2 курс / Микробиология 1 кафедра / Доп. материалы / Патогенез,_диагностика_и_терапия_урогенитального_хламидиоза_Исаков

Глава 1. Характеристика заболеваемости, этиология и патогенез урогенитального хламидиоза

			Таблица 6
	Дифференциальные признаки трех видов хламидий
		(Долгих Т. И., 2000)
	Chlamydia trachomatis	Chlamydia psittaci	Chlamydia pneumoniae
			1. Форма элементарных
	1. Форма элементарных ча	1. Форма элементарных ча	частиц грушевидная, об
			разующаяся за счет расши
	стиц сферическая	стиц сферическая	ренного периплазматиче
			ского пространства
	2. Внутриклеточные коло	2. Микроколонии внутри	2. Внутриклеточные коло
	нии обычно компактные.	клеток менее компактные,
			нии сходны с микроколо
	Хламидии синтезируют	и хламидии часто распола
			ниями С. psittaci, хламидии
	гликоген, который выявля	гаются по всей цитоплазме,	гликогена не образуют
	ется йодной пробой	гликогена не образуют
	3. Хламидии синтезируют	3. Хламидии не синтези	3. Хламидии не синтези
	существенно важных пред	руют предшественников	руют предшественников
	шественников фолиевой	фолиевой кислоты, и их	фолиевой кислоты, к суль
	кислоты, и их рост в кури	рост в куриных эмбрионах	фадиазину нечувствитель
	ных эмбрионах подавляет	не подавляется сульфадиа	ны. В куриных эмбрионах
	ся сульфадиазином	зином	растут плохо
	4. Степень гибридиза	4. Степень гибридиза	4. Степень гибридиза
	ции ДНК со штаммами	ции ДНК со штамма	ции ДНК со штаммами
	C. psittaci, C. pneumoniae не	ми C. trachomatis и C.	C. psittaci и C. trachomatis не
	более 10 %	pneumoniae не более 10 %	более 10 %

хламидий, которые опосредуют прикрепление хламидий к заражаемым клеткам.

Cohenm C. R. (1999, 2000) определяли присутствие главного белка внешней мембраны (МОМР) C. trachomatis в ткани фаллопиевых труб женщин с бесплодием и с хроническим сальпингитом, а также с била теральной окклюзией труб. МОМР был обнаружен в образцах из фал лопиевых труб у 11 из 56 пациентов. Средний титр IgG антител против хламидий был значительно выше у женщин с наличием МОМР, чем у пациентов без этого антигена. Ученые сделали вывод, что присутствие МОМР ассоциировано с хроническим сальпингитом и с трубной ок клюзией. Задачей исследования Monif R. G. (2005) явилось определение

21

Патогенез, диагностика и терапия урогенитального хламидиоза

дискриминационных значений титров к хламидиям в диагностике па тологии труб у больных с бесплодием. Общее количество пациентов составило 2729 женщин с субфертильностью в 23 самостоятельных ис следованиях, которые привели к важному выводу о том, что диагно стическая значимость титров антител к хламидиям методами ELISA, микрофлюоресцентным или иммунофлюоресцентным в диагностике любой трубной патологии вполне сравнима с результатами ГСГ при диагностике трубной окклюзии.

Исследования De Campos D. A. (1997) и Cohenm C. R. (2000) выяви ли токсичность ЛПС клеточной стенки хламидий для сперматозоидов. Оценивая подвижность, жизнеспособность и акросомальную реакцию сперматозоидов, авторы обнаружили спермицидные свойства ЛПС.

В составе хламидий имеется так называемый белок теплового шока (БТШ). Персистирующие формы хламидий способствуют образованию высокоиммуногенного БТШ с мол. массой 60 кДА (HSP 60). По анти генному составу хламидийный БТШ гомологичен БТШ человека. В те чение инфекционного процесса значительно повышается синтез БТШ для защиты от внешних иммунологических защитных механизмов. Иммунный ответ на БТШ организма-хозяина может быть как защит ным, так и патологическим. Есть мнение, что образующиеся в орга низме хозяина противохламидийные антитела одновременно являются аутоантителами к собственному БТШ-60, который является одним из первых белков, синтезируемых в организме женщины эпителиальны ми клетками decidua bazalis после оплодотворения. На ранних стадиях беременности у женщины с хронической хламидийной инфекцией экс прессия БТШ-60 может реактивировать лимфоциты, сенсибилизиро ванные хламидийным БТШ-60, что приведет к отторжению эмбриона. Этот механизм, а также нарушение трубной проходимости являются ведущими в патогенезе женского бесплодия (Morrison R. P. et al., 1989).

Monif R. G. (2005) изучал клинические и гистологические корреля ции иммунореактивности к C. trachomatis и к эпитопам hsp60 среди женщин с эктопической беременностью. Серологический ответ к 13 синтетическим пептидам, соответствующим главным эпитопам hsp60,

22

Глава 1. Характеристика заболеваемости, этиология и патогенез урогенитального хламидиоза

определяли у 67 женщин с эктопической беременностью и у 45 жен щин с самопроизвольными выкидышами. Сальпингит был обнаружен в 43,3 % случаев пациенток с внематочной беременностью. Его наличие коррелировало с антителами к двум эпитопам hsp60 (от 260–271 а. о. и 411–422 а. о.). Антитела к этим двум эпитопам по сравнению с другими 5 эпитопами были выявлены у больных с формированием спаечного процесса в области придатков матки. Антитела к эпитопам 260–271

и188–199 выявлялись у пациенток с воспалениями органов мало го таза. Таким образом, индукция спаечного процесса в присутствии C. trachomatis определяется наличием антител к hsp60 (Chen W., 1999). Morrison R. P. et al. (1989) при исследовании обширного клинического материала сделал вывод, что экспрессия hsp60 является одним из меха низмов, ведущих к локальной активации макрофагов и Т-лимфоцитов

ивысвобождению цитокинов. Женщины со спаечным процессом име ли повышенное количество антител к C. trachomatis и hsp60 в перитоне альной жидкости (Юнусова Е. И., 2006; Wiesenfeld H. C. et аl., 2002).

Онарушениях гормональной функции яичников при инокуляции C. trachomatis свидетельствуют экспериментальные данные, получен ные на животных моделях. Pal S. et al. (1998) исследовали факторы, влияющие на индукцию бесплодия на модели хламидийной инфекции генитального тракта у мышей. Самкам мышей С3Н интравагинально инокулировали различные дозы C. trachomatis, в результате чего у них развивался целый ряд клинических проявлений, от бесплодия до бес симптомных выкидышей, причем инфекцию в средних и верхних от делах генитального тракта обнаруживали в большем проценте случаев

умышей, инфицированных во время лютеиновой фазы, чем во время фолликулярной. Эти результаты указывают, что быстрое терапевти ческое вмешательство может позволить избежать последствий инфи цирования хламидиями и предполагает, что гормональные факторы играют решающую роль в патогенезе заболевания. Также есть данные о влиянии C. trachomatis на функцию яичников и, в частности, на функ цию желтого тела, что может в определенных случаях являться причи ной прерывания беременности на ранних сроках.

23

Патогенез, диагностика и терапия урогенитального хламидиоза

Таким образом, хламидиоз — это широко распространенное за-

болевание, ответственное за широкий круг патологии органов и тканей.

Патогенез хламидиоза как рецидивирующей инфекции заключает ся в персистенции, которая может активировать иммунную реактив ность. При текущей инфекции бесчисленное число факторов с инги биторным или модифицирующим эффектом, действующих со стороны организма-хозяина, могут вызывать изменения в системе «бактерияхозяин», позволяющие организму сохранять непродуктивную фазу роста хламидий. Аномальные или персистирующие хламидии распо знаются различными клетками иммунной системы. Бесчисленные фак торы, связанные с персистенцией хламидий, предполагают изначаль ную генетическую гибкость систем их репродукции и, следовательно, иммуногенных детерминант, экспрессирующихся на клеточной поверх ности (Орлова О. Е. и др., 1986; Герасимова Н. М., 2001; Кубанова А. А. и др., 2004).

Взаимодействие хламидий с клеткой-хозяином сопровождается ее гетерогенизацией, формированием новых антигенов, идентичных аллогенным и ксеногенным. При хронической инфекции в организ ме поддерживается высокий уровень аутосенсибилизации данными антигенами, включающими детерминанты тех клеточных систем, в которых патоген размножается. Повторяющиеся эпизоды инфекции вызывают хроническое воспаление, связанное с патологической сти муляцией иммунной системы продуктами детритного происхождения. С другой стороны, патологическая стимуляция иммунной системы с развитием различных аутоиммунных реакций инициируется и под держивается циркуляцией хламидийных антигенов, имеющих общие эпитопы с рядом антигенов человеческого организма. Это белки тепло вого шока, а также L7 (один из рибосомальных белков, наиболее часто взаимодействующих с антителами при ревматических аутоиммунных заболеваниях). Другая часть общего патофизиологического механиз ма хламидийной инфекции обусловлена реакциями защитных систем организма-хозяина, вследствие которой при хламидийной инфекции

24

Глава 1. Характеристика заболеваемости, этиология и патогенез урогенитального хламидиоза

развивается воспаление, приводящее к повреждению тканей и разви тию различных осложнений. На поражение хламидиями эпителиаль ные клетки реагируют up-регуляцией экспрессии мРНК и секрецией провоспалительных цитокинов IL8, GRO-α, GM-CSF и IL6. Важно, что в противоположность быстрой и непродолжительной индукции цито кинов, следующей после инфекции другими инвазивными бактериями, эпителиальный ответ на хламидии откладывается на 20–24 часа после инфицирования, т. е. на время длительности жизненного цикла хла мидий, и требует белкового синтеза. При этом повышенная секреция провоспалительных цитокинов может быть опосредована IL1-α, кото рый высвобождается при лизисе инфицированных эпителиальных кле ток и может повышать воспалительный ответ путем стимулирования цитокиновой продукции неинфицированными соседними клетками. По сходному цитокиновому механизму обеспечивается инициирование и протекание воспалительного процесса в суставах, когда C. trachomatis стимулирует синовиоциты к продукции IL-6, TGF-β, GMCSF, а IL-1 по вышает продукцию IL-6 и GMCSF инфицированных клеток (Mpiga P. et al., 2006).

Защита слизистых оболочек обеспечивается совокупностью раз личных факторов (нормальная микрофлора, секреторные и сыворо точные иммуноглобулины, бактерицидные продукты — комплемент, лизоцим, лактоферрин и др.). Важную роль во взаимодействии хла мидийной инфекции с иммунной системой организма-хозяина игра ет синтез ИФН-γ. Показано, что при достаточной стимуляции ИФН-γ цитотоксических лимфоцитов происходит лизис инфицированных хламидиями клеток, из которых выходят во внеклеточную среду не зрелые и нежизнеспособные промежуточные формы хламидий, что и лежит в основе освобождения организма от инфекции. Следующим критическим моментом освобождения организма от инфекции явля ется поляризация Т-клеточного ответа макрофагами, опосредованная как ИФН-γ, так и IL-4, продукция которого ведет к ответу Th1 типа, способного уничтожить хламидийную инфекцию. Исходно организм располагает защитными механизмами, эффективно уничтожающими

25

Патогенез, диагностика и терапия урогенитального хламидиоза

хламидии. Но эти механизмы достаточно сложны, многофакторны, и пути дальнейшего распространения инфекции зависят от состояния макрофагальной функции, иммунокомпетентных клеток, способа пере ключения цитокинового ответа по Th1 или Th3 типу, уровней секреции цитокинов и многих других факторов. К наиболее значимым антихла мидийным факторам иммунитета в последнее время помимо интерфе ронов относят фактор некроза опухолей IL-1 (Герасимова Н. М., 2001; Ройт А. и др., 2000; Morrison R. P., 2003).

Глава 2.

Лабораторная диагностика урогенитального хламидиоза

Классификация методов. Лабораторная диагностика урогениталь ного хламидиоза имеет первостепенное­ значение в связи с тем, что кли нические проявления инфекции­ не патогномоничны и широкое рас пространение имеют атипичные­ и бессимптомные формы заболевания. Для удобства методы диагностики хламидиоза можно раз­делить на не сколько групп (Балаболкин М. И. и др., 2002; Бойцов А. Г. и др., 2002; Бочкарев Е. Г., 2005):

1.Методы, направленные на выявление возбудителя, его антигенов или нуклеиновых кислот:

a)микроскопические методы: микроскопия окрашенных мазков; прямая иммунофлюоресценция (ПИФ) или непрямая имму нофлюоресценция (НИФ);

б) культуральный метод; в) индикация антигенов: реакция иммунофлюоресценции; им

мунохроматография; г) индикация нуклеиновых кислот: ДНК-гибридизация и ампли

фикация (ПЦР, ЛЦР и т. д.).

2.Методы, направленные на выявление антител к возбудителю:

a)поиск антител в сыворотке крови;

б) поиск антител в сперме.

Имеются другие классификации лабораторных методов диагности ки хламидиозов (табл. 7).

Исследуемым материалом при диагностике урогенитального хлами­ диоза с помощью методов, направленных на выявление возбудителя, являются­ соскобы со слизистой уретры, цервикального канала, моча. Для диагностики хламидиоза важным является техника взятия мате риала (Домейка М., 2007).

27

Патогенез, диагностика и терапия урогенитального хламидиоза

Таблица 7

Методы лабораторной диагностики хламидиозов (Ю. В. Лобзин с соавт., 2003)

	Группа методов	Цель исследования	Используемые методические
			приемы
		Оценка цитологической кар
		тины и морфологии клеток
		в очаге воспаления, а также	Окраска препаратов по
		сопутствующей микрофлоры.
	Морфологические	Выявление морфологиче	Романовскому-Гимза, окраска
		ских структур возбудителя.	по Маккиавеллю, окраска рас
		Выявление нейтрофильно-	твором Люголя
		гистиоцитарно-
		макрофагальной реакции
		(НГМР)
			Посев исследуемого материала
		Выделение возбудителя в куль	на перевиваемые культуры
	Культуральные		клеток, куриные эмбрионы.
		туре клеток in vitro	Заражение лабораторных жи
			вотных
			ИФА, РИФ, ПИФ, НИФ, ви
	Иммунологические	Выявление антигенов хлами	роиммунотест, иммунохрома
		дий и хламидийных антител	тографические методы, РСК,
			РНГА, РНИФ и др.
	Молекулярно-	Выявление ДНК и РНК воз	ПЦР, ЛЦР
	биологические	будителя

Выявление специфических включений в мазках, окрашенных по Романовскому-Гимза, было главным методом диагностики трахомы. Метод­ прост, доступен, однако недостаточно чувствителен. По дан ным А. А. Шаткина (1990), при урогенитальных хламидиозах частота обнаружения телец Гальберштедтера-Провачека в соскобах уретры и цервикального канала обычно не превышает 10–12 %. Использование в качестве предварительной­ диагностики метода окраски мазков по Папаниколау не­возможно из за большого количества ложноположительных результатов­. В связи с этим, несмотря на простоту и

28

Глава 2. Лабораторная диагностика урогенитального хламидиоза

доступность,­ этот метод не может решить проблему диагностики хла мидиоза (Аракелова О. Н. и др., 1993).

В настоящее время не существует лабораторного метода, способ ного избежать как ложноположительных, так и ложноотрицательных результатов. Необходимо учитывать предел чувствительности и специ фичность каждого метода.

Важна комплексная лабораторная диагностика (для того, чтобы выявить возбудителя, определить стадию заболевания, обосновать не обходимость назначения антибактериальных препаратов). Таким об разом «золотой стандарт» в настоящее время — комбинация методов с использованием сертифицированных диагностических реагентов и тест систем (Бочкарев Е. Г., 2005; Долгих Т. И., 2000; Рищук С. В., Костючек Д. Ф., 2005).

2.1. Иммуноморфологические и серологические методы

Иммуноморфологические методы основаны на обнаружении анти­ генных субстанций хламидий в эпителии и других тканях путем обра­ ботки препаратов специфическими антителами. Метод прямой имму нофлуоресценции (ПИФ-метод) является важным методом диагностики­ урогенитальных хламидиозов в связи с относительной дешевизной и доступностью. Для его реализации первоначально использовались пре­ параты на основе поликлональных антител, меченных флюорохромом. Однако максимальной чувствительности и специфичности удалось до стигнуть только при замене поликлональных антител на моноклональ ные. При этом в разных препаратах используются моноклональные анти тела как против липополисахаридных, так и против белковых антигенов­ хламидий. Во многих отечественных («НИАРМЕДИК» при НИИЭМ им. Н. Ф. Гамалеи РАМН) и зарубежных фирмах (США: Syva, Difco, Kallastad, Bartels, Boots Celltech, California Integrated Diagnostics; финская­ фирма Orion Diagnostica) в тест системах используются моноклональные­ AT к липополисахаридному антигену С. trachomatis.

29

Патогенез, диагностика и терапия урогенитального хламидиоза

ПИФ, как правило, позволяет выявить элементарные тельца хлами­ дий, реже — ретикулярные тельца. Так, по данным В. В. Деликторского

исоавт. (1995), с помощью препарата Chlamitest (Orion Diagnostica) PT удается выявить не более чем в 5 % случаев. Не исключено, что вероятность­ выявления РТ меняется в зависимости от стадии развития патологического­ процесса и их обнаружение имеет диагностическое значение, однако этот вопрос нуждается в специальном изучении.

Данные о чувствительности ПИФ при исследовании препаратов из урогенитального тракта и при использовании моноклональных AT крайне­ противоречивы. Она составляет 90–100 % при специфичности 85–100 %. Лучшие результаты по окрашиванию ЭТ хламидий­ получены при использовании реагентов фирм Syva Micro Trak и Kallastad. Общая чувствительность этого метода с использованием Micro Trak-теста со ставляет 67,5–96,3 %, а специфичность — 70,9–99,5 %. Таким же высоко чувствительным и специфичным является реагент Chlamyset фирмы Orion Diagnostica — соответственно 77,5 и 85,7 % (Савичева А. М., 2002; Семенов Н. В., 2004; Chen N. Y., Donoban B., 2005).

Некоторые авторы указывают на опасность как гипер-, так и гипо диагностики при применении ПИФ (Скворцов С. В. и др., 1995). Опас­ ность гипердиагностики обусловлена субъективным характером учета результатов ПИФ. Результаты ПИФ оценивают по характеру специфи­ ческого свечения хламидий в люминесцентном микроскопе. При этом учитывается цвет светящегося объекта, его форма, размер и интенсив­ ность свечения. Критерии оценки могут незначительно изменяться в инструкциях по применению конкретных препаратов. Как правило, результат­ может считаться положительным при обнаружении от 5 до 10 элементарных телец в исследуемом объекте. Отрицательный ответ выдается после микроскопии препарата в течение 3 минут (Кубась В. Г.

идр., 2002, 2003; Прохоренков В. И., Шапран М. В., 2002).

Причины неспецифического свечения в ПИФ многочисленны: нека­ чественный забор и обработка материала; некачественная установка и настройка аппаратуры; наличие перекрестных реакций с родственны ми антигенами других бактерий (Скрипкин Ю. К. и др., 1996).

30