5. Молекулярно-генетический период.

Задачи:

21. Культивирование бактерий in vitro. Требования к условиям культивирования. Питательные среды, их классификация. Требования, предъявляемые к питательным средам

Культивирование бактерий в системах in vitro осуществляется на питательных средах. Оно может быть периодическим и непрерывным.

Условия культивирования бактерий:

1.Наличие полноценной питательной среды. (см. ниже требования к питательным средам)

2.Температура культивирования. Температура влияет на скорость размножения. Для поддержания требуемой температуры используют термостаты.

3.Атмосфера культивирования.

4.Время культивирования зависит от времени генерации. Большинство бактерий культивируют до получения видимого роста в течение 18-48 ч. Для культивирования возбудителя коклюша требуется 5 суток, для культивирования M. tuberculosis – 3-4 недели.

5.Освещение. Для выращивания фототрофных бактерий необходим свет. Некоторые условнопатогенные микобактерии в зависимости от освещенности образуют пигмент, что используется для их идентификации.

Для роста и размножения строгих аэробов необходим кислород. Аэробы хорошо растут на поверхности агара на чашках Петри или в тонком верхнем слое жидкой среды; для роста в глубинных слоях необходимо диффузное распределение кислорода по всему объему питательной среды. Это достигается непрерывным перемешиванием или встряхиванием – аэрирование (на специальных аппаратах – встряхиватели).

Для культивирования факультативных анаэробов используют те же методы, однако в присутствии кислорода у них будет преобладать оксидативный метаболизм над ферментацией.

Микроаэрофилы размножаются при пониженном парциальном давлении кислорода; достигается за счет повышения парциального давления СО2 до 1-5% в атмосфере культивирования против 0,3% в атмосфере воздуха. Также используют специальные СО2-инкубаторы или посевы помещают в эксикаторы с горящей свечой (атмосфера 80% N2, 2-3% O2, 10-20% CO2).

Облигатные анаэробы требуют полного отсутствия кислорода.

●Добавлением к питательным средам редуцирующих кислород веществ: тиогликолевой и аскорбиновой кислот, цистеина, сульфидов;

●Кипячением жидких сред и плотное закупориванием сосудов резиновыми пробками;

●Использованием поглотителей кислорода, щелочного пирогаллола, и помещением в герметически закрытые емкости газ-паки (для аэротолерантных бактерий);

●Механическим удалением кислорода воздуха с последующим заполнением емкости инертным газом (используют анаэростаты и анаэробные боксы).

Для хемо- и фотоавтотрофных бактерий создается атмосфера, насыщенная СО2. Исторический метод

– биологический по Фортнеру: чашку с агаром засевают культурами аэробов и анаэробов, между ними вырезают канавку и герметично закрывают, аэробы потребляют О2, снижая его концентрацию. Также используют регенерацию среды и заливку ее вазелиновым маслом: среды в пробирках плавят на водяной бане, дают остыть до 45-50 оС, делают посев, затем быстро охлаждают и заливают маслом.

Культивирования абсолютных внутриклеточных паразитов, бактерий, относящихся к родам Rickettsia, Ehrlichia, Coxiella, Chlamydia, осуществляют на культурах клеток, в организме животных и членистоногих, в куриных эмбрионах (кроме эрлихий). Куриные эмбрионы используют также для культивирования бактерий, обладающих высоким уровнем гетеротрофности, например родов Borrelia,

Legionella.

Требования к питательным средам:

1.Наличие воды, так как все процессы жизнедеятельности бактерий протекают в воде;

2.Наличие органического источника углерода и энергии: углеводы, АК, органические кислоты, липиды; наибольшим энергетическим потенциалом обладает глюкоза, так как она непосредственно подвергается расщеплению с образованием АТФ и ингредиентов для биосинтеза; часто для этого используется пептон – продукт неполного гидролиза белков;

3.Наличие источников азота, серы, фосфатов и других минеральных веществ для синтеза белков, нуклеотидов, АТФ, коферментов. В качестве источников азота используют пептон, соли аммония. В качестве источников серы и фосфора – сульфаты и фосфаты. Для нормального функционирования ферментов необходимы ионы Ca2+, Mg2+, Mn2+, Fe2+, которые добавляются в виде солей (чаще фосфатов);

4.Определенный pH среды для предотвращения гибели микроорганизмов от собственных продуктов обмена;

5.Определенное осмотическое давление. Большинство бактерий растет на изотоничных средах (добавление NaCl 0,87%); некоторые растут при концентрации раствор не менее 1% (галофильные бактерии); бактерии, лишенные клеточной стенки, могут расти на средах с гипертоническим раствором, обычно сахарозы. При необходимости добавляют факторы роста, ингибиторы роста определенных бактерий, субстраты для действия ферментов, индикаторы;

6.Оптимальный окислительно-восстановительный потенциал;

7.Стерильность.

Классификация

I. В зависимости от консистенции: жидкие, полужидкие, плотные, сыпучие. Плотность достигается добавлением агара – полисахарид, получаемый из водорослей; плавится при температуре 100 оС, остывает при температуре 45-59 оС; добавляется в концентрации 0,5% для полужидких сред и 1,5-2% для плотных сред.

II. В зависимости от природы: синтетические, полусинтетические, натуральные (молоко, сыворотка крови, солодовое сусло, овощные соки, асцитическая жидкость, «косяки» из овощей).

III.В зависимости от состава:

●Простые: пептонная вода, питательный бульон, мясопептонный агар;

●Сложные: сахарный и сывороточный бульоны, кровяной агар.

IV. В зависимости от назначения среды:

Общие пригодны для выращивания многих видов микроорганизмов и могут применяться в качестве основы для приготовления специальных питательных сред. К ним относятся, например, мясо-пептонный бульон, мясо-пептонный агар, сусло жидкое, сусло-агар и др.

Специальные питательные среды предназначены для избирательного культивирования определенных видов микроорганизмов, изучения их свойств и хранения. К ним относятся:

●Элективные – применяются для выделения микроорганизмов из мест их естественного обитания или для поучения накопительных культур. Эти среды обеспечивают преимущественное развитие одного вида или группы микроорганизмов. Избирательность питательной среды для определенных видов микроорганизмов достигается путем создания оптимальных для них условий (рН, Eh, концентрация солей, состав питательных веществ), т.е. положительной селекцией, или путем добавления в среду веществ, угнетающих другие микроорганизмы (желчь, азид натрия, теллурит калия, антибиотики и др.), т.е. отрицательной селекцией. Сопутствующие микроорганизмы или совсем не растут на таких средах, или развитие их в значительной степени задерживается. Например, щелочной агар с pH 9,0 для выделения холерного вибриона;

●Среды обогащения – стимулируют рост какого-то определенного м/о, подавляя рост других; например, среда с селенитом натрия для бактерий рода Salmonella, ингибирует рост кишечной палочки;

●Дифференциально-диагностические – для изучения ферментативной активности бактерий и дифференцировки одного вида (рода) от другого; состоят из простой питательной среды с добавлением субстрата, на который должен подействовать фермент, и индикатора, меняющего свой цвет в результате ферментативного превращения субстрата; например, среды Гисса для изучения способности бактерий ферментировать сахара, Клиглера среда – ферментация сахаров и продукция сероводорода;

●Комбинированные среды (элективно-дифференциальные) сочетают элективную среду, подавляющую рост сопутствующей флоры, и дифференциальную среду, диагностирующую ферментативную активность выделяемого микроба. Например, среда Плоскирева и висмутсульфитный агар, ингибирующие рост кишечной палочки.

●Транспортные среды – для культивирования, изоляции, идентификации, хранения (например, тиогликолевая среда, которая предназначена для транспортировки испражнений и ректальных тампонов для исследования на кампилобактериоз).

Примеры сред

Среда Эндо

Дифференциально-диагностическая Консистенция: плотная.

Назначение: выделение представителей семейства Enterobacteriaceae и других нетребовательных грамотрицательных бактерий, а также изучение их отноше­ния к лактозе Состав: Основа – МПА. Диф.фактор – лактоза. Индикатор – основной фуксин, обесцвеченный сульфитом натрия

Исходный цвет среды: светло-розовый.

Характер роста: кишечная палочка (Escherichia coli) расщепляет лактозу до му­равьиной кислоты, которая реагирует с индикатором с образованием малиново­го соединения. У многих штаммов E. coli продукт взаимодействия индикатора и кислоты пропитывает колонии, прида­вая им характерный «металлический» блеск. Бактерии, не способные расщеплять лактозу (Shigella spp., Salmonella spp.) растут в форме бледных колоний, окрашенных в цвет среды

Среда Плоскирева

Селективная, дифференциально-диагностическая Консистенция: плотная.

Назначение: выделение Salmonella spp. и Shigella spp.

Состав:Основа – МПА. Элективный фактор – желчные соли, бриллиантовый зеленый, йод. Диф.фактор – лактоза. Индикатор – нейтральный красный Исходный цвет среды: оранжевый.

Характер роста: рост E. coli несколько подавляют желчные соли (элективное действие). Она расщепляет лактозу до кислоты, благодаря реакции индикатора колонии E. coli и среда вокруг них окрашиваются в красный цвет. Шигеллы и сальмонеллы устойчивы к желчным солям, их рост более обильный, чем у E. coli. Ни шигеллы, ни сальмонеллы не расщепляют лактозу, поэтому их колонии желтоватого цвета. Гипосульфит натрия, бриллиантовый зеленый и йод подавляют рост грамположительных бактерий.

Солевой агар

Элективная среда Консистенция: плотная.

Назначение: выделение стафилококков.

Состав:. Основа – МПА. Элективный фактор – соль 10%. Индикатор – нет Характер роста: стафилококки устойчивы к высоким концентрациям соли, поэтому они способны расти

на данной среде. Многие другие микроорганизмы, например E. coli, не растут при данной концентрации NaCl (элективное действие).

Желточно-солевой агар (Чистовича)

Элективная, диагностическая Консистенция: плотная.

Назначение: выделение и дифференциа­ция стафилококков.

Состав: Основа – МПА. Элективный фактор – соль 10%. Диф.фактор – желточная эмульсия (лецитин). Индикатор – нет

Характер роста: Staphylococcus aureus образует округлые колонии золотистого цвета, окруженные мутнорадужным ореолом продуктов гидролиза лецитина (этот вид расщепляет лецитин). Другие стафилококки лецитин не расщепляют. S. epidermidis образует белый пигмент, а колонии S. saprophyticus лишены пигмента, бледные.

Тетратионатная среда Мюллера-Кауфмана (селенитовый бульон)

Среда обогащения Консистенция: жидкая.

Среда предназначена для селективного обогащения при выявлении бактерий рода Salmonella

Состав: Основа – МПБ. Элективный фактор – соль селинистой кислоты (селенит натрия). Индикатор – нет Характер роста: сальмонеллы устойчивы к действию селенита, поэтому на данной среде они проявляют

диффузный рост. Многие другие микроорганизмы, включая E. coli, чувствительны к селениту, поэтом не способны расти в его присутствии.

Солевой бульон

Элективная среда Консистенция: жидкая.

Назначение: выделение стафилококков.

Состав: Основа – МПБ. Элективный фактор – 6.5% NaCl. Индикатор – нет Рост микроорганизмов, устойчивых к соли

Среда М9

Минимальная (синтетическая) среда Консистенция: жидкая.

Назначение: культивирование штаммов E. coli в генетических исследованиях.

Состав: глюкоза (0,4%) и смесь минеральных солей (NaCl, Na2HPO4, NH4Cl, KH2PO4, CaCl2, MgSO4).

Характер роста: прототрофные штаммы E. coli растут в форме диффузного помутнения; ауксотрофные штаммы (E. coli DH5α) не способны к росту на среде M9 без добавок необходимых для них веществ. Штамм E. coli DH5α нуждается в тиамине, а типичные штаммы E. coli синтезируют тиамин самостоятельно.

Питательные среды для строгих анаэробов

Питательная		Компоненты	Состав
среда
Среда		Питательная	Питательный		агар	на	основе
Вейнберга		основа	ферментативного		перевара		бычьего
(полужидкая)			сердца
		Дыхательный	Глюкоза (0,2%)
		(энергетический)
		субстрат
		Редуцирующий	Отсутствует
		фактор
Среда	Китт-	Питательная	Перевар Хоттингера - основа различных
Тароцци		основа	сред, представляющая собой бульон с
(полужидкая)			аминокислотами		и		пептидами,
			полученный	путем		переваривания
			мясного фарша ферментами из препарата
			поджелудочной		железы		крупного
			рогатого скота (панкреатин)
		Дыхательный	Глюкоза (0,5%)
		(энергетический)
		субстрат
		Редуцирующий	Кусочек мяса или печени
		фактор

			Рост бактерий	Cl. botulinum в толще среды формирует
				колонии в форме зерен чечевицы или
				комочков ваты с уплотнением в центре
				(некоторые типы ферментируют кусочки
				мяса); похоже растут Cl. perfringens и Cl.
				tetani, но они не плавят кусочки мяса
	Среда		Питательная	Щелочной питательный агар
	Вильсона-Блэр		основа
	для клостридий
			Дыхательный	Глюкоза (1%)
	(плотная)
			(энергетический)
			субстрат
			Редуцирующий	Na2SO3 или отсутствует
			фактор
			Дифференциальн	Na2SO4(3)+FeCl2
			ый фактор
			Рост бактерий	Cl. perfringens растет в нижней 1/3 среды
				в виде округлых черных колоний (цвет
				обусловлен	сульфидом			железа),
				осуществляет «сульфатное дыхание»
	Тиогликолевая		Питательная	Питательный	агар	с	гидролизатом
	среда		основа	казеина, дрожжевым экстрактом и
	[среда	для		цистином
	контроля
			Дыхательный	Глюкоза
	стерильности,
			(энергетический)
	СКС]
			субстрат
	(полужидкая)
			Редуцирующий	Тиогликолят натрия
			фактор
			Рост бактерий	Колонии анаэробов		формируются в
				нижней 1/3 среды, имеют различную
				форму в зависимости от конкретного м/о
	Сахарно-		Питательная	Мясо-пептонный агар			с	15% крови
	кровяной	агар	основа	(лошадиной и бараньей)
	Цейсслера
			Дыхательный	Глюкоза (2%)
	(плотная)
			(энергетический)
			субстрат
			Редуцирующий	Гемоглобин
			фактор