- •9. Генетические и негенетич.Взаимодействия вирусов. Генетические взаимодействия между вирусами:
- •Негенетические взаимодействия вирусов:
- •23. Методы экспресс диагностики вирусных инфекций. Серологические, риа и тд, ответы ниже
- •27. Профилактика вирусных заболеваний.
- •29 Лаб. Животные и их использование
- •33. Действие на вирусов физико-химических факторов Влияние физических факторов.
- •42. Методы определения титра антител и их практическое значение.
- •48. Борьба с вирусами с-х животных.
- •49. Лечение вирусных болезней.
- •51. Принципы, техника и практическое значение ртга Настоящие методические указания преднаяначены для серо-
- •59. Феномен гемадсорбции и ее задержки
- •61. Частная вирусология
- •35. Ларинготрахеит кур.
- •36. Оспа кур.
- •37. Ящур.
- •38. Болезнь Ньюкасла.
- •39. Болезнь Тешена.
- •40. Чума плотоядных.
- •41. Парагрипп крс.
- •43. Аденовирус крс.
- •44. Болезнь Марека.
- •45. Болезнь Ауески.
- •46. Чума крс.
- •47. Диарея крс.
- •48. Ринотрахеит крс.
- •49. Бешенство.
- •50. Грипп кур.
- •51. Классическая чума свиней.
- •52. Африканская чума свиней.
- •55. Гастроэнтерит свиней.
- •56. Бронхит кур.
48. Борьба с вирусами с-х животных.
49. Лечение вирусных болезней.
50. ПЦР. Полимера́зная цепна́я реа́кция (ПЦР) — экспериментальный метод молекулярной биологии, позволяющий добиться значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК) в биологическом материале (пробе).
Помимо амплификации ДНК, ПЦР позволяет производить множество других манипуляций с нуклеиновыми кислотами (введение мутаций, сращивание фрагментов ДНК) и широко используется в биологической и медицинской практике, например, для диагностики заболеваний (наследственных, инфекционных), для установления отцовства, для клонирования генов, выделения новых генов. Компоненты реакции
Для проведения ПЦР в простейшем случае требуются следующие компоненты:
ДНК-матрица, содержащая тот участок ДНК, который требуется амплифицировать.
Два праймера, комплементарные противоположным концам разных цепей требуемого фрагмента ДНК.
Термостабильная ДНК-полимераза — фермент, который катализирует реакцию полимеризации ДНК. Полимераза для использования в ПЦР должна сохранять активность при высокой температуре длительное время, поэтому используют ферменты, выделенные из термофилов — Thermus aquaticus (Taq-полимераза),Pyrococcus furiosus (Pfu-полимераза), Pyrococcus woesei (Pwo-полимераза) и другие.
Дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (dATP, dGTP, dCTP, dTTP).
Ионы Mg2+, необходимые для работы полимеразы.
Буферный раствор, обеспечивающий необходимые условия реакции — рН, ионную силу раствора. Содержит соли, бычий сывороточный альбумин.
ПЦР дает возможность существенно ускорить и облегчить диагностику наследственных и вирусных заболеваний. Нужный ген амплифицируют с помощью ПЦР с использованием соответствующих праймеров, а затем секвенируют для определения мутаций. Вирусные инфекции можно обнаруживать сразу после заражения, за недели или месяцы до того, как проявятся симптомы заболевания
51. Принципы, техника и практическое значение ртга Настоящие методические указания преднаяначены для серо-
логического контроля напряженности иммунитета к ньюкаслской бо-
лезни (НБ), оценки эффективности иммунизации, определения опти-
мальных сроков вакцинации (ревакцинации) птицы, а также для конт-
роля эпизоотической ситуации по НБ в хозяйствах.
1.2. Методика основана на обнаружении в сыворотке крови спе-
цифических к вирусу НБ антигел (антигемагглютининов) в реакции
торможения гемагглютинации.
1.3. Сроки серологического обследования поголовья определены
Наставлениями по применению вакцин против НБ и могут быть скор-
рекитированы, исходя из эпизоотической ситуации в конкретном хо-
зяйстве.
1.4. Исследованию подлежат не менее 25 проб сывороток крови
от птиц, взятых из различных мест птичника (зала) в объеме не ме-
нее 0,5 см(3).
1.5. Результаты каждого серологического исследования должны
быть зарегистрированы в специальном журнале и проанализированы
ветеринарным врачом хозяйства.
Для постановки РГА готовят двукратные разведения вакцинного
вируса от 1:2 до 1:4096. С этой целью во все лунки одного ряда
полистероловой микропанели микротитратором разливают физиологи-
ческий раствор (0,05 или О,25 см3), в первую вносят в равном
объеме вакцинный вирус трехкратно пипетируюти и переносят 0,05 или
0,025 см3 во вторую лунку и т.д. Из последней лунки 0,05 или
0,025 см3 удаляюти обезвреживают в 2%-ном растворе едкого натрия.
После разведения вируса во все лунки вносят 0,7%-ную суспен-
зию эритроцитов петуха в объеме, равном исходному объему физиоло-
гического раствора. Микропанели аккуратно встряхивают и оставляют
при команатной температуре (18-20*С). Учет реакции проводят после
оседания эритроцитов в контроле.
Для контроля эритроцитов на спонтанную гемагглютинацию оп-
ределения времени учета реакции в две лунки с физиологическим
растворам (0,05 или 0,025 см3) добавляют равный объем эритроцитов.
РГА оценивают положительно при оcедании эритроцитов в виде
хорошо выраженного "зонтика", отрицательно - в виде "пуговки". За
титр вируса принимают его наибольшее разведение, дающее четко вы-
раженную агглютинацию в виде "зонтика". Получение нечетких ре-
зультатов может быть связано с изменившимся рН физиологического
раствора.
52. РН Реакция нейтрализации основана на способности специфических вируснейтрализующих антител блокировать инфекционные, гемагглютинирующие, гемадсорбирующие, цитопатические, бляшкообразующие и др. свойства вирусов.Она применяется в двух направлениях:1) для идентификации вирусов;2) для серодиагностики вирусных инфекций, т.е. для определения нарастания титра вируснейтрализующих антител в «парных» сыворотках.Компоненты:1. Исследуемый вирус (при идентификации выделенною вируса) или исследуемая сыворотка (при серодиагностике инфекции).2. Диагностическая (группе-, видо-, типоспецифическая) сыворотка (при идентификации вируса) или известный вирус — диагностикум (при серодиагностике).3. Индикаторный объект: животные, куриные эмбрионы, культуры тканей или эритроциты.
Реакции нейтрализации т У!УО ставят в культурах клеток, куриных эмбрионах и на лабораторных животных.
Принцип. Смесью вирус (исследуемый или известный) + сыворотка (диагностическая или исследуемая), выдержанной в течение определенного времени, заражают культуру клеток, куриный эмбрион или лабораторное животное. При (+} реакции, т.е. при нейтрализации вируса антителами индикаторные объекты продолжают нормально существовать, а в контроле — гибель или характерные изменения.
Реакция нейтрализации — реакция торможения гемагглютинации (РТГА).
РТГА применяется:-для серотипирования вирусов;-для серодиагностики инфекций.Выделяют два способа постановки:- капельный способ на стекле (ориентировочная реакция), применяется для серо копирования вирусов;- развернутый в пробирках.
Механизм. У некоторых вирусов (например, гриппа) есть гемагглютинин, вызывающий агглютинацию эритроцитов различных животных, в зависимости от вида вируса. При наличии в сыворотке антител — антигемагглютининов наблюдаются инги-бирования активности вирусов.РТГА.Цель: серотипирование вируса гриппа А
Компоненты:1. Исследуемый материал — аллантоисная жидкость куриного эмбриона,2. Диагностические противогриппозные типоспецифиче-ские сыворотки,3. 5 % взвесь куриных эритроцитов.4. Физиологический раствор.
Реакция ставится на стекле капельным способом. На стекло наносят по 1 капле диагностических сывороток и исследуемого материала, перемешивают, затем добавляют 1 каплю взвеси эритроцитов. При положительной реакции наблюдается гомогенное покраснение, а при отрицательной выпадение хлопьев красного цвета (гемагглютинация).
54. РДП Принцип реакции диффузной преципитации (РДП) в агаре заключается в том, что одноименные специфические антиген и антитело, помещенные на определенном расстоянии друг от друга в агаровом геле, диффундируют и образуют при встрече друг с другом преципитат в виде белых полос. В случае несоответствия антигена и антитела полосы преципитации не появляются. Для воспроизводства феномена диффузной преципитации всегда необходимы следующие ингредиенты: антигены, сыворотки, агаровый гель.Методика постановки РДП в геле состоит в том, что в слое агарового геля делают несколько углублений (лунок) и в них наливают антигены и сыворотки, так, чтобы разные компоненты были в соседних лунках. Из лунок антигены и антисыворотки начинают диффундировать в слой геля. Реакция может быть поставлена в чашках Петри или на предметных стеклах во влажной камере. Предварительный учет результатов РДП производят через 8-10ч., основной- через 24ч. И окончательный- через 48-72ч. Высушить и окрасить, что позволяет их сохранять неопределенно долго и улучшает возможность фотографировать полосы преципитации.Данная реакция характеризуется простой техникой постановки, быстрым получением ответа, нетребовательностью к чистоте компонентов и стерильной работе, минимальной потребностью в компонентах, пригодностью для работы с любыми растворимыми антигенами и возможностью документирования результата путем фотографирования. К недостаткам следует отнести ее низкую чувствительность.
55. РИФ Реакция иммунофлюоресценции (РИФ) — это метод, с помощью которого можно выявить антитела к известным антигенам. Метод основан на микроскопии окрашенных специальным образом мазков и других образцов тканей. Применяется в основном для обнаружения возбудителей инфекций мочеполовых путей, таких как хламидии, микоплазмы, трихомонады, гонококки, вирус герпеса и пр.
Существует два типа реакции иммунофлюоресценции — прямая и непрямая.
Прямая иммунофлюоресценция (ПИФ) — в этом случае непосредственно специфическое антитело мечено флюорохромом и реакция проходит в один этап, что значительно сокращает сроки исследования.
Непрямая иммунофлюоресценция (РНИФ) — в этом случае специфическое антитело не имеет метки, а для выявления комплекса антиген-антитело, образовавшегося на первом этапе, используют вторые меченые антитела, специфичные к конкретным антителам.
Материалом для исследования служат мазки. Техника взятия мазков не представляет опасности для здоровья и является безболезненной. Реакцию оценивают с помощью люминисцентного микроскопа. Если тестируемые возбудители присутствуют, то они светятся, как светлячки в объективе микроскопа.
56. ИФА Так же, как РИФ, иммуноферментный анализ проводится в прямом и непрямом вариантах, но, в отличие от нее, используется твердофазная модификация постановки ИФА в лунках полистироловых планшет (твердая фаза), в которых сорбируются (лат. sorbere - поглощать) антитела. При этом чаще используется непрямой вариант ИФА: 1) в лунки на 30 мин при температуре 37 °С вносится содержащий вирус материал; 2) к образовавшемуся имму но комплексу на 30 мин при той же температуре добавляют антивидовой пероксидазный иммуноконьюгат; 3) для выявления образования тройного иммунопероксидазного комплекса в лунки на 10 мин вносят ортофенилендиамин с Н202 как хромогенный субстрат для пероксидазы. Результаты твердофазной модификации ИФА, которые в положительных случаях проявляются пожелтением, учитываются с помощью специального спектрофотометра. РИА. Для проведения радиоиммунного анализа чаще всего используется конкурентный метод.
57. РСК Реакция связывания комплемента (РСК) за ключается в том, что при соответствии друг другу антигены и антитела образуют иммун ный комплекс, к которому через Fc-фрагмент антител присоединяется комплемент (С), т. е. происходит связывание комплемента комп лексом антиген—антитело. Если же комплекс антиген—антитело не образуется, то комп лемент остается свободным. Специфическое взаимодействие АГ и AT сопровождается адсорб цией (связыванием) комплемента. Поскольку процесс связыва ния комплемента не проявляется визуально, Ж. Борде и О. Жангу предложили использовать в качестве индикатора гемолитическую систему (эритроциты барана + гемолитическая сыворотка), кото рая показывает, фиксирован ли комплемент комплексом АГ-АТ. Если АГ и AT соответствуют друг другу, т. е. образовался иммунный комплекс, то комплемент связывается этим комплексом и гемоли за не происходит. ЕслиAT не соответствует АГ, то комплекс не образуется и комплемент, оставаясь свободным, соединяется со второй системой и вызывает гемолиз.Компоненты. Реакция связывания комплемента (РСК) относится к слож ным серологическим реакциям. Для ее проведения необходимы 5 ингредиентов, а именно: АГ, AT и комплемент (первая система), эритроциты барана и гемолитическая сыворотка (вторая система). Антигеном для РСК могут быть культуры различных убитых микроорганизмов, их лизаты, компоненты бактерий, патологи чески измененных и нормальных органов, тканевых липидов, ви русы и вирусосодержащие материалы.В качестве комплемента используют свежую или сухую сыво ротку морской свинки.Механизм. РСК проводят в две фазы: 1-я фаза — инкубация смеси, содержащей три компонента антиген + антитело + комплемент; 2-я фаза (инди каторная) — выявление в смеси свободного комплемента путем добавления к ней гемоли тической системы, состоящей из эритроцитов барана, и гемолитической сыворотки, содер жащей антитела к ним. В 1-й фазе реакции при образовании комплекса антиген—антите ло происходит связывание им комплемента, и тогда во 2-й фазе гемолиз сенсибилизирован ных антителами эритроцитов не произойдет; реакция положительная. Если антиген и ан титело не соответствуют друг другу (в иссле дуемом образце нет антигена или антитела), комплемент остается свободным и во 2-й фазе присоединится к комплексу эритроцит — антиэритроцитарное антитело, вызывая гемо лиз; реакция отрицательная. Применение. РСК применяют для диагностики многих инфекционных болезней, в частности сифи лиса (реакция Вассермана).
58. Антитела и их роль в противовирусном иммунитете Нейтрализация вируса антителами препятствует прикреплению вируса к клетке и проникновению его внутрь (эффект усиливается в присутствии комплемента, кофактора и антиидиотипических антител, появляющихся на поздних стадиях инфекционного процесса) и связывают иммуноглобулиновые эпитопы иммунного комплекса, состоящего из вирусных частиц и антител. Иммунный комплекс связывается с Fc-рецептором макрофага с последующим его фагоцитозом и лизисом вируса. С помощью антител происходит опсонизация вируса, способствующая его фагоцитозу. Вируснейтрализующие антитела действуют непосредственно на вирус, находящийся во внеклеточном пространстве (при распространении из одной клетки в другую). Однако ряд вирусов (в том числе вирусы герпеса, ветряной оспы, цитомегалии) модифицируют антигены клеточных мембран и отпочковываются от них в виде инфекционных частиц, способных распространяться на соседние клетки, не встретившись с антителами (перемещаются по цитоплазматическим мостикам без контакта с циркулирующими антителами). В этом случае основную роль в защите играют клеточные механизмы, связанные с действием цитотоксических Т-лимфоцитов, Т-эффекторов и макрофагов. О преимущественном значении клеточного иммунитета при этих инфекциях свидетельствует тот факт, что дети с врожденным Т-клеточным иммунодефицитом не могут с ними справиться, а пациенты с дефицитом иммуноглобулинов, но с нормально функционирующей системой клеточного иммунитета, выздоравливают.