это подтверждают и следующие работы.

Активность Mn-SOD в клетках рака молочной железы линии MCF-7, трансфицированных кДНК Mn-SOD, в 5,7 раза превышала таковую в клетках MCF-7 дикого типа. Избыточная экспрессия SOD коррелировала с падением эффективности формирования колоний при посеве на плотную среду и клонообразования на мягком агаре, а также со снижением онкогенности клеток при их введении мышам nude. Авторы данного исследования считают, что ген SOD является геном-супрессором опухолей, повышенная экспрессия которого подавляет, в частности, злокачественный фенотип клеток MCF-7 (Li J.-J. et al., 1995). В культурах клеток мезотелиомы человека обнаружено усиление экспрессии Mn-SOD по сравнению с клетками нормального мезотелия, отмечена обратная корреляция между уровнем Mn-SOD в клетках и скоростью клеточной пролиферации. Клетки мезотелиомы с высоким уровнем Mn-SOD были более резистентны к действию облучения, цитостатиков и к индукции апоптоза, чем клетки мезотелиомы с низким содержания Mn-SOD и клетки нормального мезотелия (Kahlos, 1999).

Приведённые материалы создают впечатление, что в клетках неоплазмы экспрессии гена Mn-SOD способствует само пребывание их в «кислородно-перекисном» состоянии. Подтверждение этому получено недавно на культуре астроглиальных клеток крысы, подвергавшихся воздействию Н₂О₂. Показано возрастание уровня мРНК Mn-SOD как результат транскрипционной регуляции в условиях окислительного стресса (Röhrdanz et al., 2001). Смысл такой реакции путём подключения отрицательной обратной связи состоит, очевидно, в ограничении токсического действия избыточных АФК и является, следовательно, адаптивным ответом

Таким образом, изложенное выше позволяет заключить: с одной стороны, Mn-SOD является противоопухолевым агентом, снижающим значение дисбаланса ∆_К (ПО – АО), скорее всего, до уровня ∆_А1 (ПО – АО), которое необхо-димо для индукции «нижнего» типа апоптоза А1; с другой же, Mn-SOD препятствует возрастанию ∆_К (ПО – АО) до уровня ∆_А2 (ПО – АО), требуемого для индукции «верхнего» типа апоптоза А2 (Лю М. Б., Исмаилов, 2001). Указанные варианты кислородно-перекисного механизма апоптоза рассмотрены нами в п. 7.1. А о противоопухолевом эффекте другой, Cu,Zn-содержащей SOD пока-зано следующее. Подкожная инъекция крысам Zn,Cu-SOD (2 мг, 14 доз) после имплантации фибросаркомы КМТ-17 приводит к подавлению роста опухоли (Saito et al., 1994). О том же свидетельствует и такой факт. Клетки гепатомы Нер-62, трансфицированные геном Cu,Zn-SOD человека, показали по сравнению с контролем ингибирование скорости роста и увеличения их массы, а также сниженную способность к формированию клонов в мягком агаре. Размер опухолей, образуемый ими у мышей nude, был уменьшенным (Bai et al., 1998).

Конкретные механизмы ПОЛ при участии АФК продолжают быть предме-том дискуссии. Прямое действие О на двойные связи ненасыщенных жирных кислот считается маловероятным из-за того, что окислительная способность его ниже, чем у ¹О₂ и ОН˙ (Афанасьев, 1984; Меньшикова, Зенков, 1997). Более того, О в биохимических реакциях может выступать как окислителем, так и восстановителем. Например, он восстанавливает более реакционные радикалы RO˙ и RO (Владимиров и др., 1991):

RO^˙ + О + H⁺ → ROH + O₂ ;

RO + О + H⁺ → ROOH + O₂ .

По этой причине О может даже ингибировать процессы ПОЛ и защищать клетки от повреждения (McCord, 1995).

Значительно более активен радикал гидроксила, вступающий в химические реакции с белками, нуклеиновыми кислотами и повреждающий мембраны, реагируя с липидами. Образование радикала ОН˙ возможно при взаимодействии О с гидроперекисями липидов LOOH или с Н₂О₂:

LOOH + О → O₂ + LO˙ + OH˙;

H₂O₂ + О → O₂ + OH˙ + OHˉ.

Но, по мнению большинства исследователей (Harris et al., 1994 и др.), радикалы ОН˙, скорее всего, образуются в результате реакций:

О + О + 2 Н⁺ → О₂ + Н₂О₂;

О + Fe³⁺ → O₂ + Fe²⁺ ;

H₂O₂ + Fe²⁺ → Fe³⁺ + OH˙ + OHˉ.

В общем же случае источником ОН˙ в присутствии Н₂О₂ могут быть следующие варианты взаимодействия металлов переменной валентности (не обязательно только железа) с О (см. Дубинина, 1989):

Meⁿ + О → Me^n-1 + O₂;

Me^n-1 + H₂O₂ → Meⁿ + OH˙ + OHˉ;

Meⁿ + О → [Me O₂]^n-1;

[Me O₂]^n-1 + H₂O₂ → [Me O₂]ⁿ + OH˙ + OHˉ;

[Me O₂]ⁿ → Meⁿ + O₂.

Сказанное выше о малой вероятности прямого взаимодействия О с ком-понентами клетки относится в определённой степени и к Н₂О₂: это соединение более опасно тем, что, реагируя с О или с Fe²⁺, приводит к образованию всё того же очень реакционноспособного ОН˙ по реакции Габера-Вейса. Радикал гидроксила отнимает у молекулы липида LH атом водорода и образует радикал липида L˙ (Владимиров и др., 1991):

LH + OH˙ → L˙ + H₂O;

L˙ + O₂ → LO

LO + LH → LOOH + L˙;

LOOH + Fe²⁺ → Fe³⁺ + OHˉ + LO˙;

LO˙ + LH + → LOH + L˙.

Приведённые реакции отражают, как известно, цепной характер процесса окис-ления, разветвление и зарождение новой цепи окисления.

Вообще же, для радикалов ОН˙ характерны три основных типа реакций, в качестве примера которых со ссылкой на литературу приводятся следующие (Осипов и др., 1990):

1) отрыв атома водорода от органической молекулы

ОН˙ + СН₃ОН → Н₂О + ˙СН₂ОН;

2) присоединение к молекуле по двойной связи

ОН˙+ С₆Н₆ → ˙С₆Н₆ОН;

3) перенос электрона

ОН˙ + Cl → Cl˙ + ОНˉ.

К реакциям первого типа отнесены, в частности, взаимодействие ОН˙ с лецитином (одна из основных реакций при инициировании ПОЛ в мембранах) и реакция ОН˙ с дезоксирибозой, входящей в состав оснований ДНК. Ко второму типу реакций отнесено взаимодействие радикалов ОН˙ с пуриновыми и пиримидиновыми основаниями ДНК и РНК.

2.1.5. Приведённые выше реакции демонстрируют участие железа (Fe) в реализации свободнорадикальных процессов ПОЛ. Имеется в виду в основном свободное Fe, которое представлено в тканях в форме негемового, неферрити-нового двухвалентного Fe, связанного с низкомолекулярными лигандами. Это наводит на мысль о том, что избыток такого Fe в течение достаточно продол-жительного времени может привести к устойчивой интенсификации ПОЛ мембран и тем самым, согласно излагаемой нами концепции, способствовать пролиферации клеток и развитию канцерогенеза. Из множества известных в литературе фактов на этот счёт напомним лишь о некоторых из них.

Хроническая перегрузка крыс железом индуцировала образование пере-кисей липидов и пролиферацию клеток печени без повреждения ДНК (Whittaker et al., 1992), а инициация пролиферации мышиных фибробластов BALB/c-ЗТЗ, имевшая место в присутствии небольших концентраций 1,2-диметилгидразина (0,1-1,0 мМ) в течение 24 ч, не наблюдалась при введении в среду хелаторов Fe²⁺ (Gamberini et al., 1997). Эти данные подтверждают аналогичные результаты, полученные другими авторами в более ранних исследованиях. К числу последних относится работа Коваленко и соавт. (1986), в которой на примере клеток почки эмбриона свиньи убедительно показана стимулирующая роль свободного Fe в пролиферации клеток. Ими, в частности, выявлена чёткая кор-реляция между подавлением клеточного роста и уменьшением содержания внутриклеточного Fe, вызываемого пиколиновой кислотой – природным хела-тором металлов переменной валентности, причём блокирование роста происхо-дило при снижении уровня свободного Fe в клетках приблизительно в 2 раза по сравнению с контролем. Блок, осуществляемый пиколиновой кислотой, снима-ется при замене среды на нормальную или при добавлении к культуре Fe.

Позднее, правда, та же группа исследователей (Полтораков и др., 1996) указала на альтернативный путь участия ионов Fe²⁺ в механизме клеточной пролиферации. Как оказалось, пиколиновая кислота блокирует клеточный цикл на границе фаз G₁–S, показывая необходимость Fe²⁺ для прохождения клеток через фазу S, т.е. для процессов синтеза ДНК. В связи с этим авторы полагают, что «пул внутриклеточного свободного железа поставляет ионы Fe²⁺ для син-теза железосодержащих ферментов, в частности, обеспечивающих нормальное функционирование процесса клеточного деления». В качестве одного из таких ферментов называется участвующая в синтезе компонентов ДНК рибонуклеотидредуктаза. Обобщение упомянутых фактов позволяет придти к заключению: при окислительном митогенезе в норме и опухолевой трансформации ионы Fe²⁺ необходимы как для активации процессов ПОЛ, так и для синтеза некоторых ферментов, причастных к пролиферации клеток.

Железо увеличивает in vivo и in vitro продукцию проканцерогенных радикалов О₂. На крысах Sprague-Dawley показано, что введение в течение 5 нед Fe-дестранового комплекса (парентерально 15 мг/кг массы тела) и 1 раз в неделю 1,2-диметилгидразина по 20 мг/кг приводит к образованию опухо-лей толстой кишки у 92 % по 2,62 ± 1,39 опухоли на 1 крысу; введение же декстрана без Fe и затем того же канцерогена индуцировало колоректальный канцерогенез лишь у 73 % по 1,4 ± 1,06 опухоли на 1 животное. Железо влияет на промоцию опухолей толстой кишки и не влияет на инициацию (Nelson et al., 1989). Об этом же свидетельствует значительное повышение частоты и ускорение появления у мышей неоплазм, индуцированных тем же 1,2-диметилгидра-зином при введение per os Fe²⁺ (Siegers et al., 1988). Сходные данные содержатся и в ряде других работ. Например, чёткие результаты получены в исследовании, где крысам Sprague-Dawley с 21-го дня жизни и до конца эксперимента давали диету с дефицитом Fe (2 мг/кг корма), нормальным уровнем Fe (120 мг/кг корма) или с избытком его (1200 мг/кг корма) в виде FeSO₄·7H₂O, а на 50-й день жизни вводили 1-метил-1-нитрозомочевину (в/б, 25 мг/кг). Анализ, проводившийся в течение 32 нед. после введения канцерогена, показал: в группе с дефи-цитом Fe возникновение опухолей молочной железы в первые 14 нед. значи-тельно подавлялось по сравнению с другими группами; в 14-32 нед. в группе с нормальным содержанием Fe в диете частота тех же опухолей достигала плато, тогда как в группе с избытком Fe она продолжала расти (Thompson et al., 1991). С повышенным содержанием Fe в организме связывают возникновение нео-плазм и в других органах (Crawford, 1998; Chen X. X. et al., 2000).

Препараты Fe (карбонил или цитрат железа, железо-дестран) усиливают у крыс реакции окислительного стресса, в частности ПОЛ, связанные с опухолевой промоцией. При введении же хелаторов Fe, например, десферриокса-мина, наблюдается обратный процесс (Mitjavila, 1990). В состоявшихся уже опухолях десферриоксамин торомозит пролиферацию клеток. На примере глиом человека показано, что обработка клеток этим препаратом в концентрации 160 мкм останавливала их в фазе G₁, а в концентрации 10 мкм замедляла прохождение клеточного цикла и к 72 ч вызывала накопление клеток в состоянии G₂/M. Действие десферриоксамина принимало необратимый характер на 1-2-ые сутки (Renton, Jeitner, 1996). В экспериментах такого рода способность хела-торов Fe тормозить рост опухоли не подтверждена лишь в одной известной нам работе, в которой бестимусным мышам трансплантировали нейробластому человека (Selig et al., 1998). Здесь не обнаружено влияние десферриоксамина и других хелаторов на сроки жизни животных, строение и размеры опухолей.

Сильным опухолевым промотором печени, действующим путём активации окислительного стресса, является Fe³⁺-нитрилотриацетат (Fe-NTA). Введение его крысам снижает в ~2 раза активности GPX, глутатионредуктазы и каталазы (см. п.2.1.11), в 2-3 раза увеличивает содержание в печени MDA и в 3-5 раз повышает активность ODC (см. п.2.3.3). Ранее было показано, что Fe-NTA оказывает канцерогенное действие на почки (Iqbal et al., 1995). Действительно, Fe-NTA приводит к образованию почечной аденокарциномы у грызунов. При однократном же введении им Fe-NTA (в/б, 15 мг/кг веса тела) в почках инду-цируется острый окислительный стресс, что регистрируется по накоплению продуктов ПОЛ и снижению внутриклеточного пула SH-групп (Fukuda et al., 1996). Об этом же говорится в другой работе (Toyokuni et al., 1997), где показано, что после введения Fe-NTA крысам в почках и печени повышается, наряду с количеством зависимых от дозы альдегидов, содержание белков, модифициро-ванных NTA и MDA, и у животных, в конечном счёте, развиваются карциномы. В последующих публикациях данные обо всех указанных эффектах Fe-NTA продолжали пополняться и уточняться (Athar, Iqbal, 1998; Kimoto et al., 2000).

Возбуждаемый Fe-NTA окислительный стресс распространяется и на ядер-ные структуры. Было сообщено, например, о возрастании в 5 раз уровня 8-гид-роксигуанозина в составе ДНК клеток почки крыс после однократной в/б дозы Fe-NTA. Правда, через 120 ч после введения Fe-NTA животным повышалась также в 5 раз репарационная активность фермента в отношении указанного продукта окислительного повреждения ДНК (Yamaguchi et al., 1996). На экспериментальных моделях окислительной нефротоксичности и рака почки у крыс линии Wistar, индуцируемых Fe-NTA (в/б, 7,5 мг/кг), при воздействии избыточ-ными дозами витамина Е в рационе получен целый набор примечательных эффектов. Таковыми были: ингибирование ПОЛ, снижение образования 8-гид-рокси-2΄-гуанозина в составе яДНК, падение частоты возникновения раковых опухолей в почках, торможение апоптоза (Zhang D. et al., 1997). О модификации ДНК при введении в организм Fe-NTA сообщают и другие исследователи (см., например, Kimoto et al., 2000). В этой связи важно подчеркнуть принципиаль-ное положение о том, что в механизме всех названных подавляемых антиок-сидантом процессов заметную роль, если не основную, выполняет перокси-дативный стресс.

В общем, несмотря на имеющиеся возражения (Vip, Williamson, 1989) складывается достаточно аргументированное мнение, согласно которому повышенное содержание Fe в клетках и тканях организма увеличивает соответственно и онкологический риск, и это особенно существенно в отношении опухолей, индуцируемых радиацией. Возможными механизмами действия Fe здесь счи-тают участие его в образовании кислородных радикалов, пероксидации липидов и в процессах, способствующих росту и развитию трансформированных клеток в организме (Stevens, Kalkwarf, 1990; Hirayama, Yasutake, 1998; Okada, 1998). По материалам, обобщённым еще в обзоре Вейнберга (Weinberg, 1984), избыток Fe способен увеличивать частоту и интенсивность инфекционных болезней и образования неоплазм. Поэтому во время микробной или опухолевой инвазии в порядке защиты происходит срочная мобилизация механизмов удержания (связывания) в организме Fe, неодходимого для роста. В частности, в потенци-альные места инвазии организм помещает Fe-связывающие белки. Для сниже-ния частоты и интенсивности указанных заболеваний необходимо всячески усиливать факторы удержания Fe организмом-хозяином. Как одно из важных направлений профилактики рака рассматривается также воздействие на мета-болизм Fe (Okada, 1998).

Ростстимулирующее действие желeза продолжается, по-видимому, и в зло-качественно трансформированных клетках. Об этом свидетельствуют, в частно-сти, данные о стимуляции пролиферации клеток глиомы крысы и клеток L1210 лейкоза мыши трансферрином. Связывание железа десферриоксамином в куль-туральной среде блокировало деление клеток L1210 при переходе из фазы G₁ в фазу S клеточного цикла. Стимуляцию роста блокировал также антиоксидант пропилгаллат (Basset et al., 1985). В этой работе заслуживает внимания и факт активации железом очищенной гуанилатциклазы в присутствии ненасыщенных жирных кислот и предполагаемая на этом основании стимуляция железом пролиферации клеток с помощью синтезируемого cGMP. В действительности же указанную активацию гуанилатциклазы и связанных с ней последующих событий в клетке осуществляют, скорее всего, гидроперекиси липидов (см. п.2.3.2), образующиеся в свободнорадикальных реакциях с участием Fe²⁺.

Судя по некоторым исследованиям, промоция и канцерогенез связываются не только с избытком Fe, но и с дефицитом его. Полагают, например, что рак – результат метаболических нарушений в организме, вызванных расстройством метаболизма железа и его дефицитом (Tandon, 1989). Интересен также следующий факт. Крысам-отъемышам Fischer, получавшим рацион без железа, вводили внутрь в течение 9 нед диметилгидразин (30 мг/кг в неделю). Данный канцероген на 50 % повышал образование перекисей липидов и на 28 % снижал активность SOD печени крыс (по сравнению с получавшими Fe-содержащую пищу). Поэтому было предположено: длительный дефицит Fe может увеличи-вать риск канцерогенеза при участии окислительного стресса (Rao, Jagadeesan, 1996). Указанные соображения могут быть легко восприняты, если будет как-то обоснован механизм возникновения окислительного стресса в названных выше условиях. Нам представляется, что такой исход при недостаточной концентрации Fe в принципе возможен вследствие, например, заметного ослабления функций зависимых от Fe ферментов дыхательной цепи митохондрий. Это обстоятельство должно приводить к внутриклеточной гипероксии и активации ПОЛ мембран, т.е. к созданию прооксидантной канцерогенной ситуации даже при дефиците железа.

Наконец, роль железа как стимулятора ПОЛ, промоции и канцерогенеза может быть косвенно усилена ионами Са²⁺. Оказалось, что в области низких концентраций (около 10^–5 М) Са²⁺ стимулирует ПОЛ путём высвобождения ионов Fe²⁺, связанных с отрицательно заряженными группами липидных субстратов, и повышения тем самым содержания каталитически активных Fe²⁺ в системе. Высокие же концентрации Са²⁺ (10^–4 М и выше), наоборот, способны оказывать ингибирующий эффект, взаимодействуя О (Савов и др., 1986).

В канцерогенном отношении привлекают внимание и другие металлы, в частности, кадмий – тяжелый, редкий и рассеянный элемент, обнаруженный у всех позвоночных животных, причём больше всего в их печени. Ранее считалось, что кадмий влияет на углеводный обмен и активность некоторых ферментов. Однако, судя по современным данным, Cd²⁺ вызывает, с нашей точки зрения, и проканцерогенезные эффекты. В опытах на изолированных митохон-дриях печени крыс Sprague-Dawley показано, что в присутствии сукцината добавление Cd²⁺ вызывало зависимое от концентрации их набухание в интервале 5-30 мкМ. В этом же интервале Cd²⁺ тормозил потребление митохондриями О₂ с 4,5 до 3,5-0,5 мкмоль/мин на 1 г. В данной связи обсуждается роль нарушения функциональной активности митохондрий в гепатотоксичности Cd²⁺ (Al-Nasser, 2000). В другой работе (Pearson. Prozialeck, 2001) Cd²⁺признаётся уже как канцероген для человека. Полагают, что он может участвовать как в инициации рака, активируя онкогены, так и в его прогрессии, повышая метастатический потенциал путём нарушения контактов между эпителиальными клет-ками и функции Е-кадгерина.

На вопрос, каким является механизм указанных Cd²⁺-опосредованных эф-фектов, считаем возможным, опираясь на сказанное выше, ответить: кадмий индуцирует развитие и прогрессию канцерогенеза, вероятнее всего, через дисфункцию митохондрий. Возникающее при этом состояние гипероксии и пероксигеназного стресса ответственно за АФК-зависимую экспрессию протоонкогенов, утрату межклеточных контактов (см. п. 1.1.1 и 2.4.3) и ряд других про-неопластических сдвигов. К их числу относятся, несомненно, данные о том, что при п/к введении мышам CdCl₂ 5 H₂O в дозе 40 мкм/кг ПОЛ в печени увеличивалось до 200,7 %, при этом снижались активность глутатион-S-трансферазы и уровень GSH до 81,7 %. Совместное же введение Cd²⁺ и α-липоевой кислоты, обладающей антиоксидантным свойством, предотвращало названные эффекты, и смертность мышей падала с 60 до 20 % (Bludovska et al., 1999).

К развитию зависимого от АФК канцерогенеза причастен также хром (Cr³⁺). Канцерогенные свойства его связывают с выработкой радикалов ОН˙ в реакциях типа Фентона, а мелотонин и сходные с ним соединения способны инактивировать эти радикалы и тем самым оказывать противоопухолеый эффект (Qi et al., 2000). По другим данным, за большинство токсических эффектов сравните-льно с Cr³⁺ и Cr⁵⁺ ответственен Cr⁶⁺. Под действием последнего индуцируются свободные радикалы, окислительные повреждения белков и ДНК, которые вме-сте способны инициировать образование опухолей. Авторы этой работы (Dayan, Paine, 2001) отмечают недостаточную изученность молекулярных механизмов указанных эффектов Cr⁶⁺, однако, как представляется нам, индукция канцерогенеза по кислородно-перекисному пути здесь почти очевидна. Наконец, с пози-ций того же механизма интересна информация о наличии у соединений Cr⁵⁺ свойств, имитирующих АФК. Флуоресцентным методом показано, что такие соединения индуцируют флуоресценцию чувствительных к оксидантам красителей (приводятся формулы) в результате непосредственного взаимодействия, без предшествующего образования АФК (Martin et al., 1998).

2.1.6. Промежуточные и конечные продукты ПОЛ в избыточном количес-тве высокотоксичны и представляются нам эндогенными канцерогенами, так как хорошо известно их канцерогенное действие. Они являются причиной пов-реждения внутриклеточных структур и инактивации различных биологических макромолекул, в том числе ферментов и регуляторных белков (Владимиров, Арчаков, 1972; Журавлев, 1982). По существу же вследствие гипероксии и избыточного ПОЛ дважды возникают ситуации, ведущие к нарушениям струк-туры и функции различных компонентов клетки: во-первых, это сам факт изменения состояния липидов мембран при перекисном их окислении, который небезразличен для целостности этих мембран и нормального функционирова-ния встроенных в них белковых структур; во-вторых, качественное изменение самих мембранных и, по-видимому, немембранных белков при взаимодействии их с АФК и продуктами ПОЛ.

Действительно, фосфолипиды, будучи сложными полифункциональными соединениями, в норме принимают активное участие в поддержании надмолекулярной организации мембран и регуляции их метаболической деятельности. В частности, управление работой мембраносвязанных ферментов может осу-ществляться изменением состояния липидов мембран: для одних ферментов необходимы «жидкое» состояние и легкоокисляемые липиды в качестве аллостерических эффекторов, а для других – более жёсткое состояние мембран и трудноокисляемые липиды-эффекторы (Бурлакова, 1981). Очевидно, при некотором избыточном ПОЛ могут быть превышены допустимые изменения жидкокристаллического состояния липидного бислоя мембран, состава и концентрации отдельных фракций липидов-эффекторов, что приведёт к нарушению связанных с ними ферментных комплексов, частичным повреждению и деградации самих мембранных структур. Конкретные последствия в связи с подобными изменениями в митохондриальной, плазматической, микросомальной и других мембранах клетки обсуждаются ниже.

Возникающие при гипероксии и в процессе ПОЛ активные формы О₂, радикальные интермедиаты и бифункциональные реагенты типа MDA могут взаимодействовать с белковыми компонентами мембран. В результате образуются ковалентно связанные белок-липидные комплексы P-L, где P – белок, а L – липид. Возникают также белки с неспаренной валентностью P˙, способные к дальнейшей полимеризации (Каган и др., 1986):

P˙ + P˙ → P-P; P + L˙ → P-L; P˙ + L → P-L;

P P˙ + L → P-P-L; P P + L˙ → P-P-L; P P˙ + P → P-P-P.

Причём авторы этой же работы отмечают: «…в мембранных структурах образование липопротеидных комплексов в результате ПОЛ, как и в модельных системах будет, по-видимому, носить минорный характер, тогда как основными продуктами белковой полимеризации в зависимости от степени окисленности окажутся димерные, тримерные и более высокоассоциированные продукты белковой интеграции».

Модификация различных белков в составе мембран и вне их не может, естественно, не приводить к искажению и даже утрате природных функций этих белков. На этот счёт имеется соответствующая литература. Так, механизм окислительной модификации белков (ОМБ) подробно рассмотрен в работе Дубининой и Шугалей (1993). Наиболее важными в ней представляются следующие обобщения: 1) в нормально функционирующем организме процессы ОМБ протекают локально за счёт металлокатализируемого окисления аминокислотных остатков в местах связывания с металлом; 2) степень выраженности окисления белков зависит от интенсивности генерации АФК и состояния антиоксидантной защиты клетки; 3) характер ОМБ зависит от типа АФК: радикал ОН˙чаще всего вызывает агрегацию белков, а в комбинации с О или О₂ – фрагментацию их; 4) белки, подвергнутые окислительной инактивации, становятся более чувствительными к эндогенному протеолизу; 5) ОМБ связана с инактивацией их ферментативной активности; увеличение содержания АФК сопровождается разрушением и основных ферментов антиоксидантной защиты (каталазы, GPX, SOD); 6) усиление ОМБ наряду с ПОЛ играет важную роль в патогенезе ряда заболеваний; 7) ОМБ как один из ранних индикаторов поражения тканей при свободнорадикальной патологии резко возрастает при этой патологии. Мы полагаем, что в трансформированной и опухолевой клетках, находящихся в состоянии непрерывного пероксигеназного стресса, в полной мере реализуются указанные процессы.

Изучение окислительной деградации белков при окислительном стрессе продолжается и в настоящее время (Zaidi, Michaels, 1999). Полагают, что с учётом многообразной функциональной нагрузки белков в тканях их окислительная модификация может носить избирательный и специфический характер. Кроме того, окисление биомолекул возможно не только за счёт ОН˙ и других АФК, но и в результате образования железокислородных комплексов – феррил- и перферрил-ионов (Qian, Buettner, 1999; Дубинина и др., 2002).

Эндогенные канцерогены перекисной природы, по всей вероятности, подхватывают и продолжают воздействие на различные внутриклеточные мишени, начатое экзогенными канцерогенными факторами непосредственно или индуцированное ими косвенно. При энзиматическом образовании липидные перекиси имеют строго специфическую структуру, с чем может быть связана избирательность их действия. По-видимому, и при прямом и неферментативном окислениях какая-то часть возникающих продуктов ПОЛ достаточно специфична и потому способна к избирательному взаимодействию с некоторыми биополимерами. Более того, в последние годы стало известно, что при свободнорадикальном окислении ненасыщенных жирных кислот и, в частности, арахидоновой кислоты, высвобождаемых фосфолипазой А₂ из липидов при их гидролизе, образуются весьма своеобразные эффекторные молекулы, а не только продукты с малоспецифическими биологическими эффектами. К числу таковых относят аналоги простагландинов, возникающие в организме при свободнорадикальном окислении арахидоновой кислоты и названные изопростанами. Полагают, что изопростаны наряду с изолейкотриенами и другими изооксилипинами представляют собой новый класс липидных эффекторов, являющихся индикаторами и медиаторами окислительного стресса (Дятловицкая, Безуглов, 1998; Lawson et al., 1999).

2.1.7. По кислородно-перекисной модели канцерогенеза ключевой мишенью воздействия теперь уже и продуктов ПОЛ представляются митохондрии и в первую очередь – их дыхательная цепь, т.е. тот же легкоуязвимый первичный объект, что и при старении и атаке канцерогенных факторов. В результате создаётся ситуация, когда митохондрии как бы постоянно ослабляют сами себя благодаря образованию замкнутого цикла с положительной обратной связью, устойчиво поддерживающего состояние пероксидации. Продукты её способны непосредственно подавлять дыхание и разобщать окислительное фосфорилирование (Владимиров, Арчаков, 1972; Сутковой, Барабой, 1985; Gardner et al., 1994), по-видимому, вследствие отравления дыхательных ферментных систем.

О реальности такого исхода событий свидетельствуют, например, и следующий факты. Окислительный стресс в митохондриях, индуцированный введением трет-бутилгидроперекиси, приводил к образованию продукта ПОЛ 4-гидроксиноненаля, по мере накопления которого повышалась степень ингибирования цитохром-с-оксидазы. Активность этого фермента подавлялась так-же при введении экзогенного гидроксиноненаля (50-450 мкМ). А GSH, образуя с последним конъюгат, защищал цитохром-с-оксидазу от инактивации (Chen et al., 1998). После 5-10 мин инкубации гепатоцитов крысы с 1,5-3,0 мМ той же гидроперекиси t-бутила были снижены на 50 % как окислительная, так и фосфорилирующая активности митохондрий. Эти эффекты объяснены тем, что указанный гепатотоксин индуцирует ПОЛ, приводящий к образованию MDA, который и инактивирует дыхательные ферменты (Drahota et al., 2000). К такому же, по сути, расстройству энергопроизводства должно приводить нарушение регуляции дыхательных ферментов со стороны их фосфолипидного микроокружения при развитии ПОЛ. На зависимость этих ферментов от фосфолипидов указывают давние сведения о том, что каталитическая активность любого из 4-х дыхательных комплексов митохондрий резко снижается при экстракции жировыми растворителями, а при добавлении ненасыщенных фосфолипидов – вновь восстанавливается (Озернюк, 1978), причём активирующий эффект их тем выраженнее, чем выше степень ненасыщенности добавляемых фосфолипидов (Малер, Кордес, 1970).

Для реализации каталитических функций дыхательных ферментов и сопряжения электронотранспортных процессов необходим, в частности, кардиолипин – одна из легко окисляемых фракций фосфолипидов. В давних опытах по удалению фосфолипидов из комплексов дыхательной цепи митохондрий сердца быка и последующей реактивации ферментов фосфолипидами показано, что полная реактивация достигается лишь после добавления кардиолипина (Fry, Green, 1981). Расщепление фосфолипазой А₂ кардиолипина, связанного с цито-хром-с-оксидазой быка, сопровождается обратимым снижением на 45-50 % электронотранспортной активности фермента. Добавление лишь кардиолипина, но не фосфатидилхолина и фосфатидилэтаноламина восстанавливает его актив-ность, Полагают также, что кардиолипин важен не только для полной электро-нотранспортной активности цитохром-с-оксидазы, но и играет структурную роль в стабилизации её четвертичной структуры (Seldak, Robinson, 1999).

Несколько иной результат получен при изучении влияния кардиолипина на структуру и функцию внутренней мембраны митохондрий печени крысы. Добавление его к интактным митохондриям in vitro заметно повышало протонную проводимость и скорость дыхания в состоянии 4, приводило к небольшому разобщению окислительного фосфорилирования и изменению проницаемости мембраны для Са²⁺ (Bobyleva et al., 1997). По-видимому, в гипероксических in vitro условиях данного конкретного эксперимента добавленный кардиолипин легко подвергается перекисному окислению, которое отражается на состоянии внутренней мембраны митохондрий, приводя к упомянутым структурно-функ-циональным её изменениям. Вообще же, по изложенным выше причинам активность ряда ферментов дыхания (цитохрома с, цитохромоксидазы, сукцинатдегидрогеназы и др.) в процессе канцерогенеза, как давно известно, значительно падает (Гобеев, Березов, 1979), и это снижение считают качественной характеристикой раковых клеток (Дмитриева и др., 1977).

С точки зрения излагаемого подхода любое вещество в принципе канцерогенно, если оно так или иначе индуцирует в нормальной клетке избыточное ПОЛ, подавляет митохондриальное дыхание и создает тем самым канцерогенную ситуацию в виде устойчивой гипероксии и повышенной свободнора-дикальной пероксидации липидов во всех мембранных структурах. Можно указать, например, на некоторые антибиотики (адриамицин, блеомицин, доксорубицин и др.), способные при восстановлении-окислении генерировать свободные радикалы О₂, активировать перекисное окисление митохондриальных фосфолипидов, ингибировать ферменты дыхательной цепи, усиливать про-лиферацию клеток (Bianchi et al., 1987). Доксорубицин, введённый крысам (20 мг/кг; в/б) снижал антиоксидантную активность, повышал ПОЛ и чувст-тельность к окислительному стрессу в сердце, печени и крови. Совместное же действие антибиотика с витамином Е (10 100 мг/кг/день; в/м) или N-ацетил-цистеином (100 мг/кг; в/б) оказывало защитный эффект: величины ПОЛ в указанных органах были ниже, чем в норме (Venditti et al., 1998). Отметим также работы, в которых обобщены материалы о генерации свободных радикалов О₂ при метаболизме адриамицина и ряда других лекарственных средств, рассмотрены антиоксидантные механизмы защиты клеток от прооксидантного и токсического действий АФК (Martinez-Cayuela, 1998; Venkatesan et al., 2000).

Интересны также данные о том, что доксорубицин (адриамицин) при воздействии на лейкозные клетки К-562 в дозе 0,2-5,0 мкМ подавляет экспрессию митохондриальных и ядерных генов, кодирующих соответственно субъединицы II и IV цитохром-с-оксидазы, индуцирует апоптоз и специфичную для него дег-радацию ДНК указанных клеток (Papadopoulou, Tsiftsoglou, 1996). Если подоб-ный механизм ослабления митохондриального дыхания существует и в отношении нормальных клеток, то это – ещё один возможный вариант «антибиотикового» канцерогенеза, развивающегося на основе пероксидативного стресса.

Ранее указанные антибиотики не считались бластомогенными. Более того, они обладают противоопухолевыми свойствами. Теперь же известны факты, хотя пока и единичные, о способности адриамицина и дауномицина вызывать в эксперименте опухоли у животных (Bucclarell, 1981; El-Mofty et al., 1991). Новые антрациклиновые противоопухолевые антибиотики морфолинодауномицин и цианоморфолиноадриамицин индуцировали злокачественную трансформацию in vitro мышиных фибробластов СЗН М2 и опухоли молочных желез у крыс Spraque-Dawley. Из-за высокой онкогенности применение этих антибиотиков в клинике стало проблематичным (Westendorf et al., 1987). Возможные причины противоположного действия указанных антибиотиков по отношению к нормальным и опухолевым клеткам рассмотрены в нашей монографии (Лю, Шайхутдинов, 1991), и с позиций кислородно-перекисной модели канцероге-неза их двойственный эффект не представляется парадоксальным.

С падением потенциальной активности некоторых дыхательных фермен-тов при малигнизации и дальнейшей прогрессией опухоли связывают ряд особенностей её энергетического обмена, в частности, снижение уровней окислительного фосфорилирования и АТР, активацию гликолиза, уменьшение числа митохондрий и упрощение их ультраструктуры (см. п. 2.1.1). Эти эффекты аналогичны тем, которые развиваются при антиоксидантной недостаточности, например, при Е-авитаминозе. Механизмы, ведущие к дефектности и деграда-ции части митохондрий, уже обсуждались нами в главе 1 в связи с рассмотрением схемы развития пероксидативного стресса в клетке в процессе её «митохондриального» старения. При канцерогенезе же эти сдвиги усугубляются и становятся особенно выраженными, дополняясь действием каких-то других ме-ханизмов. К ограничению сборки и функционирования митохондрий приводит также дефицит дыхательных ферментов глутамат- и малатдегидрогеназы, цитохрома с и белков внешней мембраны митохондрий, синтезируемых мембраносвязанными полирибосомами (Бердинских, 1983), поскольку количество последних при избыточном ПОЛ значительно уменьшается вследствие разобщения с мембранами микросом и, по-видимому, митохондрий. Здесь важно отметить, что не только дефектность митохондрий, но и само уменьшение их числа в клетке ведёт к негативным для неё «кислородно-перекисным» последствиям, поскольку снижается общее потребление О₂ клеткой, соответственно повышаются в ней рО₂ и зависимое от последнего образование АФК.

Примечательно, что для некоторых биологических преобразований пер-оксидантный путь разрушения митохондрий запрограммирован природой в качестве необходимого естественного этапа. Например, при созревании рети-кулоцитов деградации митохондрий предшествует синтез массового количества липооксигеназы, катализирующей реакции ПОЛ мембран митохондрий и окисление в них некоторых железосодержащих белков. В результате на первых этапах деградации нарушается структура митохондрий и ингибируется дыхательная цепь. На последней стадии вследствие протеолиза и последующего действия пептидаз происходит полное расщепление белков митохондрий до аминокислот (Rapoport, Schewe, 1986; Schnurr et al., 1996).

По-видимому, стадия митохондриального протеолиза присуща не только созревающим ретикулоцитам, но и другим типам клеток. Так, из межмемб-ранного пространства митохондрий печени крысы была выделена и частично очищена протеиназа, селективно разрушавшая полипептиды внутренней мембраны, в частности сукцинат-цитохром-с-редуктазный комплекс (Duque-Magal-haes, Gualberto, 1987). Протеолиз ингибируется АТР, поэтому для клеток с недостаточным дыханием и дефицитом АТР защитный эффект последнего должен снизиться, а степень митохондриального протеолиза – возрасти. Существование такого механизма представляется реальным и в малигнизирующихся клетках, и в опухолевых. Ещё на один механизм ликвидации митохондрий, связанный с потерей регуляции Са²⁺-зависимых пор при реализации, правда, апоптотического сигнала, указывает Зоров (1996). По его мнению, в результате необратимого открывания этих пор «могут произойти сброс митохондриального мембранного потенциала и протонного градиента, Са²⁺-зависимая активация нуклеаз, протеаз и липаз, начало деградации митохондрий и, наконец, мито-хондриальная гибель».

ДНК митохондрий, как известно, не суперскручена и не защищена белками, поэтому она должна быть более доступной и чувствительной к воздействию АФК и липоперекисей по сравнению с яДНК (Пескин, 1997; Jakes, Van Houten, 1997). К примеру, повышенная повреждаемость митохондриальных полинуклеотидов уже на ранней стадии окислительного стресса показана на фибробластах хомяка НА-1. Обработка их Н₂О₂ вызывала деградацию мтДНК, но не яДНК. Кроме того, в митохондриях снижалось содержание мРНК, при этом не затрагивались мРНК, кодируемые ядерным геномом и участвующие в синтезе белков дыхательной цепи (Abramova et al., 2000). Окислительная модификация затрагивает пуриновые и пиримидиновые основания ДНК, приводит к образованию пероксидов ДНК, разрыву одной или обеих её нитей (Осипов и др., 1990; Кулинский, Колесниченко, 1993). Эти деструктивные процессы причастны, оче-видно, к дефектности митохондрий и снижению их количества в опухолевых клетках, а также к делециям мтДНК, обнаруживаемым с помощью ПЦР в различных опухолях, например, в карциномах желудка (Maximo et al., 2001).

В связи с окислительной модификацией мтДНК и образованием её фрагментов высказана также интересная гипотеза по механизму канцерогенеза. Считают, в частности, что фрагменты мтДНК могут в принципе включаться в ядерный геном клетки и являться причиной возникновения опухолей и раннего старения. Возможные пути экспериментальной проверки гипотезы обсуждаются автором (Richter, 1988). Но здесь важно отметить, что все указанные изменения и перестройки являются следствием устойчиво поддерживаемого в малигнизируемой клетке пероксигеназного стресса.

Ввиду первостепенной роли состояния митохондрий в старении, возрастных болезнях, канцерогенезе и ряде других патологий перед исследователями возникают и некоторые новые вопросы проблемного характера. Один из них формулируется так: зависят ли и как вероятность, время и частота возникновения болезней, связанных с митохондриями, от особенностей регуляции в норме окислительного фосфорилирования в различных тканях животного и человека? О том, что различие между тканями (органами) в такой регуляции существует нам стало известно из работы, авторы которой (Rossignol et al., 2000) в экспериментах на крысах установили следующее. В сердце и скелетных мышцах регуляция окислительного фосфорилирования осуществляется главным образом на уровне дыхательной цепи; в печени, почках и головном мозге эта регуляция производится на уровне фосфорилирования ATP-синтетазой и носителем фосфата. Данные различия, как отметили исследователи, «позволяют частично объяснить тканевую специфичность митохондриальных цитопатий».

Приведённые, на первый взгляд, малоприметные материалы представля-ются нам весьма существенными, если анализировать их с позиций возможной причастности указанных путей регуляции энергопроизводства к созданию усло-вий для окислительного стресса разной интенсивности, длительности и частоты. Действительно, в клетках тканей (органов), где окислительное фосфорилирование не лимитируется мощностью ATP-синтетазы и доставкой фосфата, окислительный процесс в дыхательной цепи митохондрий не лимитируется сопряжённым с ним фосфорилированием. Потребление в них О₂ митохондриями идёт интенсивно, поэтому рО₂, содержание АФК и уровень ∆ (ПО – АО) поддерживаются низкими. Клетки в таких тканях (органах) стареют медленнее и кислородно-перекисные патологии, в частности рак, возникают в них сравнительно редко. К таковым относятся те части организма, которые по своему природному назначению должны часто и длительно работать в интенсивном режиме, с большой нагрузкой, чтобы обеспечить выработку необходимого для таких случаев повышенного количества ATP. Это прежде всего упоминавшиеся выше сердце и скелетные мышцы. АФК, генерируемые дыхательной цепью, особенно в режиме активного её функционирования, могут оказывать повреждающее действие. В порядке адаптации к этому в клетках указанных тканей развился ряд эндогенных механизмов защиты. Например, в период активности скелетных мышц «включаются» антиоксидантные энзимы, белки стресса или теплового шока (McArdle, Jackson, 2000).

В клетках тканей (органов), где не требуется высокоинтенсивный синтез ATP и экстремальные нагрузки и режимы маловероятны, надобность в повышенной мощности ATP-синтетазы, очевидно, отпадает, и это ограничение дол-жно служить лимитирующим и тем самым регулирующим фактором для процесса фосфорилирования и сопряжённого с ним процесса окисления в дыхательной цепи митохондрий. В такой ситуации нередкими будут снижение скорости утилизации О₂ митохондриями и соответственно некоторое повышение внутриклеточных уровней рО₂, АФК и ∆ (ПО – АО). Этот путь, в какой-то мере облегчающий при определённых условиях индукцию окислительного стресса, более эффективен и «патологичен», чем в случае, когда АФК генерируются только самой дыхательной цепью как в предыдущем варианте регуляции окислительного фосфорилирования. А теми необходимыми, подходящими услови-ями являются воздействия различных экзогенных и эндогенных агентов и факторов, которые усугубляют это прооксигеназное состояние. В соответствии с кислородно-перекисными концепциями старения и канцерогенеза органы с ука-занным состоянием энергетики быстрее стареют, они более «подготовлены» к тому, что в них чаще возникают различные патологии, в частности, неоплазмы, ввиду повышенной вероятности возрастания дисбаланса ∆ (ПО –АО) до «канцерогенезного» ∆_К (ПО – АО). К числу «слабых» в этом отношении органов можно отнести, например, печень, почки, головной мозг и некоторые другие.

Возможен, на наш взгляд, и ещё один вариант: в клетках тех тканей (органов), где фосфорилирование хотя и ограничено мощностью ATP-синтетазы, а сам процесс окислительного фосфорилирования идёт постоянно и в пределах допустимого достаточно интенсивно, процесс окисления в дыхательной цепи не лимитируется и условия для приближения к состоянию окислительного стресса в норме не возникают. Такие ткани (органы) редко подвергаются злокачественной трансформации. Примером здесь могла бы служить молочная железа коров. Кстати, со сказанным в принципе согласуется и известное мнение о том, что вероятность возникновения рака молочной железы у женщин можно снизить, если они будут чаще рожать детей. Смысл этой рекомендации отчасти видится в поддержании в митохондриях относительно постоянного энергопроизводства и снижения тем самым вероятности возникновения в действующих клетках молочной железы окислительного стресса по изложенной выше причине.

2.1.8. В связи с ответственной ролью соединений активного О₂ в канцерогенезе необходимы сведения о генерирующих их системах и локализации последних. Имеющейся информации на этот счёт пока недостаточно. Считают (Лукьянова и др. 1982), что при ингибировании транспорта электронов в дыхательной цепи митохондрий на конечный акцептор – молекулярный кислород – возникает состояние, благоприятствующее их переносу от внутриклеточных восстановителей на любой доступный окислитель. В частности, в условиях гипоксии такой перенос электронов происходит через клеточную мембрану на внешние редокс-системы, роль которых в эксперименте могут выполнять естественные и искусственные акцепторы электронов, например, трансферрин, феррицианид и др.

Обмен восстановительных эквивалентов между клеткой и окружающей средой или между клетками ткани рассматривается как путь, альтернативный восстановлению при участии внутриклеточных терминальных оксидаз (Лукьянова и др., 1982). Этот путь, возможно, и реализуется in vivo в клетках гипок-сических участков опухоли, однако с точки зрения кислородно-перекисной модели канцерогенеза важнее осмыслить складывающиеся цепи переноса электронов в клетках периферийных активно растущих участков неоплазмы, где из-за неэффективного функционирования дыхательной цепи и дефицита самих митохондрий снижено общее потребление О₂ и соответственно увели-чено внутриклеточное рО₂. Фактически в таких клетках создаются условия, когда растворённый в липидном матриксе молекулярный О₂ не сможет восстанавливаться до конечного продукта, а будет претерпевать последовательное одноэлектронное восстановление с образованием активных форм О₂. При гипероксии эффективность этого процесса значительно возрастает вследствие, как отмечают Каган и др. (1986), «увеличения вероятности взаимодействия О₂ с восстановленными переносчиками даже тогда, когда процесс переноса электронов на цитохромоксидазу совершается беспрепятственно и количество восстановленных переносчиков в цепи ограничено». Между прочим, по некоторым данным (Raha, Robinson, 2000), при нормальном ходе окислительного фосфорилирования и, прежде всего, согласованной работе комплекса переносчиков дыхательной цепи примерно 1 % вступающего в реакцию О₂ восстанавливается до О . При этом одним из основных источников синтеза супероксида является неферментативное окисление полувосстановленного убихинона.

В условиях «фиктивной» гипоксии, при наличии внутри малигнизирующейся и опухолевой клеток избыточного О₂, в действие вступают, очевидно, как новые внутриклеточные пути переноса электронов на О₂, так и трансплазматические мембранные окислительно-восстановительные системы (Crane et al., 1985). И те, и другие электронотранспортные цепи, по-видимому, ответственны за интенсивную генерацию пролиферирующими клетками опухоли АФК и, в частности, за одноэлектронное восстановление молекулярного О₂ до О . С этих позиций интересны данные о стимуляции роста клеток HeLa окислительно-восстановительной системой, действующей через плазматическую мембрану (Sun et al., 1984). Показано, что непроникающий через эту мембрану феррицианид в концентрации 10 мкМ, а также набор других непроникающих окисли-телей с редокс-потенциалом до –125 мВ, обладали чётким стимулирующим эффектом. Все они в отличие от не стимулирующих восстанавливались трансмембранно электронотранспортной системой. Некоторые противоопухолевые химиопрепараты ингибировали трансмембранную редокс-систему и, следовательно, продукцию О , с чем, по нашему мнению, отчасти и связан их лечебный эффект.

Имеются сведения и о локализации других супероксидгенерирующих систем. Так, в ядерных мембранах опухолей обнаружены необычные редокс-цепи, причастные к повышенному образованию О (Збарский, 1982; Greenly, Davies, 1994; Пескин, 1996). А трансмембранная NADPH-оксидаза, участвующая в об-разовании О , расположена, как известно, в плазматической мембране клетки и секретирует супероксид в межклеточное пространство (Babior, 1999). Неда-вно, однако, появилось относительно новое сообщение: в нейтрофилах показана исключительно внутриклеточная локализация NADPH-оксидазы, в связи с чем описаны механизмы её связи с плазматической мембраной и выделения О (Kobayashi, Seguchi, 2001).

Перерождение клеток в злокачественные должно усиливаться и ускоряться, если наряду с необходимым условием – повышенной концентрацией сильных окислителей обеспечить эти клетки в достатке соответствующими субстратами, «сжигание» которых будет способствовать избыточному по сравнению с нормой образованию в них токсических перекисных продуктов (см. п. 2.1.6). Здесь существуют различные возможности. Это, прежде всего, стимулирующее действие прооксидантов, в частности свободнорадикальных форм О₂, на активность фосфолипаз типа А (PLA) во внутриклеточных органеллах, в том числе в митохондриях и микросомах (Садовникова, 1989; Byczkowski, Cannel, 1996; Sakamoto et al., 1999). Имеются также данные о стимуляции АФК (О ) активности PLD митохондрий, что приводит к понижению содержания фосфолипи-дов и, в частности, фосфатидилэтаноламина. Это показано при изучении влияния свободных радикалов на липиды митохондрий кишечника крысы (Madesh et al., 1997). Кроме того, активацию указанных ферментов осуществляет Са²⁺ – известный активатор фосфолипаз. Концентрация Са²⁺ в цитоплазме трансформируемой клетки и её мембранах может увеличиваться вследствие слабой в условиях недостаточности дыхания работы Са²⁺-АТРазы и (или) накопления отрицательно заряженных перекисных группировок.

Активация PLs, приводя к накоплению в мембранах свободных жирных кислот, прежде всего арахидоновой, повышает доступность субстрата окис-ления для прооксидантов и ускоряет тем самым процессы ферментативного и неферментативного ПОЛ. В этом аспекте интересны также данные об активации в опухолевых клетках Са²⁺-независимой PLA₂ субтоксическими концентрациями органического гидропероксида (Кондакова, Nalbone, 1997). Свободнорадикальной моделью здесь служило воздействие гидропероксида третичного бутила (20-50 мкМ) на клетки мышиной мастоцитомы Р815 в течение 15, 30 и 60 мин. Результат: активность фермента в клетках увеличилась соответственно на 260, 280 и 160 %.

2.1.9. Из рассмотренных выше представлений следует, что в опухолевой клетке и вне её возникают различные связи, поддерживающие в ней исходную гипероксию и пероксидацию. По кибернетическим понятиям – это замкнутые циклы с положительной обратной связью, воспроизводящие условия для угнетения митохондриального дыхания и разобщения его с фосфорилированием, следовательно, создания дефицита ATP и избытка AMP. Один из этих циклов относительно быстродействующий: внутриклеточная гипероксия → пероксидация липидов мембран, в том числе митохондриальных → ингибирование ферментов дыхания → поддержание состояния гипероксии. Действие же других циклов значительно инерционно, поскольку связано с влиянием, например, АФК, продуктов ПОЛ и AMP на состояние и экспрессию ядерной и митохонд-риальной ДНК, с синтезом конкретных белков. Одним из путей поддержания пероксигеназного состояния в опухолевых клетках может стать также наруше-ние метаболизма некоторых аминокислот и накопление их различных метабо-литов, оказывающих прооксидантное действие. Таким свойством, в частности, обладают эндогенные канцерогенные метаболиты ароматических аминокислот (Левчук и др., 1987).

Следует отметить здесь, что на внутриклеточный уровень ATP будет влиять его производство и в плазматической мембране различных тканей в ответ на действие пептидных факторов роста, ряда митогенов и цитокинов. Этот процесс сопряжён с переносом электронов с цитоплазматического NADH на непроникающие наружные редокс-акцепторы (Карелин, 1994). Наличие плазмамембранного синтеза ATP показано, в частности, и в гепатоцитах. Глоба с соавт. (1996) обнаружили, что препараты грубых плазматических мембран клеток печени крысы и человека, находящиеся в условиях окислительного фосфори-лирования, способны накапливать в течение 1 мин инкубации 20-100 нмоль ATP/мг белка, и к этому накоплению митохондрии не причастны. Предположительно, ATP, синтезируемый из неорганического фосфата и ADP по аэроб-ному пути, используется для трансмембранной передачи сигнала с поверхности клетки во внутренние её структуры (Карелин и др., 2000),в том числе для работы транслоказ – АТР-зависимых насосов, один из которых специфичен к аминофосфолипидам (см. п.7.1.6). Очевидно, при повышенном уровне ПОЛ в плазматической мембране трансформированных клеток образование ATP в ней станет ущербным.

Снижение синтеза ATP – исходного продукта для образования cAMP (рис. 12) и соответственно cAMP показано для многих типов опухолевых клеток, но в этом вопросе нет пока единства взглядов. Недостаточное обеспечение энергией должно проявиться в относительном снижении скорости (эффективно-сти) многих ATP-зависимых процессов, в том числе транспортных и синтети-ческих, а также размножения опухолевых клеток по сравнению с нормальными. В частности, ослабление Na⁺,K⁺- и Ca²⁺-ATPаз, удаляющих из клетки ионы натрия и кальция, неизбежно приводит к росту их концентрации в цитоплазме и, наоборот, к падению уровня поступающих в неё ионов калия (Маленков, 1976; Кавецкий, 1977). Факты нарушения ионной ассиметрии в опухолевых клетках приводились и в других работах. Так, средняя концентрация Na⁺ в клетках гепатомы и аденокарциномы молочной железы составляла 451±6 ммоль/кг веса, в нормальных же гомологичных клетках – всего 138±11. Кроме того, концентрация Na⁺ в быстроделящихся клетках была значительно выше, чем в медленноделящихся, но всегда существенно ниже, чем в опухолевых (Cameron et al., 1980). Это может означать, что вообще при стимуляции проли-ферации «притупляется» активность, в частности Na⁺,K⁺- и Ca²⁺-ATPаз, и за данный феномен ответственны снижение интенсивности митохондриального и плазмамембранного дыханий, дефицит ATP и cAMP в митогенных клетках. Напротив, отсутствие такого дефицита должно в принципе ограничивать пролиферацию. Например, при действии АТР (0,4 ммоль/л) на иммортализованные фибробласты KMST-6 человека скорость пролиферации клеток оказалась сни-женной на 77 %, а синтез ДНК был супрессирован (Li J.-W., 2000).

Изменение нормального ионного состава, в свою очередь, расстраивает многие процессы в трансформируемой и опухолевой клетках. При увеличении содержания Са²⁺ активируются, как отмечалось выше, фосфолипазы, входящие

N

N

N

N

NH₂

H

H

H

H

O

OH

OH

H₂СC

O

P

O

P

O

P

О

O^–

O^–

O^–

O

O

O

(АТР)

H

H

H

H

O

OH

O

H₂С

O

P

OH

O

(сАМР)

+

O

P

P

O^–

O^–

O

O

O^–

O^–

Рис.12. Образование сАМР из АТР в аденилатциклазной сигнальной системе (Кухарь и др., 1991)

(PP_H)

в состав всех мембран клетки. Расщепляя молекулы фосфолипидов, они повышают проницаемость плазматической мембраны для различных ионов и соответственно содержание Са²⁺ и Na⁺ в клетке за счёт усиления пассивной диффузии, что ещё более усугубляет расстройство ионного гомеостаза. Вероятно, несколько раньше или почти одновременно активируется также PLA₂ митохондрий, локализованная на наружной стороне их внутренней мембраны. Её активируют ионы кальция, которые удерживались во внутреннем пространстве митохондрий (матриксе) и теперь могут выходить в цитоплазму вследствие снижения окислительного фосфорилирования и падения разности потенциалов на мембране. Данный «кальций - фосфолипазный» канал механизма, запускаемый при недостаточности митохондриального дыхания в условиях гипероксии, способствует, очевидно, развитию избыточного ПОЛ в мембранах лишь на начальных стадиях канцерогенеза. Для состоявшихся же клеток неоплазмы значение указанного канала в создании пероксигеназных условий, вероятно, утрачивается, а пролиферативные их свойства в отличие от нормальных клеток становятся независимыми от содержания Ca²⁺ (Paul, Ristow, 1979).

Изложенное выше представление остаётся в принципе неизменным, если даже учесть следующее сообщение (Evtodienko et al., 1998). Во внутренней мембране митохондрий печени содержатся 3 главных Са²⁺-связывающих пептида: белок 130 кД, гликопротеин 43-44 кД и белок 29-30 кД. Однако в той же мембране митохондрий гепатомы Зайделя один из них отсутствовал (130 кД), а 2 других компонента присутствовали в пониженном количестве. Выходит, низкая концентрация Са²⁺ в митохондриях гепатомы и, возможно, других ти-пов опухолей может объясняться не только падением в них мембранного потенциала, но и отчасти утратой или заметным снижением содержания Са²⁺-депонирующих структур. Что касается постоянной готовности клеток неоплазмы к делению по каким-то Са²⁺-независимым механизмам, то здесь важную роль, на наш взгляд, играют несколько обстоятельств. Это, прежде всего, различные АФК и продукты пероксидации, «подменяющие» Са²⁺ в активации PLA₂ (Дубинина, 1989; Byczkowski, Channel, 1996); процессы инактивации аденилатциклазы и активации гуанилатциклазы при ПОЛ, способствующие пролиферации, и др. (см. ниже).

Общие количественные закономерности, связывающие скорость размно-жения опухолевых клеток и особенности их энергетического обмена, пока не сформулированы, однако отдельные наблюдения в литературе рассмотрены. Так, между интенсивностью образования энергии в гепатомах и скоростью их роста существует строгая линейная зависимость (Голубев, 1981). В этом же аспекте можно трактовать известное положение о том, что для опухолей характерен неконтролируемый рост, а не ускоренный. Обобщая подобные факты, Казанцева (1981) отметила: «В опухолевых клетках часто не только не наблюдается сокращения времени клеточного цикла по сравнению с нормальными аналогами, но, напротив, время удлиняется, причём это происходит в основном за счёт значительного возрастания продолжительности периодов G₁ и G₂, хотя период S в ряде опухолей также удлиняется. Даже у быстро пролиферирующих опухолевых клеток человека продолжительность митотического цикла больше, чем в быстро обновляющихся нормальных тканях».

Наряду с дефицитом ATP причиной уменьшения содержания cAMP в трансформированной клетке считают снижение активности фосфолипидочув-ствительной аденилатциклазы в плазматической и митохондриальной мембра-нах и (или) повышение активности фосфодиэстеразы cAMP. Это положение давно уже подтверждено многими фактами. Так, уже на ранних стадиях гепа-токанцерогенеза, индуцированного нитрозодиэтиламином, в плазматической мембране клеток печени крыс существенно изменяется липидный состав (снижается содержание фосфатидилсерина и фосфатидилхолина), с чем связывают подавление базальной активности аденилатциклазы и ослабление её чувствительности к NaF (Санина и др., 1986). На поздних стадиях того же гепатокан-церогенеза указанные изменения остаются «в силе». Одновременно с повы-шением вязкости липидного бислоя плазматической мембраны в опухолевых клетках печени уменьшается содержание cAMP, обусловливаемое как сниже-нием активности аденилатциклазы, так и возрастанием активности фосфодиэс-теразы cAMP (Антоненко и др., 1990). Эти изменения отчасти ответственны за низкое соотношение cAMP/cGMP в ткани опухоли. Активность аденилатцик-лазы резко снижена в предопухолевых и неопластических очагах, вызванных в печени крысы N-нитрозоморфолином. Попытки с помощью различных стиму-ляторов повлиять на её активность в клетках этих очагов оказались безуспеш-ными, хотя в контроле и в окружающих предопухолевые и опухолевые зоны нормальных тканях те же стимуляторы повышали активность аденилатциклазы (Ehemann et al., 1986).

Несмотря на отсутствие надёжных данных о роли конкретных фосфо-липидов в функционировании компонентов аденилатциклазного комплекса, общий вывод известен: фосфолипиды способствуют сопряжению многих ре-цепторов с аденилатциклазой. При деструкции фосфолипидов в ходе их пере-кисного окисления это сопряжение может нарушаться, затрудняя активацию аденилатциклазы. Действительно, экстракция липидного компонента мембраны приводит к снижению активности аденилатциклазы и потере её чувствительности к гормональным воздействиям. Добавление фосфолипидов способствует реактивации фермента и восстановлению указанной чувствительности (Туракулов и др., 1983). Во многих последующих исследованиях подтверждено, что делипидизация аденилатциклазного комплекса под действием PLs и органических растворителей приводит к снижению или даже к полной потере его активности (см. Кухарь и др., 1991). Недостаточность антиоксидантов должна содействовать развитию ПОЛ и, следовательно, инактивации аденилатциклазы. Таким образом, за уменьшение содержания cAMP, выполняющего в клетке разнообразные регуляторные функции, могут быть ответственны как субстратный, так и ферментативный «каналы».

Примечательно, что изменение уровня cAMP в клетке небезразлично для её биоэнергетики, которая оказалась cAMP-управляемой. В ряде исследований установлен факт, с нашей точки зрения, принципиальной важности: дыхание митохондрий в норме cAMP-зависимо. Так, по данным ещё Халестрапа (Halestrap, 1978) cAMP оказывает стимулирующее действие на дыхательную цепь митохондрий, вследствие чего увеличивается градиент рН на мембране и активируется транспорт пирувата из цитозоля в митохондрии. Повышение активности ферментов цикла Кребса (NAD-изоцитратдегидрогеназы, цитратсинтазы, сукцинатдегидрогеназы) циклическим AMP показывает важность контроля этого цикла в стимуляции cAMP общего потребления организмом О₂ (Туракулов и др., 1983). Через механизм фосфорилирования cAMP стимулирует активность изоцитратдегидрогеназы, а также ферментов внутренней мембраны митохондрий – сукцинат- и цитохромоксидазных систем (Кулинский и др., 1981; Медведев и др., 1983).

Способность cAMP усиливать потребление О₂ клетками хорошо демонстрирует следующий пример. В инкубационной среде в присутствии простагландина Е₂ (PGE₂) происходило интенсивное поглощение О₂ изолированными клетками паренхимы печени молодых крыс Spague-Dawley. Этот процесс коррелировал с индуцируемым PGE₂ образованием cAMP. Усиление поглощения О₂ наблюдалось и в присутствии дибутирил-cAMP. А проникающий в клетки ингибитор cAMP-зависимой протеинкиназы ограничивал поглощение О₂, возра-ставшее под влиянием PGE₂. Потребление О₂ клетками стимулировало также присутствие в среде инкубации каталитической субъединицы указанной протеинкиназы (Qu et al., 1999). Однако в нормально пролиферирующих и особенно опухолевых клетках функция cAMP как усилителя энергообразования (Федоров и др., 1990) снижается в связи с падением в них уровня этого циклонуклеотида. Данное обстоятельство в наших моделях клеточной пролиферации и канцеро-генеза было учтено введением в энергетический канал регуляции соответ-ствующего звена (Лю, Ефимов, 1978; Лю, Саприн, 1980).

Механизм передачи сигнала cAMP внутрь митохондрий пока ещё непо-нятен. С одной стороны, «в митохондриях нет специфических транспортной системы и (или) связывающих белков для cAMP, и он проникает в митохондрии и выходит из них по градиенту концентрации» (Зобова, Баранова, 1987), с другой – в этих органеллах обнаружены cAMP-рецепторные белки, cAMP-зависимые протеинкиназы и фосфодиэстераза cAMP. Иммунологически присутствие cAMP-зависимых протеинкиназ показано, в частности, в митохон-дриях печени, почек, поджелудочной и околоушной слюнной желез, миокарда и скелетных мышц. Протеинкиназы расположены на внутренней мембране и в матриксе митохондрий. В цитоплазме и клеточных ядрах плотность метки, соответствующей этим ферментам, ниже, чем в митохондриях (Trinczek et al., 1989). Для активации cAMP ферментов, локализованных на внутренней мемб-ране и в матриксе митохондрий, необходима целостность этой мембраны, причём восприятие и реализация сигнала cAMP для ферментов внутреннего компартмента осуществляются с помощью периферических белков внешней поверхности внутренней мембраны митохондрий (Медведев и др., 1990).

Очевидно, свойство cAMP стимулировать митохондриальное дыхание че-рез механизм фосфорилирования в условиях низкого его содержания, харак-терного в большинстве случаев для клеток неоплазмы, реализуется слабо или вовсе не реализуется, что способствует образованию ещё одного замкнутого цикла с положительной обратной связью по поддержанию сниженного уровня дыхания. Изменение интенсивности некоторых других cAMP-зависимых про-цессов в клетке и связь их с канцерогенезом обсуждаются в данном и ряде последующих подразделов и разделов книги.

Рассматриваемый нами cAMP-зависимый энергетический канал управления клеточным циклом (пролиферацией) в действительности дополняется участием в cAMP-опосредованном ингибировании прохождения клеточного цикла белковых факторов. cAMP дозозависимо супрессирует экспрессию ряда циклинов и циклин-зависимых протеинкиназ (cdk). Например, в первичной культуре астроцитов крысы cAMP замедляет прохождение фаз G₀/G₁, ингибируя экспрессию циклинов А и Е, а из 3 тестированных каталитических компонентов cdk – экспрессию cdk1 и cdk2, но не cdk4 (Gagelin et al., 1999). При сниженном уровне cAMP синтез указанных белковых факторов и соответственно прохож-дение клеточного цикла не будут, очевидно, заторможенными. Названные и другие составляющие сложного механизма окислительного митогенеза, скорее всего, не являются строго независимыми, а, напротив, как-то связаны между собой. Не исключено, например, что даже умеренные уровни гипероксии, ПОЛ и АФК как следствие снижения интенсивности дыхания и утилизации О₂ митохондриями могут, независимо от падения концентрации ATP и cAMP, индуцировать на уровне транскрипции экспрессию ряда генов, причастных к митогенезу (см. п. 1.1.1).

2.1.10. Накопление промежуточных и конечных продуктов пероксидации и окислительная модификация различных биомолекул, как мы полагаем, лежат в основе этиологии злокачественного роста. Однако корреляции между усилением перекисеобразования в клетках и активизацией пролиферации и других проканцерогенезных процессов не наблюдается в широком диапазоне содержания указанных продуктов. Как и для многих других биохимических процессов вообще, корреляция здесь достоверна только в определённом интервале их концентрации.

Известно (Барабой и др., 1992), что содержание продуктов ПОЛ в нормально метаболизирующих тканях крайне невелико и строго регулируется. Однако при интенсификации клеточного метаболизма возрастает и активность процессов липидной пероксидации, указывая на необходимость участия липидных перекисей в биоэнергетических и биосинтетических процессах (Козлов и др., 1972; Титеева, Коровина, 1996). В частности, образование умеренного количества перекисей липидов в мембранах митохондрий оказывает в норме положительный эффект на их функционирование. В этой связи привлекает внимание работа Дмитриева с соавт. (1990), в которой развивается представление о том, что интенсивность синтеза ATP, как и ПОЛ, тесно связана с реакцией образования липидных радикалов L˙ из ненасыщенных жирных кислот фосфолипидов и что для эффективного синтеза ATP в митохондриях важен определённый уро-вень концентрации этих радикалов. По данным этих исследователей, липидные радикалы, являясь связующим звеном между дыхательной цепью и ATP-синте-тазой, способны в ходе липид-белкового взаимодействия образовывать интер-медиат (Int), обеспечивающий эффективность утилизации ∆μΗ – разности электрохимических потенциалов ионов водорода и синтеза ATP в целом. Реакции L˙ с редокс-цепью и антиоксидантом AOH

L˙ + [Int] → LH; L˙ + AOH → LH + AO˙

возвращают липидные молекулы LH, а реакция L˙ + О₂ → LO и последующие процессы образования гидроперекисей LOOH влияют на окислительное фосфорилирование негативно. Ограничителем ПОЛ здесь выступает убихинон, он же поддерживает определённый оптимальный уровень L˙.

О позитивной функции низкого уровня ПОЛ в митохондриях сообщили недавно и Саакян с соавт. (1998). Ими установлено, что физиологический выход Са²⁺ из митохондрий происходит благодаря мягкому повышению проница-емости мембран этих органелл перекисными соединениями, причём данные процессы ингибируются ADP и антиоксидантом ионолом. Кроме того, было обращено внимание на существенный момент: концентрация продуктов ПОЛ, приводящая к освобождению Са²⁺ из митохондрий, примерно на порядок ниже тех, которые характерны для патологических состояний. Эти интересные факты о регуляторной роли низких концентраций перекисей получены при исследовании действия отрицательных аэроионов на процессы ПОЛ в митохондриях печени крысы. В итоге, подтверждая известное благотворное биологическое действие указанных аэроионов, авторы пришли к обоснованному выводу о том, что первичным физико-химическим механизмом такого их действия может быть обнаруженная ими мягкая активация процессов ПОЛ в физиологическом диапазоне концентраций продуктов ПОЛ.

В контексте рассматриваемого вопроса продолжают вызывать интерес также сведения о проявляющихся в норме при митогенезе признаках усиления процессов прямого свободнорадикального окисления как следствия умеренной внутриклеточной гипероксии. В частности, речь идёт о давней теории, согласно которой непосредственный переход к митозу определяется свободнорадикальным окислением белков (Гурвич, Гурвич, 1945). Правда, по современным представлениям, такому окислению при гипероксии подвергаются прежде всего фосфолипиды. Стадия прямого свободнорадикального окисления не связана с запасанием ATP и приводит в основном к выделению энергии непосредственно в виде тепла и частично в форме сверхслабой люминесценции. Отсюда понятен феномен предшествующей делению клетки кратковременной энергетической разрядки – вспышки теплопродукции (Жолкевич и др., 1972) и излучения (Гурвич, 1968). Относительная кратковременность разрядки объясняется, вероятно, двумя взаимосвязанными причинами: во-первых, она может возникнуть только при достижении рО₂ внутри клетки некоторого критического значения; во-вторых, повышенный расход кислорода, вызванный резкой интенсифика-цией свободнорадикального окисления, вновь снижает рО₂ до уровня ниже критического.

В изложенной интерпретации премитотические гипероксия и энергоразрядка кажутся не имеющими самостоятельного биологического смысла. В действительности же, как уже отмечалось выше, премитотическое ПОЛ может быть реальным участником ряда необходимых в норме биохимических процессов. Его считают, например, и механизмом разборки внутриклеточных мембран (Барабой и др., 1992) перед делением клетки. Эти и некоторые другие факты вместе взятые согласуются с принципиальным, по сути, положением о том, что окислительный стресс средней интенсивности причастен к индукции клеточной пролиферации (Меньшикова, Зенков, 1997). Тем самым подтверждается известное в литературе достаточно аргументированное понятие «окислительный митогенез» (см. также п. 1.1.2).

В норме сверхслабым свечением сопровождаются и ферментативные про-цессы пероксигенации как, например, осуществляемые LOX реакции окисления арахидоновой кислоты. Это свидетельствует о том, что в ходе таких реакций часть выделяющейся энергии преобразуется в энергию электронного возбуждения соответствующих продуктов. Более того, в случае безызлучательного переноса этой энергии последняя может использоваться для регуляции некоторых биохимических процессов и образования ряда биологически активных веществ. Данный путь утилизации энергии биологического окисления назван «темновым фотохимическим сопряжением», а само это сопряжение «имеет такой же биологический смысл, что и электрохимическое сопряжение, лежащее в основе митохондриального дыхания» (Баскаков, Воейков, 1996).

Таким образом, даже из приведённых выше нескольких примеров следует, что низкие и умеренные значения возникающего в клетке (локально и/или периодически) ПОЛ необходимы для протекания нормальных метаболических процессов. Высокие же уровни ПОЛ и его продуктов почти всегда токсичны и приводят к угнетению пролиферации и даже гибели клеток (Владимиров, Арчаков, 1972). По-видимому, для опухолевой трансформации и поддержания её в этом состоянии необходим какой-то промежуточный между указанными случаями уровень пероксигенации липидов. При дальнейшем изложении матери-ала нами имеется в виду лишь этот промежуточный, опухолевый вариант.

Отражением развития избыточного ПОЛ может быть повышение уровня свободных радикалов в стадиях диффузно-очаговой гиперплазии и в небольших первичных опухолях, индуцированных действием различных по своей природе канцерогенных факторов. Исследования в этом направлении, судя по публикациям, наиболее активно проводились в 70-х годах. Тогда же был установлен существенный факт: концентрация свободных радикалов и значительная интенсификация свободнорадикальных процессов достигают максимального уровня в периферийной зоне растущих неоплазм (Саприн, 1974; Эмануэль, 1977), где условия для активного роста особенно благоприятны. В ряде исследований в первичных опухолях были зарегистрированы сигналы ЭПР свободных радикалов перекисного типа. В тех случаях (например, при полимерном канцероге-незе), когда такие сигналы не наблюдались, метод хемилюминесценции показал, что в период увеличения интегральной концентрации свободных радикалов здесь обнаруживается существенное возрастание интенсивности сверхслабого свечения липидов малигнизирующихся тканей, механизм которого, по данным литературы, обусловлен рекомбинацией радикалов LO₂. Таким образом, и здесь в суммарном сигнале ЭПР предполагается существенный вклад липидных перекисных радикалов (Саприн, 1974).

Аналогичные исследования были проведены Сизых (1972). В стадиях предрака и образования небольших опухолевых узелков наблюдалось увеличение концентрации свободных радикалов и интенсивности хемилюминесценции липидов. Значительное повышение уровня свободных радикалов в саркомах (200-400 % по сравнению с гомологичной нормальной тканью) показано также Петяевым (1972), и вновь содержание их было особенно высоким в периферийных слоях опухолевой массы. Сигналы ЭПР свободных радикалов перекисного типа были зарегистрированы в образцах перевивной гепатомы (но не печени), облученных гамма-лучами при температуре жидкого азота и постепенно размораживаемых (Пулатова и др., 1978). Приведённый факт также может служить косвенным свидетельством повышенного содержания О₂ в пролиферирующих зонах неоплазм по сравнению с соответствующими нормальным тканями. Следовательно, феномен увеличения концентрации парамагнитных центров в ткани опухолей подтверждён экспериментально.

Вообще же, к выводу о несомненности факта протекания свободнора-дикальных реакций in vivo, их причастности к различным патологическим процессам в живых клетках исследователи приходили и раньше (см. п.1.7). Это касается, в частности, участия радикальных реакций в канцерогенезе и в дегра-дационных процессах клетки (Haddow, 1947; Butler, 1950; Александер, 1956; Сыркин, 1960 и др.). В бывшем СССР исследования такого рода были начаты по инициативе Эмануэля. В одной из своих первых работ он предположил, что свободные радикалы участвуют в механизме канцерогенеза, играя важную роль в процессе роста и развития опухоли (Эмануэль, Липчина, 1958). Результаты многолетнего изучения характера биофизического свободнорадикального сдвига в процессе развития опухолей и установленные при этом количественные закономерности обобщены в ряде его работ (Эмануэль, 1977, 1980).

В последующие годы данные о накоплении в тканях опухолевого организма свободных радикалов, прежде всего кислородных, и участия процессов ПОЛ в качестве характерного патогенетического звена в индукции опухолевого роста публиковались многократно (Floyd, 1981; Oberley et al., 1981; Oberley, Oberley, 1984; Mackay, Beweley, 1989; Ames, Shigenaga, 1992; Tsai et al., 1992; Матвеев и др., 1993; Salim, 1993; Halliwell, 1994; Iwagaki et al., 1995; Франциянц и др., 1996; Sadani, Nadkarni, 1996; Wachsman, 1996; Арутюнян и др., 1997; Babior, 1997; Zhang D. et al., 1997; Забежинский, Анисимов, 1998; Aruoma, 1998; Durko, Gondko, 1998; Hirayama, Yasutake, 1998; Maeda, Akauke, 1998; Шарова, 1999; Maher, Schubert, 2000; Ray et al., 2000 и др.). При этом существенен такой момент: высказанное нами давнее представление о том, что активно растущие опухолевые клетки находятся фактически в состоянии перманентного окислительного стресса, вызванного устойчиво поддерживаемой в них гипероксией (Лю, Ефимов, 1976; Лю, Саприн, 1980), признаётся теперь и другими исследователями (Okamoto et al., 1994; Toyokuni et al., 1998).

Продолжалось и продолжается соответственно пополнение фактов, подтверждающих давно известное противоопухолевое действие различных антиоксидантов, ловушек свободных радикалов (Лю, Шайхутдинов, 1991; Balanski et al., 1992; Li Ji et al., 1995; Ruby et al., 1995; Drake et al., 1996; Ottino, Duncan, 1996; Hipkins, 1998; Anderson et al., 1999; Prasad et al., 1999; Nishidai et al., 2000; Tsan et al., 2000: Хомеркин, 2001; Chen R.-Ch. et al., 2001 и др.). К их числу относятся и гормоны с антиоксидантными свойствами (Anisimov et al., 1994; Das, 1995; Reiter et al., 1995; Tarquini et al., 1995; Анисимов и др., 1996; Цирлина и др., 1997).

2.1.11. В новообразованиях должны обнаруживаться и повышенные концентрации самих продуктов ПОЛ – промежуточных и конечных. Ещё в 50-х годах Рондони (1957) были отмечены и обсуждены увеличенное содержание в опухолях гидроперекисей и их возможная роль в «денатурации белка». Сущес-твенными они должны быть прежде всего в активно пролиферирующих зонах. Сравнение активности системы метаболизма перекисей в ткани рака толстой кишки и в прилежащей неопухолевой ткани больных показало (Baur, Wendel, 1980), что первые содержат MDA в количестве 147 пмоль/мг белка, а вторые – лишь 40 пмоль/мг. Это различие было достоверным. У женщин с раком шейки матки уровни перекисей липидов значительно выше в злокачественной ткани, чем в нормальной, и они коррелировали с клиническими стадиями опухоле-генеза. В то же время в раковой ткани снижены концентрации GSH, витаминов Е и С, активности GPX и SOD (Ahmed et al., 1999).

Не менее впечатляют данные о различии «перекисных» показателей, полученные при исследовании биоптатов рака пищевода и нормальной слизистой его, а также плазмы крови раковых и нераковых больных (Levy et al., 1998). Среднее содержание MDA в слизистой нормального пищевода составляло 0,807, а у больных раком пищевода – 2,53 нмоль/мг белка; содержание того же продукта необратимого ПОЛ в плазме крови в контроле 0,697, а у больных раком пищевода – 4,23 нмоль/мл. Уровень продуктов обратимого ПОЛ составлял соответственно 2,957 и 16,32 нмоль/мг белка, 1,929 и 12,607 нмоль/мл. О значительном повышении содержания перекисей липидов в тканях опухолей пищеварительного тракта и о снижении в них активности антиоксидантных ферментов, в частности SOD, сообщали и другие исследователи (см., например, Zhou et al., 2000).

На концентрацию продуктов ПОЛ может влиять уровень cAMP в клетке, что стало известно после обнаружения прямой активации GPX и глутатион-S-трансферазы (GST) при их фосфорилировании cAMP-зависимой протеинкина-зой А, PKA (Кулинский, Колесниченко, 1993). Поскольку содержание cAMP в неоплазмах обычно уменьшается, то следует ожидать и падения cAMP-стиму-лируемой активности указанных ферментов и соответственно повышения уро-вня орнанических пероксидов и Н₂О₂. Митохондрии аденокарциномы толстой кишки крыс характеризовались увеличенным потенциалом окисления липидов в перекисные соединения: этот показатель в них в 8-10 раз выше, чем в нормальных органеллах. Одно из следствий указанного структурного изменения мембраны – снижение в митохондриях опухолевых клеток активности NADH-цитохром с-редуктазы (Rana et al., 1980).

Важно отметить, что, помимо зависимой от гипероксии неферментативной свободнорадикальной пероксигенации, определённый вклад в повышение уровня ПОЛ в предопухолевых и опухолевых клетках вносят и ферментативные процессы, в частности, активация LOX-пути метаболизма арахидоновой кис-лоты – составного компонента процесса активации пролиферации (см. п. 3.2). Ингибирование этого пути должно, очевидно, в какой-то-мере препятствовать развитию канцерогенеза по кислородно-перекисному механизму. Действите-льно, оральное введение мышам соединения ТМК-688, сильного ингибитора 5-LOX, подавляло образование опухоли кожи, индуцированной диметилбензантраценом и промотированной форболовым эфиром (Jiang et al., 1994). Другой ингибитор 5-LOX (А-79175) снижал множественность химически индуцированных опухолей лёгкого у мышей на 75 %, уменьшал возникновение тех же опухолей на 20 %, а их средний объём – на 64%. Особенно эффективной была комбинация А-79175 с ацетилсалициловой кислотой, которая снижала множественность неоплазм лёгкого на 87 %, а частоту их возникновения – на 24 % (Rioux, Castonguay, 1998).

12-LOX и её продукт 12-гидроксиэйкозатетраеновая кислота участвуют в выработке митотического сигнала. Экспрессия этой оксигеназы показана, например, в клетках разных линий рака предстательной железы (LNCaP, HEL и др.), причём обработка клеток метастатического рака ингибиторами LOX снижает их способность образовывать метастазы при перевивке животным (Timar et al., 2000). А интенсивное накопление 8- и 12-гидроксипроизводных эйкозатетраеновой кислоты с участием LOX-8 может играть решающую роль в развитии эпидермальных опухолей (Bürger, Fürstenberger, 1999). На заявленное же в 1995 г. использование ингибиторов LOXs в качестве противораковых агентов выдан патент США (Mulshine, Jett, 2000).

Еще в большей степени в создании пероксигеназной ситуации участвует COX-путь метаболизма арахидоновой кислоты. На этот счёт представлено, особенно в последние годы, много фактов. Отметим некоторые из них. У большинства больных колоректальным раком увеличена экспрессия COX-2, а не-стероидные противовоспалительные средства оказывают защитное действие. Ингибиторы COX-2 эффективно предотвращают образование колоректальных полипов и прогрессию их в рак (Pairet, 1997). Комбинация различных антиок-сидантов с ингибиторами COX-2 аддитивно уменьшает экспрессию COX-2 в клетках колоректального рака человека НСА-7, в опытах же in vivo эта комбинация приводит к регрессии опухоли (Chinery et al., 1998). Исследование экспрессии COX-2 в образцах аденом, карцином, гиперпластических поражений и образцах нормальной слизистой, прилегающей к тканям опухолей, показало: в аденомах и карциномах экспрессия увеличена, по сравнению с нормальной тканью, на 89,4 и 83 % соответственно; в гиперпластических участках она тоже повышена, но меньше, чем в опухолях. Авторы (Hao et al., 1999) полагают, что в процессе спонтанного колоректального канцерогенеза экспрессия COX-2 про-исходит на ранних стадиях и может участвовать в опухолевой прогрессии.

Сходная информация приведена и в других работах (Wilson et al., 1998; Ratnasinghe et al., 1999; Zimmermann et al., 1999), где тоже изучали увеличенную экспрессию COX-2 в препаратах слизистой пищевода и желудка, рака пище-вода. Результатом были подтверждение способности COX-2 быть медиатором воспаления и пролиферации, участником неопластической прогрессии. Диаметр опухолей желудка у больных с экспрессией COX-2 был больше, чем у таких же больных, к которых данная экспрессия не определялась (соответственно 6,5 ± 4,6 и 3,8 ± 2,7 см; р < 0,05). Достоверно более высокая экспрессия мРНК COX-2 наблюдалась также у больных с вовлечением в болезнь лимфоузлов по сравне-нию с больными без этой патологии (70 % и 40 % соответственно; р < 0,05). Данные факты рассматриваются как клиническое подтверждение того, что COX-2 может вносить вклад в прогрессию аденокарцином желудка человека (Uefuji et al., 2001). В раковой ткани пищевода от 24 больных экспрессия COX-2 выявлена в 91,7 % образцов, причём это проявление коррелировало с мета-стазами в лимфоузлах, но не с размерами опухоли, глубиной инвазии и сте-пенью злокачественности. В нормальных тканях пищевода экспрессии COX-2 не было (Qing et al., 2001).

В повышенном количестве COX-2 синтезируется также в тканях рака поджелудочной железы, плоскоклеточного рака головы и шеи, где уровень её мРНК увеличен соответственно в ~60 и ~150 раз по сравнению с нормальной прилегающей тканью (Tucker et al., 1999) или тканью здоровых испытуемых (Chan G. et al., 1999). Избыточная экспрессия COX-2 выявлена в процессе образования опухолей в лёгких у крыс, получавших обработанный нитрозамином высокожировой рацион (El-Bayoumy et al., 1999). В 72 % образцов, полученных при хирургическом лечении 130 больных аденокарциномой лёгкого, экспрессия COX-2 оказалась повышенной, причём такая экспрессия COX-2 и низкая выживаемость больных на ранних стадиях были взаимосвязаны (Achiwa et al., 1999). Важная роль экспрессии COX-2 показана при развитии инвазивной переходноклеточной карциномы мочевого пузыря человека –эффекта, которого не было в нормальной ткани мочевого пузыря (Mohammed et al., 1999). В первичной опухоли мочевого пузыря собак и её метастазах экспрессия СОХ-2 выявлялась во всех 21 образцах, но не в нормальной ткани указанного органа. А противоопухолевое действие нестероидных противовоспалительных средств может быть обусловлено их ингибированием активности СОХ-2 (Khan et al., 2000).

Экспрессия COX-2 и синтез ею PGE₂ минимальны в нормальной ткани, но повышены в клетках плоскоклеточного рака и аденокарциномы шейки матки. Кроме того, иммунореактивные COX-2 и PGE₂ сосуществовали в клетках эндо-телия, выстилающего сосуды всех изученных типов рака шейки матки (Sales et al., 2000). Сверхэкспрессия COX-2 показана и в ткани аденокарциномы предста-тельной железы человека: в её образцах от 12 больных уровень мРНК COX-2 был в 3,4 раза выше, чем в гомологичной нормальной ткани (Gupta et al., 2000). Установлено также, что туморогенное облучение кожи мышей УФ-лучами В на протяжении 1-20 нед. индуцирует экспрессию COX-2 в коже, отсутствующую у контрольных животных. Эта экспрессия была выражена сильнее в хорошо дифференцированных карциномах, чем в доброкачественных папилломах. Поэ-тому COX-2 может служить ранним маркёром канцерогенного действия УФ-В, а ингибирование данного фермента – методом профилактики указанного действия УФ-В (Athar et al., 2001). Действительно, рост опухолевых клеток кожи человека подавляли как ингибиторы экспрессии COX-2, так и ингибиторы её каталитической активности, но первые из них были в своём действии эффективнее. Этим подтверждалось существование двух различных сигнальных путей для регуляции роста клеток через COX-2 (Higashi et al., 2000). Не лишним будет отметить здесь, что противоопухолевый эффект, проявляемый нестероидными противовоспалительными средствами, реализуется и путём ингибирования COX-2 (Bus et al., 2000).

Свершению указанных процессов содействует, по-видимому, другой эф-фект COX-2: индукция продукции ангиогенных факторов, необходимых и для опухолевого роста (см. п. 2.2). На клетках эндотелия и карциномы in vitro показано, что нестероидное противовоспалительное средство (аспирин) и селективный ингибитор COX подавляли образование ангиогенных факторов (Wunsch, 1998). Такой же ингибитор COX-2 подавлял ангиогенез на периферии опухолей и рост самих неоплазм у мышей в опытах in vivo (Nishimura et al., 1999). Ещё в одной подобной работе целекоксиб, ингибитор COX-2, подавлял рост привитых опухолей у мышей и образование сосудов роговицы крыс, т. е. это противо-воспалительное средство, как полагают (Masferrer et al., 1999), может оказаться полезным для лечения онкологических больных. В аспекте рассматриваемого вопроса привлекательна и оригинальная модель канцерогенеза в молочной железе (Harris et al., 1999). Она включает последовательную индукцию и сти-мулирующую регуляцию генов СОХ незаменимыми жирными кислотами, содержащимися в пище. По этой модели, процесс канцерогенеза связан с биосинтезом простагландинов (PGs) и образованием свободных радикалов О₂ и N₂, ответственных за инициацию опухолегенеза. В частности, PGE₂ индуцирует биосинтез эстрогенов и экспрессию фактора роста эндотелия сосудов, которые соответственно поддерживают митогенез, стимулируют ангиогенез и метастазирование опухоли.

Кстати, согласно одной из недавних работ (Plastaras et al., 2000), повышенные экспрессия COX-2 и синтез PGs могут быть опасны в канцерогенном отношении и в случае, если они сочетаются с экспрессией изоформ цитохрома Р-450. Последние способны метаболизировать PGs в качестве своего субстрата, и одним из продуктов этого превращения является MDA – эндогенный мутаген, с которым связывается вероятность возникновения нестабильности генома в процессе канцерогенеза. С приведёнными выше данными коррелируют материалы о том, что селективный ингибитор COX-2, этодолак, заметно подавляет образование PGE₂ в клетках HT-29/Inv3, а также их инвазивные и метастати-ческие свойства (Chen W.-Sh. et al., 2001). В целом опосредованное СОХ-2 изменение концентрации арахидоновой кислоты в клетке влияет на многие функции последней. Индукция СОХ-2 промотирует клеточный рост, усиливает клеточную подвижность. Up-регуляция СОХ-2 считается ключевым моментом в развитии канцерогенеза, а сверхэкспрессия её – достаточной для проявления данной патологии (Cao, Prescott, 2002).

Механизм увеличения продукции COX-2 в опухолях пока нельзя считать хорошо понятным. Нередко к усилению экспрессии гена COX-2 причастны и онкогены, например, H-ras (Sheng et al., 2000). Экспрессия последнего, в свою очередь, опосредуется различными АФК (Griendling et al., 2000) и, как показано на линиях клеток рака толстой кишки человека, подавляется антиоксидантом кверцетином (Ranelletti et al., 2000). Супрессор опухолей р53 противодействует экспрессии COX-2. Это определено, правда, на примере фибробластов эмбрионов мышей и объяснено тем, что р53 конкурирует с ТАТА-связывающим белком за места связывания в промоторе COX-2 (Subbaramaiah et al., 1999).

Примечательно, что активность гена COX-2 специфически индуцируется одним из конечных продуктов ПОЛ – 4-гидрокси-2-ноненалем, но не другими из полученных при исследовании окисленных жирных кислот. Это показано на линии эпителиальных клеток RL34 печени крысы (Kumagai et al., 2000). Кос-венно о причастности АФК и продуктов ПОЛ к экспрессии гена COX-2 свиде-тельствует и тот факт, что в раковых клетках ободочной кишки человека линии DLD-1 различные флавоноиды ингибировали транскрипцию гена COX-2. Наиболее эффективным из этих антиоксидантов был кверцетин, а наиболее слабым – катехин (Mutoh et al., 2000). Эти частные эффекты можно рассматривать как проявление действия в LOX- и COX-системе локального контура регуляции с положительной перекрестной обратной связью, призванного, очевидно, поддерживать устойчивое функционирование уже включённого в работу, в частности, сигнального пути COX-2.

В большинстве указанных выше работ полагают, что COX-2 может быть мишенью для профилактики и терапии раковых заболеваний. В качестве средства для реализации этой цели естественно использовать прежде всего ингибиторы COX, некоторые эффекты которых уже отмечались нами. Здесь же обратим внимание на ещё один интересный факт. Мышам после достижения перевитой им саркомы FSA размера 6 см в диаметре вводили с питьевой водой SC-236 – селективный ингибитор COX-2 в дозе 6 мг/кг в течение 10 дней. SC-236 значительно подавлял рост опухолей и усиливал их радиочувствительность, но не чувствительность к облучению нормальных тканей (Kishi et al., 2000). Одно из возможных объяснений данного эффекта сводится, во-первых, к тому, что потребление О₂, расходуемого на синтез PGs, снижается, но соответственно несколько повышаются внутриклеточное рО₂ и, следовательно, радиочувствительность опухолевых клеток. В этом смысле ингибиторы COX-2 дейс-твительно могут повысить эффективность лучевой терапии неоплазм. Во-вто-рых, причиной преимущественного увеличения радиочувствительности опухолевых клеток являются, скорее всего, исходно повышенные в них уровни рО₂ и дисбаланса ∆ (ПО – АО), постулируемые кислородно-перекисной концепцией канцерогенеза, т. е. «подготовленность» этих клеток к относительно лёгкому установлению в них более высоких значений рО₂ при ингибировании COX-2-зависимого пути потребления О₂. Не менее важно отметить и другое: одновре-менное подавление теми же ингибиторами опухолевого роста в связи, как мы полагаем, с возрастанием в клетках опухоли дисбаланса ∆_К (ПО – АО) до соответствующих апоптозу А2 или даже – окислительному цитолизу (см. п. 7.1).

Вообще же, эти антиканцерогенезные меры, с учётом сказанного выше, должны быть более эффективными, если одновременно применить ингибиторы LOXs и COXs. Действительно, известен факт: частота возникновения, число и объём опухолей в лёгких мышей снижались при совместном ингибировании активности 5-LOX и COX заметнее, чем при раздельной их инактивации (Rioux, Castonguay, 1998). В целом по обсуждаемому вопросу естественно придти к заключению: кислородно-перекисный механизм канцерогенеза определяют как свободнорадикальные неферментативные процессы, так и некоторые ферментативные, в частности процессы ПОЛ; предложенный нами термин «кислородно-перекисный» более точно, чем «свободнорадикальный», отражает весь комп-лекс разнотипных пероксигеназных процессов, характерных для канцерогенеза (Лю, Исмаилов, 2001).

В развитие обсуждаемого вопроса отметим: устойчиво поддерживаемые гипероксия и пероксидация в клетках растущих участков неоплазмы и соответственно повышенный в них уровень продуктов свободнорадикального ПОЛ не могут не оказывать угнетающего влияния на различные ступени антиоксидантной системы этих клеток. Известно, что при длительном токсическом действии О₂ наблюдается истощение антиоксидантной защиты, а О , в частности, выступает в качестве ингибитора GPX, каталазы и ряда других ферментов (Дубинина, 1989). 4-гидроксиноненаль и н-гексаналь (10 мМ) значительно снижают активность GPX печени крыс (Yoshino, 1995). Попадая в кровеносное русло и затем в нормальные ткани организма, АФК могут индуцировать липопереоксиление и ослаблять антиоксидантные заслоны в их клетках.

Действительно, усиление процессов свободнорадикальной пероксигенации липидов и развивающаяся функциональная недостаточность антиоксидантной системы показаны у больных раком легкого, причём комплексное лечение их с использованием антиоксидантной терапии активировало параметры указанной системы и снижало концентрацию продуктов ПОЛ (Лаппо и др., 1990). Данные о неэффективности антиоксидантной системы при раке гортани привели Дроздз с соавт. (Drozdz et al., 1988). Они обнаружили, что активность GPX в опухолевой ткани существенно ниже, чем в нормальной ткани гортани здоровых лиц, и в меньшей степени отличается от таковой в смежной с опухолью неизменённой ткани. Соответственно содержание GSH (как основной небелковый источник внутриклеточных SH-групп он взаимодействует с АФК и органическими радикалами) было наименьшим в поражённых опухолью тканях, несколько выше – в интактных, но в любом случае – значительно ниже, чем в контроле (3,27, 22,36 и 98,32 мкМ/г соответственно). У детей с нефробластомой отмечены усиление процессов ПОЛ и эндогенной интоксикации, ослабление на этом фоне неферментативного звена антиоксидантной защиты (Ордуханян и др., 2000).

2.1.12. Факты увеличения продуктов ПОЛ в опухолевых клетках коррелируют со способностью последних в порядке естественной меры защиты мобилизовывать (хотя и не всегда эффективно) различные антиоксиданты из печени и других нормальных органов. С точки зрения кислородно-перекисной модели канцерогенеза, этот процесс вполне закономерен и понятен, однако, он не остаётся без последствий для организма-опухоленосителя. Прежде всего, изменяется содержание продуктов ПОЛ и антиоксидантов в крови, которая в качестве посредника первой воспринимает особенности обмена веществ в новообразованиях (см. главу 6). Такого рода данные периодически пополня-ются новыми. Среди них можно отметить, например, следующие.

Сравнительное определение концентрации GSH и цистеина в большом круге кровообращения крыс Fischer-344, которым была трансплантирована метилхолантрен-индуцированная саркома, и в кровотоке, омывающем эту опухоль, показало, что оба тиоловых антиоксиданта из кровотока хозяина активно используются опухолью (Hochwald et al., 1996). На примере больных раком лёгкого подтверждено уже известное ранее: уровень витамина Е в сыворотке значительно снижен по сравнению с таковым у здоровых лиц того же возраста. Данный факт связывается с действием на опухолевые клетки оксидативного стресса и соответственно увеличенным потреблением ими витамина Е (Trabelsi et al., 1998). Значительное накопление последнего в опухолях почек крыс, индуцированных диметилнитрозамином, при различном обеспечении животных α-токоферолом (получавших и не получавших его) свидетельствует о высокой тропности опухолей к этому витамину (Никифорова и др., 1998).

Столь очевидные по излагаемой нами концепции изменения оформлены в виде изобретения (Прохорова и др., 1996). Авторы отмечают, что если в пробе крови пациентов уровни шиффовых оснований, диеновых конъюгатов и диенкетонов составляют соответственно >7,0, >1,4 и >0,4 усл. ед./мл плазмы, а концентрация антиоксидантных витаминов А и Е – соответственно <18,9 и <2,0 мкмоль/л, то диагностируется онкологическое заболевание. Интересна и такая информация. У больных раком яичников лимфоциты и нейтрофилы, циркулирующие с кровью и дренирующие опухоль, содержат значительно меньше витаминов Е и А, чем такие же клетки у здоровых пациенток (Франциянц и др., 1999). Этот факт также, вероятно, связан с перераспределением антиоксидантов, транспортом их в данном случае из иммунокомпетентных клеток в активно растущие участки опухоли и на противодействие повышенному уровню ПОЛ в самой крови онкобольных.

Кроме различных антиоксидантов, в опухоль, похоже, мобилизуются и определённые микроэлементы, входящие в состав антиоксидантных соединений. На это указывает ряд исследований, в том числе недавних, в которых отмечают достоверное снижение в сыворотке крови раковых больных (по сравнению с контрольной группой) концентраций Se, Mn и Zn (Iodice et al., 1998; Zhang M. et al., 1998), т.е. обязательных элементов в структуре Se-зависимых GPX, Mn-SOD и Zn-металлотионеинов. Действительно, содержание Se и активность Se-GPX в опухолях существенно выше, чем в близлежащих неповреждённых тканях и плазме крови (Бабенко, Погрибный, 1986; Kogata et al., 1988). Правда, имеется здесь и другая информация: активность Se-зависимой GPX в опухолевой ткани почки взрослых людей значительно снижена по сравнению с таковой в неопухолевой ткани у тех же больных (Di Ilio et al., 1995). Данные последних лет свидетельствуют и о повышении в новообразованиях активности Mn-SOD (подробнее об этом см. п. 2.1.4).

Что касается Zn, то он в составе изоформ металлотионеинов выполняет защитную роль от окислительных реакций, особенно в областях головного мозга, содержащих высокие концентрации Zn (Helal et al., 1997). Zn-метал-лотионеин обладает широким спектром антиоксидантных и специфических защитных средств, которые могут реализоваться на всех уровнях – молекулярном, субклеточном, клеточном и организменном (Котерова и др., 1998). Не исключено, что снижение концентрации Zn в крови раковых больных связано с мобилизацией его в опухоль и включением в структуру различных изоформ металлотионеинов. Повышенное содержание последних зафиксировано в разных типах новообразований, например, в раковых тканях молочных желез мышей (Florianczyk, Grzybowska, 2000).

Интересно, что в печени и гепатоме крыс LEC накапливается Cu и инду-цируется Cu-содержащий металлотионеин. Физиологическая роль последнего связывается с генерацией различных АФК и участием в катализе окислительной модификации белков и ДНК – процессами, ведущими к таким патологиям как гепатит и гепатома (Sakurai et al., 1998). Таким образом, одни металлотионеины выполняют фактически антиоксидантную функцию, а другие – прооксидантную, но это различие, «не учитывается» организмом при мобилизации этих эле-ментов в растущую опухоль и индукции соответствующих металлотионеинов.

В числе антиоксидантных ферментов, активность которых в неоплазмах возрастает, часто упоминается глутатион-S-трансфераза (GST). Так, Клаппер с соавт. (Clapper et al., 1991) отмечают повышенную активность этой трансфе-разы в опухолях лёгких, молочных желез и толстого кишечника человека по сравнению с нормальными тканями тех же органов. Аналогичные изменения в активности GST показаны в злокачественных опухолях тела матки и яичников (Osmak et al., 1995). А по данным Горожанской и соавт. (2001), в этих опухолях обнаружена повышенная активность не только GST, но и GPX и глутатионредуктазы, что на фоне низкой активности SOD и каталазы указывает на ведущую роль GSH-зависимых ферментов в инактивации пероксидов в клетках неоплазм.

Подобную информацию было бы правильнее анализировать с учётом изоферментного состава соответствующих антиоксидантных ферментов, изменения нормальных соотношений между изоферментами в связи с нарушением их экспрессии в опухолевых клетках. Подтверждением тому может служить, например, следующая работа (Ranganathan, Tew, 1991). С помощью иммуногистохимической оценки биоптатов нормальной ткани и карциномы толстого кишечника человека проведён анализ гетерогенности экспрессии изоферментов GST α, μ и π. Используя поликлональные антитела, специфичные для этого семей-ства изоферментов GST, в образцах карциномы выявили повышение экспрессии π-формы GST и в меньшей степени – μ-GST, а экспрессия α-GST оставалась без существенных изменений. Указанная разница в экспрессии, подтверждённая биохимическими данными, позволила даже предложить π-GST в качестве мар-кёра карциномы. В последующем статистически достоверное увеличение акти-вности π-GST обнаружено и в опухолях некоторых других органов, например лёгких (Булавин и др., 1996).

В некотором потиворечии с указанными материалами находятся данные о достоверном снижении активности GPX, GST, глутатионредуктазы и SOD (но не каталазы) в злокачественных опухолях молочной железы больных. Такой результат объясняют потребностью в повышенной концентрации АФК для стимуляции деления и роста количества клеток (Смирнова и др., 2002), т. е. аргументируется известным положением об участии АФК и окислительного стресса средней интенсивности в регуляции пролиферативных процессов (см. п. 1.1.2; Меньшикова, Зенков, 1997). В опухолевых же клетках, по нашим представле-ниям, действует несколько иная логика: повышенный в них уровень АФК обеспечивается, в основном, дефектностью митохондриального дыхания и соответственно слабой утилизацией О₂, возрастанием рО₂ и дисбаланса Δ (ПО – АО), необходимых для реализации кислородно-перекисного механизма роста и прогрессии неоплазм (см. п. 2.1.4 и 2.4).

В рассмотренных выше исследованиях анализируемые показатели являются усреднёнными по конкретной поражённой или другим тканям, и они могут не отражать особенности состояния антиоксидантной системы в периферийных активно растущих зонах неоплазмы (см. ниже). Поэтому данный аспект требует отдельного рассмотрения, ввиду неоднозначности и противоречивости имеющихся фактов. В большинстве работ отмечается, что антиоксидантная активность на периферии опухоли выше, чем во внутренних её областях. Например, в периферийных участках индуцированной диметилбензантраценом опухоли у крыс активность каталазы, GPX, GST, глутатионредуктазы выше, чем в цент-ральном (Борунов и др., 1989). Это различие, естественно, неодинаковое для разных новообразований и определяемое их индивидуальными особенностями, может быть объяснено двумя причинами: мобилизацией некоторых антиок-сидантов (токоферола, селена и др.) из нормальных тканей в периферийные растущие зоны опухоли (см. выше); активацией синтеза антиоксидантных ферментов (SOD, GST, каталазы) прооксидантными условиями в клетках этой зоны, подобно тому как это происходит во многих тканях новорожденного животного, организм которого попадает в состояние относительной гипероксии после рождения (Дубинина, 1989).

Предпринимаемые организмом меры по усилению антиоксидантной сис-темы в периферийных «пожароопасных» участках опухоли призваны компенсировать избыточный уровень ПОЛ, но они нередко оказываются малоэф-фективными: в противоборстве с гипероксией и пероксидацией неизбежными становятся потери в этой системе, снижающие эффект её усиления. Одной из причин создания такой ситуации является инактивация (самоокисление) части антиоксидантов в прооксидантных условиях. Например, объектом сооки-сления при повышенном уровне ПОЛ в биомембранах и липопротеидах считают β-каротин. Падение его концентрации может снижать витаминный статус организма и способствовать развитию патологических изменений (Гомбоева и др., 2001). Предположительно, β-каротин как антиоксидантное соединение тоже транслоцируется в растущую опухоль, где частично и может подвергаться ука-занному соокислению при ПОЛ.

К числу подвергающихся самоокислению относят, в частности, токоферолы, роль которых в пероксидном окислении липидов мембран подробно изложена в обзоре Бурлаковой и соавт. (1998). Констатируется, что токоферолы в отличие от большинства синтетических фенольных антиоксидантов обладают большим сродством к перокси-радикалам, а образующиеся из токоферолов радикалы высоко стабильны в реакциях рекомбинации и продолжения цепи окисления. Эти радикалы «могут выполнять роль буфера, поддерживающего скорость окисления на определённом уровне для различных концентраций антиоксидантов (регуляция концентрацией) и для субстратов с различной степенью ненасыщенности (регуляция субстратом)». По указанным и некоторым другим причинам условия для поддержания и роста неоплазмы по кислородно-перекисному механизму нередко сохраняются. Вообще же, в зависимости от соотношения скоростей поступления и расходования антиоксидантов состояние защитной системы в наружных зонах опухоли может быть различным, отражая биохимические, структурные и иные особенности каждого новообразования.

В противовес фактам возрастания в неоплазмах количества перекисных продуктов существует информация и обратного характера. Так, по мнению Ланкина и соавт. (1979), содержание перекисей липидов в опухолях низкое или перекиси вообще не обнаруживаются. Уровни MDA в ткани рака молочной железы и в окружающей нормальной ткани достоверно не различаются, нет также корреляции между содержанием MDA и GSH в указанной опухолевой ткани (Coban et al., 1998). Более того, утверждается, что в опухолях низка, как правило, скорость ПОЛ, и это объясняют попросту очень низким содержанием у них ненасыщенных жирных кислот (см. Пескин, 1997, а также п. 2.3.1). Такое мнение, естественно, противоречит постулируемому нами положению о пребы-вании опухолевых клеток в состоянии перманентного пероксидативного стресса. Реальной же представляется обратная картина: содержание ненасыщенных жирных кислот в составе мембранных фосфолипидов неоплазм потому и низкое, что при прочих равных условиях в них поддерживаются повышенные уров-ни АФК и активность процессов ПОЛ. Выводы в цитированных выше работах могли стать ошибочными и с методической точки зрения, оказавшись следствием значительной гетерогенности клеточных популяций неоплазм и трудностей выделения строго активных пролиферирующих опухолевых клеток.

Действительно, в опухолях имеются самые различные клетки: гипоксические и хорошо оксигенированные; неразмножающиеся, проходящие ограниченное число делений и способные делиться неограниченно долго. Клеточные элементы опухолей способны к взаимопревращениям, к переходу из одной субпопуляции в другие. Удовлетворительные методы точной оценки пролиферативного состояния и состава клеточных популяций злокачественных опухолей и особенно методы выделения и изучения стволовых клеток опухолей, ответственных за их прогрессию и реакцию на лечебные воздействия, пока отсутствуют (Акимов и др., 1979). Эта давняя оценка состояния обсуждаемой проблемы остаётся, в основном, такой же и сейчас. Очевидно, в большинстве случаев исследователи анализируют такую гетерогенную клеточную популяцию опухолей, что за низкими усреднёнными цифрами содержания перекисей, на основании которых обычно и формируется мнение, легко могут быть скрыты высокие по ним показатели, характерные для гипероксических клеток в активно растущих зонах опухоли. Кроме того, возможно увеличение скорости утилизации или распада самих перекисей с образованием свободных радикалов (Владимиров, Арчаков, 1972). Этот процесс в специфических условиях опухолевой клетки может быть резко усилен.

2.1.13. Утверждение Варбурга о повышенной потенциальной способности опухоли к гликолизу считается достоверным, однако, единого мнения относительно механизма этого феномена, взаимоотношений гликолиза и дыхания до сих пор нет. Прежде всего, это относится к оценке значимости эффекта Пастера в понимании энергетических особенностей опухолевой клетки. Шапот (1975), например, полагал ошибочным представление об усиленном гликолизе как о следствии недостаточного дыхания, неспособности его осуществлять пастеровский эффект. По его мнению, аэробный гликолиз в раковых клетках возникает потому, что нормальное дыхание оказывается не способным полностью подавить интенсивный гликолиз; последний же объясняется большим возрастанием сродства клеток опухоли к глюкозе, особенностями ферментативного аппарата их поверхностных мембран, появлением, в частности, высокочувствительных к глюкозе изоферментов гликолиза. Действительно, информация об этих изоферментах периодически подтверждается. Например, в клетках гепатомы линии mhAT3F экспрессируется гексокиназа с необычайно высоким для глюкозы значением К_м (40 мМ). Белок с такой активностью локализован в тех же центрах, что и гексокиназа в гепатоцитах (Rencurel et al., 1998).

По данным других исследований, низкие значения эффекта Пастера в опухолевых клетках обусловлены главным образом недостаточной активнос-тью окислительного фосфорилирования. Такое мнение кажется логичным, если учесть, что в основе эффекта Пастера лежат механизмы аллостерического ингибирования фосфофруктокиназы ATP и гексокиназы глюкозо-6-фосфатом (Богацкая, 1968). Снижение же уровня ATP в трансформированных и опухолевых клетках должно ослаблять эффект Пастера и повышать активность указанных ферментов гликолиза. К подобному выводу пришли, по существу, и Хайнрих с соавт. (1980), изучавшие механизм эффекта Пастера с помощью математической модели углеводного обмена. Исследуя на модели взаимодействие гликолиза, цикла Кребса и Н-транспортных челноков при изменениях скоростей окислительного фосфорилирования и нагрузки ATP-азы, они показали, что механизм пастеровского эффекта базируется на действии в углеводном обмене двух отрицательных обратных связей: в гликолизе – по уровню ATP, в цикле Кребса и Н-транспортных челноках – по уровню митохондриального NADH. Величина и знак эффекта Пастера зависели от уровня наггрузки ATP-азы. На переключение энергетического метаболизма в опухолевых клетках на гликолиз в связи с недостаточностью митохондриального дыхания (низким со-держанием нормально функционирующих митохондрий) указывалось и в ряде работ последних лет (Oudart et al., 1997; Cavalli, Liang, 1998; Smith, 2000).

Логика указанных изменений в энергетике опухолевых клеток принципи-пиально, по-видимому, не отличается от таковых в нормальных клетках, если последние оказываются в состоянии слабой утилизации О₂ из-за его недостаточности (фактическая гипоксия) или же только из-за дефектов в дыхательной цепи митохондрий (фиктивная внутриклеточная гипоксия). В этом отношении интересны результаты математического моделирования биоэнергетики в различных тканях человека, полученные с учётом динамического баланса глико-гена, глюкозы, пирувата, лактата, О₂, СО₂ и ряда других субстратов. Обращено внимание на то, что, в соответствии с моделью, незначительное снижение потребления О₂ мышечной тканью резко увеличивает накопление лактата. Метаболизм лактата прямо не зависит от концентрации О₂ в ткани, но косвенно регулируется процессами, связанными с потреблением О₂, путём изменения соотношений ADP/ATP и NADH/NAD (Cabrera et al., 1998).

Несколько неожиданным механизмом, возможно, имеющим отношение к повышению уровня аэробного гликолиза в клетках активно растущих участков опухоли, может оказаться ранее неизвестный эффект – зависимость скорости катализируемой лактатдегидрогеназной реакции

ЛДГ

П ируват Na + NADH L-лактат Na + NAD⁺

от концентрации растворённого в реакционной смеси О₂ воздуха (Мостовиков и др., 1991). Авторы этой работы, опираясь на литературные данные о повышенном сродстве О₂ к молекулам NADH и возможном образовании комплекса молекул О₂ с NADH, показали, что указанный эффект действительно обуслов-лен образованием комплекса динуклеотида с молекулами О₂, причём индуцируемые молекулярным О₂ изменения носят обратимый характер. Ими же установлено, что «использование обескислороженных растворов NADH –ЛДГ для запуска ферментативной реакции превращения пирувата в лактат приводит к уменьшению её скорости (по сравнению с контрольными О₂-содержащими растворами кофермента) на 30 %». Если обнаруженный эффект имеет место и в условиях in vivo, то фактически это может означать реализацию на базе данного принципа регулирования интенсивности гликолиза в зависимости от величины внутриклеточного рО₂. Применительно к гипероксическим опухолевым клеткам с их недостаточным дыханием такое регулирование должно сводиться к автоматическому повышению уровня аэробного гликолиза. Не исключено, что этот же механизм регуляции срабатывает в эмбриональных и других активно пролиферирующих клетках, в которых, как известно, также снижены содержание митохондрий, митохондриальное дыхание, потребление О₂ и уровень ATP, но интенсивно протекает аэробный гликолиз (см. Евтодиенко, Теплова, 1996; Von Wagenheim, Peterson, 1998).

Высокий уровень гликолиза в клетках неоплазмы может быть связан со смещением регуляции активности гексокиназы и фосфофруктокиназы, осущес-твляемой по механизму «фосфорилирование – дефосфорилирование». Опыты на белых крысах показали, что в норме реализация механизма происходит через изменение в тканях концентрации сАМР под влиянием адаптивных гормонов, активацию соответствующих сАМР-зависимых протеинкиназ, фосфорилирование гексокиназы и снижение её активности, причём этому процессу подвергаются только изоферменты 2 и 3 гексокиназы (Панин и др., 1981). Аналогичная ситуация складывается, по-видимому, и в случае другого гликолитического фермента фосфофруктокиназы. В гепатоцитах сытых крыс дибутирил-сАМР снижает активность фосфофруктокиназы, не влияя на активность противоположно действующего фермента фруктозодифосфатазы, ингибирует аэробный гликолиз и потребление глюкозы (Ochs, Harris, 1980).

Снижение активности фосфофруктокиназы в результате сАМР-зависимого её фосфорилирования и подавление гликолитического процесса отмечаются также в ряде других работ (Курганов, 1986). В более поздних исследованиях данный эффект объяснён несколько иначе. Оказалось, что факторы, вызывающие накопление сАМР, подавляют активацию гена фосфофруктокиназы и тем самым снижают катализируемый этим ферментом синтез фруктозодифосфата – стимулятора гликолиза. Концентрация мРНК фосфо-фруктокиназы снижается в процессе дифференцировки клеток рабдомиобластомы и увеличивается при стимуляции роста клеток сывороткой, фактором роста эпидермиса или про-дуктом онкогена v-src. Накопление указанной мРНК происходит при переходе G₁ → S клеточного цикла и зависит от наличия сайта связывания фактора тран--скрипции E2F промотором гена фосфофруктокиназы (Darville et al., 1995). При низком содержании сАМР, характерном, как отмечалось выше, для клеток активно растущих участков опухоли, ингибирующее действие его на гексоки-назу и фосфофруктокиназу и на их синтез будет ослаблено, активность же и содержание этих ферментов соответственно должны возрасти

Эти соображения с учётом положений развиваемой нами концепции кан-церогенеза и перепрограммирования экспресссии генов позволяют считать: высокий уровень гликолиза в активно растущих зонах неоплазмы – результат одновременно нескольких связанных с малигнизацией событий, значимость которых в процессе возникновения и развития опухоли изменяется. На самых ранних этапах канцерогенеза существенной представляется роль пониженного дыхания и ослабленного эффекта Пастера, а позже эти факторы тем более не способны противодействовать интенсивному гликолизу. Последний опирается теперь на новую мощную «материальную» базу – перераспределённый изозимный состав ферментов энергетического обмена с увеличенным синтезом некоторых изоферментов гликолиза (гексокиназы и других фосфокиназ) за счёт повышения экспрессии генов, кодирующих эти изоферменты (Gellerich et al., 1995). С данных позиций интенсивность гликолиза и количество ключевых гликолитических ферментов коррелируют с интенсивностью роста опухоли потому, что они определяют этот рост, закономерно проявляясь при наличии глюкозы и переходе клетки в состояние пролиферации – условия, обязательного для развития канцерогенеза. Действительно, высокий уровень гликолиза необходим для скоростной продукции гликолитической системой не только ATP, но и предшественников биосинтеза нуклеотидов, амино- и жирных кислот и соответственно синтеза нуклеиновых кислот, белков и липидов. Сказанное о гликолизе не является особенностью лишь опухолевых клеток: повышенный гликолиз присущ и всем нормальным активно пролиферирующим клеткам, интенсивно синтезирующим ДНК, РНК и другие макромолекулы (Евтодиенко, Теплова, 1996).

Ещё один вариант механизма интенсификации гликолиза возможен в связи с данными о стимуляции глюкозой in vivo и in vitro на транскрипционном уровне экспрессии гена переносчика глюкозы в клетках гепатомы мыши и в первичных культурах гепатоцитов крыс. Особенно привлекателен тот факт, что дибутирил-сАМР подавлял в этих клетках индуцированное глюкозой само-обеспечение путём накопления мРНК переносчика глюкозы (Rencurel et al., 1997). Такой принцип саморегуляции гомеостаза глюкозы, реализуемый, по-видимому, и с участием эндогенного сАМР, может способствовать в условиях опухолевой клетки установлению избыточного прогликолизного состояния. Причина – низкое содержание в них сАМР, снятие запрета на синтез мРНК переносчика глюкозы и соответственно ограничений на доставку этого суб-страта для гликолиза.

Интенсивный гликолиз, в свою очередь, ингибирует дыхание опухолевых клеток. Это характерное их свойство также не специфично только для них (Шапот, 1975). В указанном смысле эффект Кребтри то же «работает» на поддержание внутриклеточной гипероксии и пероксидации, а искусственно создаваемая гипергликемия может усугубить это состояние и тем самым избирательно повысить чувствительность опухолевых клеток к различным воздействиям (облучению, гипертермии и др.). Что же касается биологического значения эффекта Кребтри и внутриклеточных механизмов его реализации, то они остаются пока неясными. По мнению Евтодиенко и Тепловой (1996), «в присутствии глюкозы в быстро пролиферирующих нормальных и опухолевых клетках срабатывают специальные регуляторные механизмы, обеспечивающие нужное соотношение активностей систем гликолиза и окислительного фосфорилирования», при этом основным внутриклеточным сигналом, регулирующим это соотношение, считают увеличение в цитозоле клеток концентрации ионов Са²⁺. Последние, аккумулируясь затем в матриксе митохондрий, изменяют активность ряда ферментов и, в конечном счёте, угнетают дыхание.

В представленной модели просматривается, на наш взгляд, алогичность некоторых функциональных связей. Так, существуют данные об аккумуляции Са²⁺ в матриксе митохондрий, механизм которой зависит от окислительного фосфорилирования и разности потенциалов на их внутренней мембране (Владимиров, 1987), где эти ионы активируют дегидрогеназы, способствуя повышенной поставке NADH в дыхательную цепь и интенсивной продукции ATP. Тем самым обеспечивается работа и самого указанного потенциалозависимого механизма. В опухолевой клетке в связи с относительно низкой активностью окислительного фосфорилирования эффект накопления Са²⁺ в матриксе митохондрий должен быть незначительным. Авторы же упомянутого выше «неконкурентного, Са²⁺-механизма» эффекта Кребтри полагают, что, наоборот, в митохондриях опухолевых клеток содержание Са²⁺ повышается. Это положение не согласуется также с хорошо известной независимостью пролиферативных свойств клеток неоплазмы от Са²⁺ (см. п. 2.1.9). Для прояснения здесь ситуации необходима дополнительная информация.

Наконец, как представляется нам, вклад в развитие эффекта Кребтри может внести фермент гликолиза пируваткиназа, если она действительно способна подавлять полимеризацию тубулина и вызывать частичную разборку стабилизированных таксолом микротрубочек с образованием большого количества нитчатых тубулиновых олигомеров (Vértessy et al., 1999). Со свойством пиру-ваткиназы и некоторых других соединений дестабилизировать микротрубочки мы связываем нарушение внутри клеток транспортных путей, роль которых, как известно, выполняют в норме элементы целостного цитоскелета, в частно-сти, сеть микротрубочек. Следствием этого нарушения должна быть дезорга-низованность в локализации и функционировании митохондрий, пероксисом и других органелл, ранее прикреплённых к микротрубочкам. Прежде и более всего, возникают трудности с устойчивой адресной доставкой к митохондриям О₂ и субстратов окисления, соответственно лимитируются окислительное фосфорилирование, а внутриклеточное рО₂ повышается из-за слабой утилизации поступившего в клетку О₂. В опухолевых клетках эти изменения с участием пируваткиназы происходят, вероятно, легче, так как у них цитоскелет частично уже дестабилизирован. Приведённые соображения о связи между степенью потребления О₂ митохондриями и эффективностью окислительного фосфорилирования, с одной стороны, и состоянием микротрубочек, с другой, привлекаются нами для объяснения и ряда других существенных проявлений в клетке (см. п. 1.7.1.4, 1.7.3.2, 2.3.5, 4.2.4 и 7.1.8).

2.1.14. Противоположно направленные изменения гликолиза и дыхания реализуются, скорее всего, в митохондриях. Но место локализации процесса гликолиза достоверно не выяснено. Гексокиназа, например, располагается или в цитозоле, или на внешней мембране митохондрий, причём свободная гексокиназа и другие гликолитические ферменты в цитозоле более характерны для нормальных клеток, а связанная с митохондриями гексокиназа – для неопластических. Именно такое различие было в своё время выявлено в клетках печени и гепатомы, причём быстрорастущие гепатомы содержали больше связанной с митохондриями гексокиназы, чем медленнорастущие (Гобеев, Хрипач, 1976). Эти давние факты увеличения связывания гексокиназ с митохондриями опухолевых клеток и возрастания активности этих ферментов подтверждены недавно на примере больных раком печени и некоторых других органов (Smith, 2000). На поверхности наружной мембраны митохондрий гексокиназа ассоциирована с порином – белком с мол. м. 30 кД, образующим в этой мембране поры диаметром 2 нм. Этому связыванию отводят центральную роль в регулировании гликолиза и обмена метаболитов между окислительным и гликолитическим путями преобразования энергии (Nelson, Kabir, 1986). Кроме того, существует мнение о том, что мембраносвязанный тубулин является частью пор с временной проницаемостью митохондрий и (или) что присоединение последних к сети микротрубочек важно для регуляции указанных пор. Антитубулины (колхицин и др.) предотвращают закрывание чувствительных к циклоспорину А пор, не влияя на окислительное фосфорилирование (Evtodienko et al., 1996).

Молекулярные механизмы, регулирующие процессы ассоциации и диссоциации гексокиназы с митохондриями, остаются пока неизвестными. Каким-то образом они сопряжены с состоянием цитоскелета. Последний можно рассматривать как упорядоченную систему транспортных линий, вдоль которых митохондрии могут передвигаться и вступать в контакт с другими мембранными системами и макромолекулами. Сейчас известно, что транспортная функция вдоль микротрубочек и актиновых волокон обеспечивается специальными моторными белками – кинезином и динеином, которые, являясь механоферментами (АТРазами), преобразовывают химическую энергию АТР в механическую для движения органелл по стационарным микротрубочкам и актиновым филаментам (Васильев, 1996; Rogers, Gelfand, 2000).

Микротрубочки и микрофиламенты служат также матриксом для упоря-доченного расположения ряда ферментов гликолиза. Последние могут, как и в некоторых микроорганизмах, образовывать полиферментные комплексы (гликолитические метаболоны). Один из ферментов гликолиза, по гипотезе Курганова (1985, 1986а), адсорбируется на определённой внутриклеточной структуре (вероятно, на актиновых нитях), после чего на этом ферменте происходит сборка в единое целое остальных компонентов гликолитической цепи. По другой более давней информации (Baum et al., 1966), в интактной клетке ферменты гликолиза, организованные в компактные мультиэнзимные комплексы, упорядоченно расположены вдоль мембран эндоплазматической сети. А для случая эритроцитов предложена гипотетическая структура комплекса ферментов гликолиза, формирующегося на внутренней поверхности мембраны этих клеток и содержащего тройной набор гликолитических ферментов (Курганов, Любаров, 1988). Компоновка метаболона здесь начинается с посадки 6-фосфофруктоки-назы – самого большого по размерам гликолитического фермента, причём первый фермент гликолитического пути гексокиназа не входит в этот комплекс.

Существует, однако, представление о том, что комплекс гликолитических ферментов компартментализуется не целиком, отдельными составляющими его частями, каждая из которых прикрепляется к структурному компоненту клетки и функционирует относительно самостоятельно, без жесткой взаимосвязи между ними (Муронец, Наградова, 1990). Например, цепь гликолитических ферментов может быть подразделена на 4 сегмента (Masters et al., 1987). Первый из них, состоящий из гексокиназы, глюкозофосфатизомеразы и фосфофруктоки-назы, локализован, вероятно, поблизости от митохондрий, что может достигаться или адсорбцией гексокиназы на митохондриях, или адсорбцией фосфо-фруктокиназы на расположенных близко к ним актиновых нитях. Компартментализация остальных сегментов на структурных элементах также реализуется связыванием с ними конкретных ферментов: альдолазы и глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы во 2-ом сегменте, пируваткиназы и лактатдегидрогеназы соответственно в 3-ем и 4-ом сегментах (см. Муронец, Наградова, 1990).

При известной дестабилизации элементов цитоскелета, как в случае трансформированной и опухолевой клеток (см. п. 2.3.4), указанная пространственно разобщённая организация процесса гликолиза будет, очевидно, нарушена, и эффективность этого процесса изменится. В какую же сторону? Один из вероятных исходов здесь может быть таким: разобщённые до этого сегменты гликолитической цепи получают теперь возможность стыковаться в единый комплекс и способствовать тем самым интенсификации гликолиза. Не исключено поэтому, что повышенный уровень гликолиза в ростстимулированных и, особенно, опухолевых клетках при снижении в них митохондриального дыхания, синтеза АТР, сАМР и возрастании ПОЛ связан также с дезорганизацией пучков микрофиламентов и микротрубочек. По-видимому, эти изменения имеют прямое отношение к тому, что отмечали Васильев и Гельфанд (1981): «На ранних стадиях процессов стимуляции роста могут наблюдаться выраженные в небо-льшой степени регрессивные изменения различных внутриклеточных структур, подобные тем, которые наблюдаются при процессах повреждения».

Если исходить из указанной выше логики, то воздействия, способствующие восстановлению целостности цитоскелета, должны вновь разъединить гликолитический комплекс, предоставив возможность его сегментам закрепиться на своих исходных пространственно разделённых участках цитоскелета и тем самым ослабить процесс гликолиза. О реальности такого механизма регуляции гликолиза свидетельствует тот факт, что в клетках меланомы В16 таксол не только ингибирует динамические процессы в сети микротрубочек, но и сни-жает уровень гликолиза. Эти эффекты таксола были дозозависимыми (Glass-Marmon, Beitner, 1999). С учётом же сказанного в п. 2.1.13, рассматриваемая взаимосвязь между гликолизом и состоянием цитоскелета является, возможно, составной частью механизма, вызывающего изменение интенсивностей гликолиза и дыхания в противоположных направлениях.

В целом всё же идея организации ферментов гликолиза в надмолекулярный комплекс (метаболон), о котором говорилось выше, представляется достаточно логичной. В дальнейшем она была развита и применительно к другим ферментам, катализирующим последовательные реакции в системе биоэнергетики. В частности, была предложена модель метаболона в виде пятеричной структуры ферментов цикла трикарбоновых кислот Кребса (Vélot et al., 1997).

Заслуживает внимания также и принципиально важный вопрос о том, является ли интенсификация гликолиза в делящихся клетках, включая опухолевые, лишь ответной компенсаторной реакцией на снижение дыхания и окислительного фосфорилирования или же имеет и какой-то другой биологический смысл. В определённой мере ответ на этот вопрос дан в цитированной выше работе Евтодиенко и Тепловой (1996) в связи с обсуждением ими механизма эффекта Кребтри. Сходную точку зрения на биологическую роль высокого гликолиза высказывают и другие исследователи. По мнению Резцовой и Филова (1992), основное значение гликолиза состоит в биосинтезе предшественников нуклеотидов, а не в энергообеспечении. Снижение уровня дыхания приводит к снятию ограничений скорости синтеза нуклеотидов, падение же интенсивности окисли-тельного фосфорилирования обеспечивает более эффективное использование промежуточных продуктов окисления глюкозы для синтеза предшественников нуклеотидов и, следовательно, нуклеиновых кислот. Но нам представляется всё же спорным допускаемое здесь преуменьшение энергетической значимости гликолиза в условиях недостаточности митохондриального дыхания.

Нельзя не коснуться здесь и вопроса о предполагаемых функциях ферментов гликолиза в ядре клеток, где их присутствие считается установленным. Высказано, например, мнение, что содержащиеся в ядрах лактатдегидрогеназа и 3-фосфоглицератдегидрогеназа оказывают влияние на репликацию, транскрипцию и репарацию ДНК (Popanda et al., 1998). В опытах на фибробластах человека и на бесклеточной системе синтеза ДНК с ДНК-полимеразами α, β и ε из регенерирующей печени крысы эти исследователи, в частности, показали: активность ДНК-полимераз дифференциально подавляется или стимулируется в зависимости от степени фосфорилирования названных выше ферментов гликолиза. Учитывая имеющиеся сведения о зависимой от сАМР активности ряда цитоплазматических ферментов гликолиза (см. выше), можно полагать, что и в ядре отдельные из этих ферментов сАМР-зависимы. Тогда логично ожидать от них антипролиферативную «линию поведения», диктуемую сАМР в большинстве случаев, т.е. все зависимые от сАМР гликолитические ферменты должны ингибировать репликацию ДНК, транскрипцию причастных к пролиферации генов и стимулировать репарацию ДНК.

Наконец, хорошо известно, что в трансформированных и, особенно, в опухолевых клетках в связи с усилением гликолиза и избыточным образованием молочной кислоты создаётся и поддерживается кислая среда (Шапот, 1975). Но более всего такому исходу способствует, по-видимому, снижение активности фосфолипидозависимой РКС в условиях внутриклеточной гипероксии и устойчивого ПОЛ (см. п. 3.2.2). Вследствие этого активация указанным ферментом Na⁺/H⁺-обмена через плазматическую мембрану существенно ослабляется или вовсе прекращается, что и может быть дополнительной причиной снижения рН в опухолевых клетках.

В заключение специально подчеркнём существование в клетке следующего важного принципа управления биоэнергетикой: сАМР как вторичный посредник, образующийся из АТР, причастен к изменению интенсивности гликолиза и митохондриального дыхания в прямо противоположных направлениях, причём сАМР-зависимый гликолиз ингибируется, а сАМР-зависимое дыхание стимулируется. При уменьшении по тем или иным причинам содержания сАМР в клетке указанные биоэнергетические процессы изменяются в обратную сто-рону, т.е. гликолиз усиливается, а дыхание подавляется. Такая ситуация возни-кает, на наш взгляд, временно в нормальных пролиферирующих клетках и пос-тоянно – в опухолевых. Изложенный принцип вполне объясняет, например, взаимосвязь перестройки клеточной энергетики в гепатомах со скоростью их роста: чем больше последняя, тем слабее активность дыхательных ферментов и интенсивнее гликолиз (Weber, 1983).

2.1.15. Принципиально важным информационным признаком, демонстри-рующим последствия рассмотренной выше энергетической патологии в опу-холевых клетках, следует признать гипертермию неоплазм. По давним ещё сведениям (Fourre, 1975), более 90 % злокачественных опухолей уже в ранней стадии сопровождается гипертермией. Этот феномен лежит в основе широко известного ныне термографического метода ранней диагностики неглубоко расположенных неоплазм. Наиболее заметное развитие термографических исследований больных раком (прежде всего молочной железы) происходило в 70-80-х годах. Тогда были сформулированы показания к инфракрасной тер-мографии при раке молочной железы, пигментных опухолях кожи и опухолях глаза, саркоме костей и мягких тканей. Установлена диагностическая эффективность термографии для выявления злокачественных опухолей слюнных желез, щитовидной железы, верхнечелюстных пазух, полости плевры и метастазов опухолей, не обнаруживаемых другими методами. Показаны возможности термографии для объективной оценки терапевтического эффекта лечения опухолей и прогнозирования (Amalric et al., 1978). На быстродействующем тепловизоре, соединённом с компьютером, получают данные, не зависящие от визуальной оценки исследователем, что делает диагностику более точной и объективной. Диагностическая ценность термографии возрастает с увеличением размера опухолей, а чувствительность её – с использованием достижений приборостроения.

Поиск причин гипертермии опухолей привёл нас к следующему представлению. В норме тепловой гомеостаз теплокровных организмов поддерживается в основном за счёт реакций микросомального окисления, не сопряжённых с преобразованием и аккумуляцией энергии, главным образом процессов ПОЛ мембран – ферментативного NADPH-зависимого и неферментативного аскорбатозависимого. При гипоксии теплопродукция и температура, естественно, снижаются. В экстремальных случаях, например, при адаптации к холоду, разобщение окислительного фосфорилирования в митохондриях приводит, как известно, к выделению дополнительного тепла.

В опухолевых клетках гипертермия определяется иными механизмами. Отмеченная в них дестабилизация микросомальных мембран, деструкция и снижение уровня цитохромов приводят к тому, что интенсивность NADPH-зависимого и аскорбатозависимого ПОЛ значительно ниже в микросомах опухолей, чем в микросомах нормальных тканей (см. п. 2.3.6). В этих условиях роль микросом в создании гипертермии сомнительна. Основная статья прихода тепла в опухолевых клетках, ответственная за гипертермию в них, формируется за счёт снижения интенсивности митохондриального дыхания, возникновения гипероксии и преимущественного потребления О₂ в реакциях прямого свободнорадикального окисления липидов, в которых энергия выделяется непосред-ственно в виде тепла. Частично тепловая энергия поставляется в связи с возрастанием пероксисомального окисления, также не связанного с аккумуляцией энергии в форме АТР (см. п. 2.3.7).

Эффект гипертермии характерен для всех активно растущих зон неоплазмы, но наиболее доступен для проверки на периферийных его участках. Такая локализация источника повышенного тепловыделения означает, что опухоли должны быть окружены своего рода «горящей» тепловой оболочкой, более или менее чётко отграничивающей их от нормальных тканей и, следовательно, полезной для установления конфигураций и границ новообразований. Различные антиоксиданты – ингибиторы окислительных процессов должны, очевидно, прекратить или снизить избыточное тепловыделение из указанных зон. Напротив, при искусственных гипертермических воздействиях извне такие опухолевые клетки прогреваются, естественно, быстрее и до более высоких температур, ускоряющих их гибель, и в этом проявляются повышенная термочувствительность активно растущих участков неоплазмы и соответственно лечебный эффект теплового фактора (Лю, Шайхутдинов, 1991).

Основные положения рассмотренной в данном подразделе митохондриальной концепции и базирующейся на ней кислородно-перекисной модели канцерогенеза отображены в упрощенном виде на рис. 13. Представленные здесь процессы совпадают с теми, которые постулировались в качестве ведущих при «митохондриальном» старении клетки (см. рис. 2). Опухолевая трансформация такой стареющей клетки должна происходить относительно быстро и легко ввиду подготовленности её в пероксидантном отношении к этому событию.

2.1.16. Вопрос о наследственной передаче свойств неоплазмы, в частности нарушенного энергетического обмена, – наиболее «каверзный» для сторонников эпигенетического механизма канцерогенеза. Как отмечают Зюсс с соавт. (1977), ещё самим Варбургом предложено возможное решение этой проблемы, исходящее из допущений: митохондрии являются независимыми микроорганизмами, и воспроизводство их не зависит от ядра; клетка, из которой «выбиты» митохондрии, не может образовывать новых митохондрий. Данное представление, возможно, справедливо при полном исчезновении митохондрий из клетки, но вряд ли правильно в случае, если клетка утрачивает лишь часть этих органелл или они признаются неполноценными.

Логика о почти автоматическом наследовании таких «неполных» дефектов дочерними клетками не имеет достаточного обоснования, причём кодирование некоторых белковых компонентов митохондрий ядерной ДНК не изменяет существа возражений. Последние опираются на способность митохондриального аппарата нормальных клеток адаптироваться к изменению внутриклеточного рО₂ и, в частности, отвечать на снижение дыхания компенсационной стимуляцией роста и деления митохондрий (Озернюк, 1978). В данном случае смысл адаптации путём увеличения «мощности» митохондрий сводится к устранению опасной для жизни клетки гипероксии, возникающей после предшествующего ей устойчивого падения по тем или иным внутриклеточным причинам интенсивности митохондриального дыхания. Примечателен и тот факт, что в разных зонах цитоплазмы нормальной клетки реализуется обратная зависимость между степенью дифференцировки митохондрий и способностью их к росту и де-

Повреждение мтДНК, снижение ее содержания и синтеза белков митохондрий

Повреждение дыхательных ферментов митохондрий

Снижение интенсивности дыхания

Уменьшение общего количества и увеличение дефектных митохондрий

Снижение общей «мощности» митохондрий и потребления ими О₂

Избыточное ПОЛ внутреннуй мембраны митохондрий

Радиация

Снижение уровней АТР и сАМР

Рис.13. Упрощенная функциональная схема возникновения в клетке состояния гипероксии и пероксигенации, необходимого для индукции канцерогенеза по митохондриально-перекисной модели

Нарушения в других структурах клетки (плазматической мембране, микросомах, лизосомах, цитоскелете, ядре)

– отклонение от нормы процессов синтеза и регуляции, трансформация клетки в состояние неконтролируемого размножения

Канцерогенные агенты

Возникновение и (или) усиление устойчиво поддерживающихся гипероксии и пероксидатного стресса в клетке

лению (Озернюк, 1978). Подробнее этот феномен рассмотрен нами в п. 6.3.2 в связи с аналогичной зависимостью между дифференцировкой и пролиферацией клетки в норме. Что касается действия указанного выше механизма адаптации в опухолевой клетке, то здесь он, скорее всего, в той или иной степени дефектен ввиду, как мы полагаем, возникновения в ней устойчивого пероксигеназного состояния, постоянно (непрерывно) дестабилизирующего внутриклеточные структуры, в первую очередь митохондрии.

Обсуждение вопроса о наследовании дефектного энергообмена естественно связать с возможными извращениями в структуре и функции мтДНК клеток неоплазмы. Действительно, мтДНК является мишенью не только экзогенных канцерогенных агентов, но и образующихся в клетках в процессе бластомоге-неза АФК и продуктов ПОЛ. Подробная информация на этот счёт содержится в обзорной работе «Кислородные радикалы, перекисное окисление липидов и повреждения ДНК в митохондриях» (Hruszkewycz, Bergtold, 1988). В ней наряду с обобщением сведений по обмену О₂ и митохондриях, о ПОЛ и мтДНК как мишени для радикалов О₂ представлены данные о сайт-специфическом расщеплении этой ДНК перекисными и свободными радикалами. Таким образом, модификация (преимущественно окислительная) и мутации мтДНК, механизмы репарации которой менее эффективны, чем яДНК, могут приводить к стойкому повреждению дыхательной цепи (Ames et al., 1993; King, 1995) и стать реальной причиной закрепления этого «энергетического» дефекта в ряду поколений опухолевых клеток.

Недостаточность дыхания и соответствующая ей внутриклеточная гипероксия в потомстве трансформированных клеток могут быть и следствием пере-дачи по наследству состояния, сложившегося после дестабилизации ядерного генома (см. п. 2.3.8). Достаточно реальным представляется также перепрограммирование генома при воздействии избыточных количеств эндогенных АФК и продуктов ПОЛ, образующихся при участии экзогенных канцерогенных факторов различной природы. В результате могут происходить устойчивое изменение спектра регуляторных белков, снятие действия некоторых из них, в частности репрессоров митогенеза. При разнообразии экзогенных и эндогенных канцерогенных факторов расстройства в физиолого-регуляторном механизме, осуществляющем запрограммированное включение и выключение множества генов, могут происходить не единственным путём. Возможности и последствия подобных нарушений были в своё время подробно рассмотрены, исходя из введённого нами представления о глобальной транскриптоно-триггерной системе организации и функционирования клеточного генома (Лю, Ефимов, 1978; Лю, Саприн, 1980).

Вкратце напомним, что упомянутая система состоит из отдельных относительно самостоятельных подсистем, и одна из них представляет подсистему управления клеточным циклом – так условно назван тот комплекс генов (транскриптонов), который кодирует структурные и регуляторные белки, необходимые для реализации только процессов роста и пролиферации клетки. При злокачественном перерождении последней в процесс вынужденных переключе-ний вовлекается часть указанных подсистем и соответственно значительное количество генов, что проявляется в «дисфункции» множества генов, в изме-нении функционирования генома в целом (Швембергер, 1987). Прежде всего, индуцируется подсистема управления клеточным циклом. Ключевыми молекулами, участвующими в этом цикле, являются циклины, циклинзависимые киназы и ингибиторы этих киназ. Последние играют решающую роль в механизмах остановки клеточного цикла и при принятии решения в точке рестрикции, т.е. служат фактически регуляторами пролиферации клеток. Многие из этих ингибиторов подавляют опухолегенез и, вероятно, необходимы для поддержания клеточного гомеостаза.

Некоторые из белков, вовлечённых в регуляцию движения клеток по митотическому циклу, относятся к онкобелкам. Одни кодирующие их акти-вированные протоонкогены способствуют пролиферации клеток, а другие (гены-супрессоры), напротив, ингибируют клеточную пролиферацию (Киселев, 1998). К числу таких ингибиторов принадлежат, в частности, протоонкогены Ras и Raf. Их активация вызывает быстрый и необратимый блок клеточных делений и преждевременное начало старения, например, фибробластов чело-века и мыши в культуре. Эти эффекты ассоциированы с индукцией р21^Cip1 и p16^Ink4a – ингибиторов циклинзависимых киназ (Zhu J. et al., 1998). Экспрессия названных протоонкогенов происходит, очевидно, в соответствии с программой работы подсистемы управления клеточным циклом. В этом смысле клеточные онкогены ничем не отличаются от других нормальных генов.

Подсистемой управления клеточным циклом синтезируются, по-видимому, и некоторые другие прямо или косвенно причастные к пролиферации участники: ростовые факторы, белки митотического аппарата, определённые компоненты клеточной мембраны, ингибитор митохондриального дыхания, ферменты ДНК-комплекса и ряд иных «пролиферативных» ферментов. Некоторые из перечисленных элементов также являются продуктами протоонкогенов. При таком подходе проблему кооперации протоонкогенов в процессе канцерогенеза естественно увязывать с конкретными локальными функциями, выполняемыми их онкобелками в норме при осуществлении процессов роста и пролиферации клетки.

С изложенных позиций особенно важным представляется рассмотрение сдвигов в энергетическом обмене и состоянии мембран, исходя из ведущей, по кислородно-перекисной концепции, роли изменений в них при малигнизации клетки. Именно с этими сдвигами, не имеющими, казалось бы, прямого отношения к самому клеточному циклу, связано бесконтрольное, по существу, функционирование подсистемы управления клеточным циклом, её мембран-ного и энергетического каналов. Многие из событий в клетке, ответственных за наступление такого результата, отчасти уже рассмотрены выше и в дополнение к ним и ранее изложенным (Лю, Шайхутдинов, 1991) будут ещё обсуждаться в последующих разделах монографии.

Считаем нужным также отметить здесь, что с нашим мнением о функционировании в составе единой переключательной транскриптоно-триггерной сис-темы генома разных по назначению подсистем созвучны по ряду моментов представленные позднее модели некоторых других исследователей. Рассмотрен, например, феномен «секторной» репрессии генов, или «суперрепрессии» и причины её широкой распространённости. Особенно интересны, на наш взгляд, разделы обзора: секторный контроль и клеточные типы; суперрепрессированные секторы как переключатели в программе развития (Zuckerkandl, 1997). И, конечно же, весьма авторитетны давно проводимые в США под руководством Дж. Вебера (2001) исследования по перепрограммированию экспрессии генов в раковых клетках. Как показано в этих исследованиях, неопластическим клеткам свойственна качественно-количественная программа экспрессии генов, которая не характерна для контрольных, регенерирующих и дифференцирующихся тканей. Качественные изменения экспрессии генов влекут за собой изменения, в частности, изоферментного спектра и связанные с этим перепрограммированием конкретные преимущества для раковых клеток.

Наконец, в связи с обсуждаемой темой важное значение приобретает вообще сама концепция о наследуемых эпигенетических изменениях активности генов, которая в какой-то степени была затронута нами уже самой постановкой вопроса о существовании переключательной транскриптоно-триггерной системы организации и функционирования клеточного генома. Как известно, в отличие от наследуемой генетической изменчивости эпигенетическая не связана непосредственно с изменением первичной структуры ДНК и «представляет собой воспроизведение в ряду клеточных поколений изменение эпигенотипа, т.е. спектра функционирующих в конкретный момент времени генов» (Михеев и др., 1999). Мы полагаем, что особенности отдалённой энергетической патологии опухолевых клеток вполне могут быть объяснены, исходя из предположения об их связанности с названными эпигенетически наследуемыми измене-ниями активности генов, в данном случае генов энергетического профиля. На такую роль эпигенетических механизмов указывает возможность их индукции заведомо негенотоксичными химическими агентами и ионизирующей радиа-цией – фактором, который обычно считается генотоксическим. Отмечают, нап-ример, что, подобно УФ-облучению и химическим канцерогенам, ионизирующая радиация способна индуцировать или стимулировать генную экспрессию, апоптоз клеток, модифицировать межклеточные взаимодействия, вызывать опу-холевую трансформацию in vitro и канцерогенез in vivo без заметного генотоксического эффекта (Trosco, 1998; см. также Михеев и др., 1999). Ранее своё представление о способах регуляции генной активности на уровне эпигенотипа высказывали и другие исследователи, в частности, Албертс с сотруд. (1994).

Итак, точка зрения о модификации эпигенетического уровня регуляции генной активности, в частности, активности «энергетических» генов, обосновывающая недостаточность митохондриального дыхания в клетках неоплазмы, представляется нам достаточно правдоподобной. При этом экзогенные и эндогенные канцерогенные агенты приводят к такому исходу, скорее всего, опосредованно, через стадию стойкой индукции или избыточного образования АФК, состояния пероксигеназного стресса, которые, собственно, и участвуют в эпигенетически наследуемом изменении спектра функционально активных генов.