Заключение

Идея метаболической поддержки печени с использованием ксеногенных ГЦ при ОТП имеет глубокое экспериментальное обоснование [88] и в настоящее время с успехом реализуется в клинике [57, 215, 260, 261].

В настоящее время установлено включение ГЦ, перенесенных в систему воротной вены либо непосредственно в печень, в метаболические процессы поврежденного органа. Между тем, и подкожная трансплантация паренхиматозных клеток печени, известная под названием «подкожного клеточного диализа», способствует коррекции ОПН; при этом исключается органная миграция трансплантированного материала, поскольку дерма и поверхностная фасция выполняют роль биологических полупроницаемых мембран [200]. Механизмы саногенеза при подкожном расположении перенесенных ГЦ неясны окончательно до настоящего времени. Это явилось одним из побудительных мотивов обсуждаемого исследования. Другим обстоятельством оказалось преимущество использования эмбриональной ткани печени в связи с низкой иммуногенностью и мощным пролиферативным потенциалом клеток плода [184, 223, 224], обладающим к тому же относительно высокой резистентностью к повреждениям при холодовой консервации [76].

Характеризуя ткани зародыша, мы отдаем предпочтение термину «эмбриональные», а не «фетальные», подчеркивая, что речь идет о внутриутробном развитии плода на протяжении первых 8 недель, в течение которых преобладают процессы формирования основ организации и закладки органов [74].

Гипотетически применение эмбриональных ГЦ для коррекции ОПН более эффективно, чем клеток зрелой печени; но предполагаемые механизмы воздействия включают не только протезирование функций печени, но и влияние введенных с культурой биологически активных веществ [102].

Объектом исследования были выбраны эмбриональные (8-10 недель гестации) клетки печени свиньи, поскольку именно свиные ГЦ нашли применение в клинической коррекции ОПН [18, 45]. В то же время хорошо отработана оценка эффективности ТГЦ на модели ЧХУ-индуцированной ОПН на крысах [68]. Подчеркнем, что во всех реферированных работах речь идет об использовании именно паренхиматозных клетках печени.

В соответствии с задачами исследования, предстояло отработать методику получения и криоконсервации ККП; для оценки эффективности были использованы известные критерии – жизнеспособность и относительное количество полученного материала. В результате комбинации приемов выделения ГЦ из зрелой печени и обработки эмбриональной ткани , была модифицирована технология смешанной дезагрегации ткани эмбриональной печени, дополненная нами полифокальным интрапаренхиматозным введением раствора коллагеназы с последующей механической сепарацией стромальных элементов вручную под контролем зрения. Добивались получения не изолированных ГЦ, а микрофрагментов, содержащих ассоциации до 10 ГЦ и непаренхиматозных клеток. Основанием для этого явились сообщения о необходимости поддержания «микроэкологии печени», а именно кооперации ГЦ, различных типов непаренхиматозных клеток и компонентов внеклеточного матрикса [104].

В результате из 1 г ткани печени удалось получить 10,3±0,2х10⁸ клеток с жизнеспособностью 91,7±1,1%, что существенно (p<0,0001) выше, чем при использовании классической методики M.N. Berry (1961) и методики С.С. Лаврика (1990), разработанной для эмбриональной ткани.

Состав клеточной суспензии был представлен эмбриональными гепатоцитами полигональной формы, которые располагались большей частью группами по 2-4 клетки, неэпителиальными клетками и клеточным детритом.

Для улучшения результатов культивации ККП предпринята серия экспериментов с составом среды. Нами обнаружена прямая тесная корреляция (r=+0,71; p<0,05) между жизнеспособностью культуры и закислением среды для культивации. В дальнейшем установлено, что при исходных значениях рН рабочих растворов 7,6-7,8 их закисление менее выражено, чем при более низких значениях рН, в том числе, при стандартном содержании Н⁺ в средах фабричного изготовления (рН 7,2 для RPMI, среды 199 и раствора Хенкса). Поскольку рН ткани печени в норме составляет 7,4 , при инкубации ККП ориентировались на этот физиологический показатель. Нами установлено, что наивысшая жизнеспособность культуры при кратковременной инкубации достигается при рН исходного раствора 7,6 с учетом закономерного снижения этого показателя при добавлении клеточной взвеси.

Количество клеток, получаемых по разработанной методике из 1 г ткани после центрифугирования в прерывистом фиколловом градиенте, оказалось ниже, чем описано в литературе: 8,8±0,6 х 10⁶ против 1,92 х 10⁷ по данным S.E. Raper (1995) [205], однако жизнеспособность материала была выше: 98,7±0,2% против 93%. Продолжительность культивации полученных клеточных микроассоциаций была определена с учетом работы S. Naik et al. (1996) [184], показавших, что пик пролиферативной активности и детоксикационных свойств культивируемых ГЦ приходится на 5 сутки. Прирост клеточной массы в процессе культивации (135 х 10⁶ против 40 х 10⁶ клеток, засеянных во флакон) был ожидаемым согласно литературным данным.

Нами разработана среда для криоконсервации ККП. Поводом послужила низкая жизнеспособность клеток при использовании известных составов, предложенных М.С. Маргулисом (1992) [45] и С.С. Лавриком (1990) [36]. В качестве криопротектора был выбран поливинилпирролидон - внеклеточный консервант, апробированный для холодового сохранения клеток крови и мышиных эмбрионов [9, 28]. В серии экспериментов in vitro было обосновано включение в состав среды калия оротата, а также использован 1% раствор альбумина человеческого, нашедший применение для консервации клеток чувствительных к холодовому повреждению. [26, 28, 35].

В результате двух- и шестимесячной криоконсервации в жидком азоте получали культуру ЭКП с жизнеспособностью 89,6±1,3 и 86,7±0,9 соответственно (р=0,089), что было существенно (p< 0,0001) выше, чем при использовании вышеназванных сред. Культура содержала микроассоциации (4-10) ГЦ и непаренхиматозных клеток. Дополнительным преимуществом использования разработанной среды было отсутствие необходимости элиминации консерванта, поскольку и поливинилпирролидон (средство для детоксикации), и калия оротат (протектор ишемии) обладают полезными для коррекции ОПН фармакологическими свойствами, а среда оказывается обогащенной регуляторными метаболитами – факторами роста, продуцируемыми непаренхиматозными клетками [85, 129, 192].

 

Количество вводимых клеток – 2 х 106 - было стандартным, а способ введения (инъекция в подкожную клетчатку) исключал миграцию материала в портальную систему.

Результаты исследования свидетельствовали о выраженном положительном эффекте ксенотрансплантации ККП.

В первой серии экспериментов нами проведено сравнительное исследование летальности в динамике индуцированной ОПН. Животных вводили в эксперимент через сутки после ОТП ЧХУ, поскольку по данным литературы элиминация этого вещества из организма происходит, в среднем, через 19 часов [20].

Существенные различия в летальности определены лишь на 3 сутки эксперимента, что свидетельствует об отсроченном эффекте пересадки ЭКП. Максимальными различия в летальности оказывались на 4-е сутки эксперимента. При этом в группах контроля этот показатель приближался к 100%, а в основной группе составил 36,7%.

Таким образом, подкожная ксенотрансплантация криоконсервированной свиной культуры ЭКП крысам с ССl4 – индуцированной ОПН вызывает эффекты, которых не наблюдается при введении плацебо (физиологический раствор), питательной среды и органонеспецифической гормонально активной ткани (плацента).

Каковы же саногенные механизмы? Протекторные или регенераторные механизмы оказываются доминирующим? Для ответа на эти вопросы были предприняты дальнейшие исследования. В следующей серии экспериментов была проведена лабораторная оценка некоторых показателей гомеостаза, закономерно изменяющихся при ОПН.

При сравнительной оценке белково-синтетической функции печени (концентрация альбумина и фибриногена в сыворотке крови) установлена ее активация к 4 суткам с последующей нормализацией. В контроле наблюдали закономерное угнетение продукции исследованных белков.

Обмен липидов, особенно страдающий при интоксикации ЧХУ, был угнетен в начале эксперимента. В дальнейшем концентрация холестерина нарастала до нормальных значений и вновь снижалась к 6 суткам, что свидетельствовало о преходящей стимуляции липидного обмена под воздействием ксенотрансплантации ЭКП.

Пигментный обмен, грубо нарушенный на вторые сутки исследования, впоследствии нормализовался под влиянием пересадки ККП.

Цитолитический синдром, ярко выраженный вначале эксперимента, существенно уменьшался к шестым суткам, что проявлялось монотонным снижением активности аминотрансфераз в сыворотке крови животных основной группы до нормальных (гипернормальных для АСТ) величин.

Исследование некоторых показателей коагуляционного (вязкость крови, концентрация фибриногена) и тромбоцитарного (агрегация тромбоцитов) гемостаза демонстрировало нормализацию системы свертывания крови к шестым суткам эксперимента. Выделим динамику гематокрита; этот показатель оставался высоким на протяжении всего срока исследования при снижении в группах контроля. Наша интерпретация этого феномена будет сделана в дальнейшем изложении.

В дальнейшем нами проведена серия морфологических исследований для уточнения механизмов воздействия КТ культуры ЭКП на развитие ОТП. Установлено, что перенесенные клетки частично сохраняются в зоне КТ к шестым суткам эксперимента; воспалительная перифокальная реакция отсутствует или не выражена. Структура трансплантата соответствует описаниям аутотрансплантата селезенки [5].

Это свидетельствует о низкой иммуногенности свиных эмбриональных клеток и является основанием для применения их в клинической практике.

Исследование структуры ГЦ у животных основной и контрольных групп на 2 сутки эксперимента выявили сходные повреждения, характерные для ОТП. Проведенное морфометрическое исследование показало картину воспаления: среднее значение площади ядра достоверно увеличивается у животных всех групп (р<0,05). Средняя площадь цитоплазмы в клетках животных основной и контрольных групп достоверно увеличивается по сравнению с нормой (р<0,05). Также увеличивается объемная и численная плотность гранулярного эндоплазматического ретикулума в ГЦ печени животных основной и контрольных групп, вследствие расширения, отека и фрагментации. Отмечали увеличение объемной доли митохондрий и снижение их численной плотности во всех группах. Результаты цитофотометрического исследования ядер ГЦ по классам плоидности показали, что введение ЧХУ привело к появлению ядер с разнообразным количеством ДНК. Наметилась тенденция к увеличению гиперплоидных ядер в основной группе и диплоидных ядер в группе контроля. Однако уже на 4 сутки выявлено, что патологический процесс в печени животных основной группы протекает с существенными отличиями от контроля. Отмечается восстановление архитектоники балок и сохранность дольчатого строения печени в основной группе и выраженные деструктивные изменения с признаками прогрессирующей жировой дистрофии в печени контрольных животных. Средняя площадь цитоплазмы у крыс основной группы уменьшается по сравнению со 2 сутками, но немного выше нормы, тогда как в контроле средняя площадь цитоплазмы резко увеличена. Большую часть ядер гепатоцитов в печени животных ОГ составляют тетра- и октаплоидные ядра , при этом средняя площадь ядра также достоверно выше нормы (р=0,008). Эти результаты свидетельствуют об увеличении транскрипционной активности ядер гепатоцитов. Белковосинтетическая активность ГЦ этой группы должна быть на более высоком уровне, поскольку синтез РНК определяется количеством ДНК в клетке. Увеличение среднего объема ядра и количества ДНК, по мнению многих исследователей, направлено на репарацию клеток. Для контрольных животных основной модальный класс был представлен диплоидными гепатоцитами, а гиперплоидные ядра составляли минимальную часть. В основной группе отмечали сохранность структур гранулярного эндоплазматического ретикулума, близкое к нормальному строение митохондрий с сохранными кристами. В контроле профили каналов гранулярного эндоплазматического ретикулума не имеют большой протяженности, расширены, фрагментированы и на большом протяжении лишены рибосом. Форма и объем митохондрий были разнообразны, кристы не просматривались. Относительная площадь митохондрий в гепатоцитах крыс основной группы оказалась существенно выше, чем в контроле, за счет увеличения их количества, что свидетельствует о более высокой функциональной активности. Напротив, относительная плотность эндоплазматического ретикулума в основной группе была достоверно ниже за счет его компактности, что является признаком синтетической и секреторной активности гепатоцитов.

При анализе гистограмм ДНК в основной группе нами выявлено увеличение количества полиплоидных гепатоцитов в 6 раз по сравнению с контролем. Данный факт свидетельствует об усиленном режиме работы паренхимы печени, поскольку является морфологическим выражением функционального напряжения.

При морфологическом исследовании печени животных в динамике, включая сравнительное изучение макроскопических характеристик, массы органа, световую и электронную микроскопию, ультраструктурный морфометрический анализ, установлены признаки двух позитивных процессов – защитного (протекция гепатоцитов при воздействии ЧХУ) и регенераторного (стимуляция пролиферации паренхиматозных клеток печени).

Эффектом протекции можно объяснить уменьшение отека печени, сохранность балочной структуры, уменьшение жировых включений по сравнению с контролем, преобладание неповрежденных ГЦ при световой микроскопии, нормализацию объемной доли гранулярного ЭР и площади цитоплазмы при исследовании ультраструктуры клеток. С другой стороны, увеличение количества митохондрий, площади ядер и увеличение количества ГЦ с октаплоидным набором ДНК свидетельствуют о регенераторных механизмах компенсации ОТП.

Объяснение саногенных механизмов подкожной ксенотрансплантации ККП следует искать, по нашему мнению, в эктопической метаболической активности перенесенных клеток, причем, не только ГЦ, но и непаренхиматозных. Один из ведущих специалистов в области трансплантации ГЦ, профессор S. Gupta, считает, что речь идет о «непрямых» механизмах (из переписки с автором).

В настоящее время известен целый спектр веществ пептидной природы, стимулирующих пролиферацию гепатоцитов – факторы роста [221, 223, 267].

Последними исследованиями показано, что пептиды, стимулирующие регенерацию печени, находятся в ГЦ в неактивной форме (вне зависимости от степени зрелости клетки) и активируются в силу неизвестных пока механизмов в процессе органогенеза или регенерации печени [109].

Доказательством гуморальной стимуляции может служить тот недавно установленный факт, что ГЦ, пересаженные грызунам перед резекцией печени, не обладают более выраженной пролиферативной активностью, чем собственные клетки; но если выполнить ТГЦ после иссечения части печени, перенесенные клетки становятся более активными, чем ГЦ реципиента [228].

Среди известных факторов роста выделяют один – фактор роста гепатоцитов, обладающий наиболее выраженным митогенным эффектом на ГЦ. Ответственными за выработку этого фактора являются клетки Ито, а также эндотелиальные и купферовские клетки печени. Эмбриональная ткань печени содержит большое количество ФРГ и его рецепторов; ГЦ зародыша в первом триместре развития активно отвечают на стимуляцию ФРГ в культуре [267].

Спектр эффектов ФРГ разнообразен. Прежде всего, это модулятор митогенеза ГЦ; показана стимуляция активности других эпителиальных клеток, эндотелия. Воздействие этого фактора обеспечивает рост и регенерацию не только печени, но других органов – почек, легких, кожи. Существуют прямые указания на протекторное воздействие ФРГ на клетки печени при ОТП, индуцированном ЧХУ [146], а также улучшение конъюгации билирубина и транспорта желчи [264].

Кроме стимуляции митогенеза, он способен вызывать миграцию эпителиальных клеток, стимулирует морфогенез [138].

Известны последствия введения ФРГ при трансплантации ГЦ. Оказывается, этот регуляторный пептид стимулирует пролиферацию аллогенных ГЦ, обеспечивая замещение поврежденных клеток реципиента [149].

В последнее время установлено повышение уровня ФРГ в крови после включения донорских клеток в процессы метаболизма [178], обнаружена стимуляция функций пересаженных ГЦ при введении ФРГ [264].

В свете представленных литературных данных механизмы воздействия подкожной ксенотрансплантации культуры ЭКП представляются связанными с продукцией регуляторных пептидов, прежде всего – ФРГ. Тогда становятся объяснимыми преимущества использования культуры эмбриональных клеток с высокой пролиферативной и метаболической активностью, содержащих микроассоциации ГЦ и непаренхиматозных клеток – продуцентов ФРГ. Дополнительным свойством ФРГ является защита ГЦ при холодовом повреждении [239], что обусловливает хорошие результаты криоконсервации ККП на протяжении 6 мес, полученные нами.

Роль непаренхиматозных клеток печени и микроциркуляторного компонента подчеркивается в литературе, как важнейший фактор устойчивости печени к температурному повреждению при криоконсервации [140].

Известно, что при ОПН нарушается экспрессия рецепторов ГЦ к ФРГ c одновременным повышением уровня этого пептида в крови. При этом экзогенный ФРГ не стимулирует пролиферативную активность ГЦ [165].

Вероятно, КТ культуры ЭКП способствует и восстановлению рецепторного аппарата поврежденных ГЦ с последующей стимуляцией регенераторных механизмов, запускаемых ФРГ.

Обсуждая источники восстановления паренхиматозного компартмента печени, укажем на возможность дифференцировки эпителиальных клеток-предшественников других органов (под воздействием факторов специфической микроэкологии печени) в направлении ГЦ, например, панкреатических [92], а также стволовых клеток костного мозга [197].

Этим обстоятельством можно, вероятно, объяснить повышение гематокрита, отмеченное нами на фоне введения ЭКП, поскольку стимуляция костномозгового кроветворения является закономерным следствием воздействия ФРГ [267].

Если в ткани эмбрионального легкого и плаценты ФРГ присутствует в виде неактивной молекулы-предшественника, то в ККП происходит активация этого пептида. В наших экспериментах с ОПН применение ткани плаценты было существенно менее эффективно, чем трансплантация культуры ЭКП. Это может свидетельствовать о необходимости органоспецифического воздействия.

Если активация регенераторных механизмов, отмеченная нами, полностью может быть объяснена эффектами ФРГ, то интерпретация протекторного механизма, обнаруженного в морфологическом разделе настоящей работы, оказалась более сложной. В экспериментах in vitro было установлено, что ФРГ вызывает быструю мобилизацию внутриклеточного Са²⁺ [79].

С другой стороны, важным промежуточным событием при повреждении гепатоцитов ЧХУ является нарастание концентрации Са2+ в цитозоле, предшествующее активации фосфолипазы А₂ с последующей деструкцией клеточной мембраны [206].

Представляется, что защитное воздействие ФРГ может быть реализовано на уровне перераспределения маршрутов Ca2+ в цитозоле, что препятствует разрушению клеточных мембран при активации перекисного окисления липидов. Нами получено морфологическое подтверждение этой гипотезы, а именно - нормализация объемной доли гранулярного ЭР и площади цитоплазмы, установленные при морфометрическим ультраструктурном анализе.

Печень является основным потребителем ФРГ, поэтому портальное введение этого пептида представляется наиболее целесообразным [177].

Подкожное размещение ксеногенного материала, не обеспечивало этого, но отсюда следует, что метаболическая коррекция ОПН, обусловленная введением ККП, должна быть отсроченной. Действительно, мы не наблюдали немедленного эффекта, который наступал к 4 суткам (преимущественно – различия в летальности и морфологии печени) и вполне развивался к 6 суткам.

Таким образом, данные, приведенные в обсуждении полученных результатов, дают основания рассматривать разработанную методику в качестве способа метаболической клеточной коррекции ОПН, стимулирующую протекторные и регенераторные механизмы за счет выработки регуляторных пептидов перенесенной ксеногенной тканью.

Выводы

1. Разработанная технология выделения, культивации и сохранения клеток печени, включающая смешанную диссоциацию печеночной ткани и применение питательной среды оптимизированного состава, позволяет получать ассоциированную культуру гепатоцитов и непаренхиматозных клеток печени с высокой степенью жизнеспособности (86,7± 0,9 %) после длительной (6 мес.) криоконсервации.

1. Ксенотрансплантация криоконсервированной культуры эмбриональных клеток свиной печени обусловливает существенное снижение летальности у крыс с ССl₄-индуцированной острой печеночной недостаточностью.

2. Подкожное введение ксеногенной культуры эмбриональных клеток печени, полученных по разработанной методике, активирует белково-синтетическую функцию поврежденной печени, способствует снижению интенсивности цитолиза и холестаза при остром токсическом повреждении печени.

3. Корригирующее воздействие ксенотрансплантации культуры эмбриональных клеток печени на систему гемостаза при острой печеночной недостаточности проявляется нормализацией показателей тромбоцитарного и коагуляционного звеньев, наступающей после периода гиперкоагуляции.

4. Саногенные механизмы ксенотрансплантации культуры эмбриональных клеток печени включают протекторный и стимулирующий репарацию печени компоненты при остром токсическом повреждении органа. Морфологическим эквивалентом защитного эффекта являются уменьшение отека печени, сохранность балочной структуры с преобладанием неповрежденных гепатоцитов, уменьшение жировых включений, а также нормализация площади цитоплазмы и объема гранулярного эндоплазматического ретикулума гепатоцитов. Проявлениями индуцированной активации внутриклеточных регенераторных процессов оказываются увеличение количества митохондрий и площади ядра гепатоцитов, а также относительное повышение количества клеток с октаплоидным набором ДНК.

5. Воздействие подкожной ксенотрансплантации эмбриональных клеток на поврежденную печень совпадает с эффектами фактора роста гепатоцитов, что обосновывает целесообразность трансплантации культуры, содержащей ассоциации гепатоцитов и непаренхиматозных клеток печени.