церогенеза, идентификации онкоге­ нов и поиска их клеточных предшест­ венников. Нормальные клеточные ге­ ны, которые в составе вирусного ге­ нома превращаются в v-onc, обознача­ ются как протоонкогены. Следует от­ метить, что в результате мутаций, включая перестройку хромосом, про­ тоонкогены могут превращаться в он­ когены и без участия вируса. В этом случае говорят о клеточных онкогенах (с-опс): На основе изучения вирусных онкогенов разработаны подходы к вы­ явлению клеточных онкогенов в неви­ русных опухолях (см. раздел 3.1).

Канцерогенез, вызываемый низкоонкогенными (лейкемогенными) ви­ русами, отличается по своему меха­ низму от канцерогенеза, вызываемого высокоонкогенными ретровирусами. Эти вирусы не имеют онкогенов и должны создать их по крайней мере в некоторых зараженных клетках. На модели вируса лимфоидного лейкоза птиц было показано, что вызываемый этим вирусом лейкоз моноклонален, т. е. возникает из одной клетки, кото­ рая приобрела опухолевые свойства. В Д Н К лейкемических клеток был вы­ явлен ретровирусный ДНК-провирус, встроившийся в клеточный геном ря­ дом с протоонкогеном туе. Экспрес­ сия этого гена осуществлялась при помощи сильного вирусного промото­ ра, локализованного в LTR, и в 50— 100 раз превышала уровень его обыч­ ной экспрессии. При такой регуляции протоонкоген превратился в клеточ­ ный онкоген с-тус, ответственный за появление опухолевого фенотипа ис­ ходной клетки и ее потомства. По­ скольку встройка провируса носит случайный характер и достаточно ред­ ка, этот феномен объясняет низкую онкогенность, моноклональность и длительный латентный период заболе­ вания.

* * *

Многие вирусы обладают способ­ ностью вызывать опухоли in vivo и/ или индуцировать неопластическую

трансформацию клеток in vitro. Такие вирусы считаются опухолеродными. Они принадлежат к нескольким груп­ пам ДНК-содержащих (папова-, аде- но-, герпес-, покс- и гепаднавирусы) и к одной группе РНК-содержащих вирусов (ретровирусы). Некоторые из вирусов в естественных условиях вы­ зывают онкогенные инфекции, веду­ щие к возникновению опухолевых за­ болеваний человека и животных (па­ пиллома-, герпес-, покс-, гепадна- и ретровирусы), в том числе часто встре­ чающихся опухолей человека (аногенитальный рак, гепатома). Онковиру­ сологические исследования сыграли выдающуюся роль в открытии онкоге­ нов — генов, непосредственно отве­ чающих за опухолевую трансформа­ цию клетки. Важной нерешенной за­ дачей онковирусологии является раз­ работка подходов к профилактике он­ когенных инфекций человека и сель­ скохозяйственных животных.

Рекомендуемая литература

Филдс Б., Найл Д. (ред.) // Вирусология. — Т. 1. - М.: Мир, 1989.

Gross L. Oncogenic viruses. — Oxford: Pergamon Press, 1970.

Weiss R., Teich N., Varmus H., Coffin J. (eds). RNA tumor viruses. — CSHL, 1982.

5.2. Онкогенный потенциал вирусов и механизмы его проявления

Ф. Л. Киселев

Вопрос о роли вирусов в канцеро­ генезе — один из наиболее интерес­ ных вопросов современной онколо­ гии. Опухоли, у которых вирусы иден­ тифицированы в качестве этиологиче­ ских факторов, выявлены у многих видов млекопитающих и птиц. Эти вирусы оказались способны вызывать злокачественную трансформацию кле­ ток in vitro, что позволило получить прекрасные модели для изучения кан­ церогенеза in vitro и для изучения взаимодействия клеточных и вирус­ ных генов, контролирующих проли-

274

феративную активность клеток, что имеет и общебиологическое значение.

Исторический аспект проблемы освещен в предыдущем разделе. Здесь мы сконцентрируем внимание читате­ лей на общих 1;ринципах перестройки генетической программы клеток под действием вирусов таким образом, что клетка перестает контролировать соб­ ственное деление. Основное внима­ ние будет уделено вопросам транс­ формации клеток in vitro, поскольку именно на этих моделях возможно по­ лучение адекватного ответа на вопрос о том, какие клеточные и вирусные гены вовлечены в этот процесс.

Рассмотрение в настоящем разделе только данных, касающихся роли ви­ русов в канцерогенезе у человека, объясняется двумя обстоятельствами: во-первых, это одна из наиболее акту­ альных проблем онкологии, исследо­ вания в которой привели к созданию эффективных вакцин против некото­ рых форм рака, а во-вторых, вирусы, которые этиологически связаны с опухолями человека, принадлежат к различным группам как ДНК - , так и РНК-содержащих вирусов, и на их примере могут быть рассмотрены многие вопросы вовлеченности вирус­ ных и клеточных генов в процессы канцерогенеза in vivo.

5.2.1. Трансформация клеток вирусами in vitro

Вирусы, которые индуцируют опу­ холи, принадлежат к нескольким так­ сономическим группам. Все РНК - со - держащие вирусы относятся к семей­ ству ретровирусов, а ДНК-содержа- щие вирусы происходят из 7 различ­ ных групп (см. раздел 5.1).

Среди РНК-содержащих вирусов, различающихся по морфологии внут­ реннего ядра вириона, наиболее мно­ гочисленной является группа вирусов С-типа млекопитающих и птиц, кото­ рые вызывают лейкозы, саркомы, лимфомы и некоторые другие виды опухолей. Эти вирусы можно условно разделить на две группы по структуре

18*

генетического материала, но предста­ вители обеих групп имеют одну сход­ ную структуру в составе своей Р Н К — на обеих концах молекулы имеются так называемые LTR, выполняющие регуляторную функцию и содержащие промоторные и энхансерные последо­ вательности. Кроме того, LTR играют ключевую роль в процессах интегра­ ции вирусного генома в клеточный. Сюда же относятся еще две группы вирусов — В-тип MMTV, а также BLV и HTLV I. Для этих вирусов также ха­ рактерно наличие LTR на обеих кон­ цах РНК .

Среди ДНК-содержащих вирусов наиболее представительны аденовиру­ сы, которые вызывают опухоли раз­ личных типов у многих животных (кроме человека). Среди других групп ДНК-содержащих вирусов лишь от­ дельные обладают онкогенным потен­ циалом, и среди них наибольший ин­ терес вызывают вирус гепатита В, ас­ социированный с опухолями печени, вирус Эпштейна—Барр, выявляемый в лимфомах Беркитта и опухолях носо­ глотки, и вирус папилломы человека — этиологический агент рака шейки матки.

Независимо от таксономической принадлежности генетическая страте­ гия указанных вирусов сводится к проявлению онкогенного потенциа­ ла, т. е. к изменению генетической программы клеток, приводящей в ко­ нечном итоге к их неконтролируемо­ му росту. Репликация онкогенных ретровирусов не является цитопатогенной, и, следовательно, злокачест­ венная трансформация на клеточном уровне конкурирует с продукцией ин­ фекционных вирусных частиц, а про­ дукция вирионов не является необхо­ димой для онкогенеза. Для ДНК-со­ держащих вирусов синтез инфекцион­ ного потомства приводит, как прави­ ло, к клеточной гибели; следователь­ но, в этом случае онкогенная транс­ формация возможна только тогда, ко­ гда инфекционный вирусный цикл прерван. Это достаточно четко прояв­ ляется у аденовирусов и вирусов по-

275

лиомы, где в нечувствительной систе­ ме происходит абортивный цикл раз­ множения, сопровождающийся транс­ формацией клеток. У вирусов папил­ лом ситуация сложнее, поскольку для этих вирусов фактически отсутствуют чувствительные клеточные системы инфицирования вирусами этой группы.

Некоторые вирусы могут функцио­ нировать в качестве опухолеродных факторов в природных условиях, дру­ гие проявляют свой онкогенный по­ тенциал только у неприродных хозяев. Возможности вирусов как индукторов опухолей сильно варьируют. Наиболее активные ретровирусы могут иниции­ ровать опухолевый рост у животных в течение нескольких дней. Для боль­ шинства других вирусов характерен более длительный латентный период, и лишь у небольшого процента зара­ женных хозяев возникают неоплазии. Все опухоли человека, ассоциирован­ ные с вирусными инфекциями, при­ надлежат к этой категории. Тот факт, что образование опухоли не есть пря­ мой результат только вирусной ин­ фекции, свидетельствует о многосту­ пенчатой природе онкогенеза, при ко­ тором каждый этап представляет со­ бой независимое и необратимое гене­ тическое событие, которое в той или иной степени связано с нарушениями в регуляции клеточного размножения. Вирусная инфекция представляет со­ бой один из этих этапов; только в том случае, если проявляются остальные, возможно возникновение опухоли. Частичным подтверждением этому яв­ ляется тот факт, что в культурах in vit­ ro вирус может трансформировать клетки как до полностью трансфор­ мированного фенотипа (и такие клет­ ки вызывают опухоли у чувствитель­ ных животных), так и вызывать не­ полную трансформацию, которая со­ провождается изменениями в морфо­ логии клеток и ростовых характери­ стик, но такие клетки не способны формировать опухоль in vivo.

Открытие вирусиндуцированной трансформации сыграло решающую

роль в переходе онкологических ис­ следований на молекулярно-генетиче- ский уровень. Большинство осново­ полагающих факторов, которые нам известны и которые важны для пони­ мания молекулярных механизмов кан­ церогенеза, в основном получены при изучении опухолеродных вирусов. Эти исследования привели к созданию унифицированной гипотезы о том, что трансформация клеток с после­ дующим формированием опухолевого фенотипа возникает в результате му­ тационных изменений в генах, кон­ тролирующих размножение клеток.

Механизмы вирусиндуцированной трансформации могут отличаться в де­ талях, но все они имеют следующие общие свойства: 1) для трансформации достаточно единственной вирусной частицы. Вирусиндуцированная трансформация является "одноударным" процессом; 2) полностью или частично вирусный геном должен присутствовать в опухолевых клетках, при этом, как правило, продукция ви­ русных частиц отсутствует; 3) вирус­ ный геном в опухолевых клетках дол­ жен экспрессироваться; 4) трансфор­ мация приводит к нарушению кон­ троля деления клеток.

Изменения в клеточных парамет­ рах, сопровождающих трансформа­ цию, являются множественными и ка­ саются в основном изменений в рос­ товых свойствах и клеточной морфо­ логии (подробнее см. в главе 6). Сле­ дует лишь подчеркнуть, что критерии трансформации, индуцируемой виру­ сами, сходны с теми, которые прояв­ ляются при индукции другими факто­ рами.

5.2.2. Вирусиндуцированная трансформация как модель для изучения контроля клеточного цикла и пути передачи сигнала

До недавнего времени изучение ре­ гуляции клеточного цикла было в зна­ чительной степени ограничено из-за отсутствия адекватного генетического

276

анализа, однако изучение онкогенного действия белков, кодируемых опу­ холевыми вирусами (прежде всего ДНК-содержащими), внесло весомый вклад в понимание механизмов, кон­ тролирующих размножение клеток млекопитающих. Именно эти иссле­ дования способствовали пониманию роли супрессорных белков — продук­ тов гена ретинобластомы и р53 как ре­ гуляторов клеточной пролиферации. Каждый из этих белков обеспечивает блок в прогрессии клеточного цикла на стадии G 1 . Ген ρ53 является также ключевым в запуске программируе­ мой клеточной гибели (апоптоза) в ответ на различные сигналы. Белки ДНК-содержащих вирусов ингибируют активность обоих указанных бел­ ков — супрессоров, индуцируя тем са­ мым переход покоящихся клеток в S- фазу.

Анализ онкогенов, выявленных в РНК-содержащих вирусах, позволил прояснить многие механизмы переда­ чи сигнала, связывающего клеточную поверхность с генетическим аппара­ том в составе ядра. Наиболее впечат­ ляющим оказался тот факт, что онко­ гены, идентифицированные в составе РНК-содержащих вирусов, кодируют белки, участвующие практически в каждом этапе передачи сигнала. Кро­ ме того, изучение этих вирусных он­ когенов позволило идентифициро­ вать много новых участников этого сложного пути. В отличие от онкоге­ нов ДНК-содержащих вирусов онко­ гены РНК-содержащих вирусов не яв­ ляются истинно вирусными генами — они представляют собой клеточные гены, которые приобретаются в про­ цессе репликации вируса с последую­ щей селекцией по трансформирован­ ному фенотипу, поскольку именно трансформированные клетки обеспе­ чивают возможность их длительного размножения в культуре.

Таким образом, изучение опухоле­ родных вирусов имеет важное значе­ ние для понимания механизма кон­ троля клеточного роста и является не­ обходимым инструментом для после­

дующего детального анализа молеку­ лярных механизмов этого процесса. Влияние ДНК-содержащих и Р Н К - содержащих вирусов различно, каж­ дая группа имеет уникальные возмож­ ности для расшифровки механизмов онкогенеза. Сочетание этих двух ви­ русных онкогенных систем может обеспечить широкий эксперименталь­ ный подход к изучению контроля кле­ точной пролиферации, дифференцировки и нарушений этого контроля, которые происходят при злокачест­ венной трансформации.

5.2.3. Механизмы трансформации клеток РНК-содержащими вирусами

РНК-содержащие вирусы обладают рядом специфических особенностей, позволяющих им осуществлять свой онкогенный потенциал: 1) обратная транскрипция однонитчатой вирусной Р Н К в двунитчатую Д Н К ; 2) интегра­ ция этой Д Н К в клеточную хромосо­ му; 3) экспрессия интегрированного провируса под контролем регуляторных последовательностей вирусного генома. Ретровирусные гены могут попадать в терминальные клетки и за­ тем передаваться в потомство по зако­ нам Менделя. Особое значение для онкогенеза имеют еще две особенно­ сти ретровирусного цикла: 1) способ­ ность приобретать и трансдуцировать клеточный генетический материал и 2) инсерционная активация (а часто и инактивация) клеточных генов в ре­ зультате интеграции провируса.

В настоящее время ретровирусы выявлены у нескольких видов живот­ ных: птиц, мышей, кошек, крупного рогатого скота и обезьян. У человека один из сравнительно редких видов лейкоза (Т-клеточный лейкоз взрос­ лых) также ассоциирован с ретровирусом Т-клеточного лейкоза (HTLV I). Анализ ретровирусиндуцированной трансформации привел к открытию спектра клеточных генов, получивших название онкогены, которые являются основным действующим началом в

277

набор вирусных генов и способ­ ны к эффективной репликации. Они могут индуцировать опухо­ ли, но со значительным латент­ ным периодом (в течение недель и даже месяцев). Представители этой группы вирусов не способ­ ны индуцировать онкогенную трансформацию клеток in vitro. Эти вирусы содержат всю необ­ ходимую информацию для собст­ венной репликации, но эта ин­ формация не участвует в процес­ сах онкогенеза, индуцированного этими вирусами (в отличие от трансдуцирующих ретровиру­ сов), который осуществляется в этом случае за счет активации клеточных генов, контролирую­ щих пролиферацию клеток.

Третий (пока что гипотетиче­ ский) механизм ретровирусного канцерогенеза основан на том, что вирусные последовательно­ сти не только необходимы для репликации вируса, но и непо­ средственно вовлечены в онко­ генез. Эти последовательности

TRA — вирусный ген транс-активатор

ретровирусном		канцерогенезе	и	С х е м а 5.2. Общий принцип взаимодействия
играют ключевую роль в процес­				РНК-содержащих вирусов с клетками
сах клеточного		размножения	и	РНК-содержащие вирусы
дифференцировки.
Ретровирусы		индуцируют
опухоли	и	трансформируют

клетки с помощью трех различ­

ных механизмов.

• Большинство ретровирусов индуцируют онкогенез че­ рез действие онкогенов. Эти вирусы могут быть раз­ делены на две четко разли­ чимые группы: 1 ретрови­ русы, несущие онкоген в составе генома, которые могут быть охарактеризо­ ваны как трансдуцирующие ретровирусы (об этих вирусах подробно в разделе 2.1), и 2) ретровирусы, не содержащие онкогена, но индуцирующие трансфор­ мацию путем интеграции в

соседстве с клеточным онкоге­ ном с последующей его актива­ цией. Такие вирусы можно оха­ рактеризовать как цисдействующие. Практически все трансдуцирующие ретровирусы утрати­ ли часть вирускодирующей ин­ формации в обмен на клеточные последовательности. Как резуль­ тат этого они дефектны по спо­ собности синтезировать потом­ ство, и для их репродукции не­ обходим родственный вирус-по­ мощник, который при совмест­ ной инфекции обеспечивает синтез необходимых компонен­ тов вирусной частицы (белков оболочки вириона). Такие виру­ сы являются "эффективным кан­ церогеном", способны транс­ формировать клетки в культуре и вызывать опухоли с коротким латентным периодом (несколько дней). Возможный механизм действия вирусов этой группы представлен на схемах 5.2, 5.3.

Φ Все цисактивирующие ретрови­ русы (см. ниже) содержат полный

278

С х е м а 5.3. Общий принцип взаимодействия ДНК-содержащих

вирусов с клетками

Вирусная ДНК

кодируют

неструктурные

(т. е.

протоонкогенов, или с-onc, сохраня­

не входящие в состав вирусной

ются на протяжении длительного эво­

частицы)

регуляторные

белки.

люционного периода. К примеру, он­

Эти белки

могут

активировать

когены ras

и jun выявлены у эукариот —

как собственные энхансерные и

от дрожжей до человека. Это позволя­

промоторные

последовательно­

ет предполагать, что они выполняют

сти

внутри

регуляторной

облас­

важные функции у различных жиз­

ти вирусного генома (LTR), так

ненных форм, не требующие сущест­

и

регуляторные

последователь­

венных изменений в процессе эволю­

ности, контролирующие

актив­

ции. Эти функции онкогенов осуще­

ность клеточных генов,

контро­

ствляют их продукты, называемые он-

лирующих

пролиферацию, спо­

кобелками.

Онкобелки

по

определе­

собствуя

тем

самым

бескон­

нию должны обладать

потенциальны­

трольному

делению

клеток и

ми

возможностями

индукции

клеточ­

формированию

опухоли.

Этот

ной

трансформации. Канцерогенный

феномен

получил

название

потенциал онкогенов возникает в ре­

трансактивации. Ярким

приме­

зультате изменения

их

нормальной

ром являются РНК-содержащий

физиологической функции. Из этого

вирус Т-клеточного лейкоза че­

следует, что для понимания онкоге-

ловека (HTLV I) и ДНК-содер-

ниндуцированного

канцерогенеза не­

жащий вирус гепатита В (HBV).

обходимо

знание

нормальных

функ­

ций клеточных онкогенов. Для этого

5.2.4. Онкогены

существуют три принципиальных под­

как компоненты

хода: 1) анализ нуклеотидной и ами­

регуляторной

системы

нокислотной последовательности для

клетки,

контролирующей

выявления

уровней гомологии

между

клеточным

и вирусным

геном;

2) ис­

пролиферацию

следование

специфичности

экспрес­

и дифференцировку

сии протоонкогена; 3) анализ специ­

Онкогены, обнаруженные в геноме

фических биохимических свойств он-

ретровирусов,

происходят

из

клеточ­

кобелка, таких, к примеру, как фер­

ного генома.

Большинство

клеточных

ментативная активность, связывание с

279

гормонами, ростовыми факторами, лигандами, или сиквенс-специфиче- ский аффинитет для нуклеиновых ки­ слот. Данные, полученные в этом на­ правлении, позволили классифициро­ вать все онкогены как единую группу регуляторов клеточного размноже­ ния. Они являются компонентами сигнальной сети, которая получает информацию вне клетки и переносит ее в ядро, где эта информация отра­ жается в форме активности различных генов, контролирующих пролифера­ цию.

Типичный ростовый сигнал прояв­ ляется на клеточной поверхности в форме полипетидного ростового фак­ тора и связывается с собственным специфическим рецептором. Этот ре­ цептор, часто являющийся интеграль­ ным белком мембраны, обладающим тирозинспецифической киназной ак­ тивностью, подвергается активации в результате связывания с лигандом (к примеру, он может димеризоваться, что приводит к возрастанию его ки­ назной активности с последующим аутофосфорилированием специфиче­ ских остатков на молекуле рецептора, но локализованных в цитоплазме). Сигнал далее передается путем после­ довательных и специфических белокбелковых взаимодействий, доходя до ядра. Конечным результатом входя­ щих сигналов должны быть транс­ крипционные факторы, способные направлять работу определенных кле­ точных генов.

Далее мы представим возможные общие пути участия онкогенов в регу­ ляции клеточной пролиферации.

Вне клетки наиболее известным является онкоген sis, который проис­ ходит из гена, кодирующего P D G F . Онкоген int2, который отсутствует в геноме ретровирусов, но может быть цисактивирован вирусом опухолей молочных желез мышей, кодирует бе­ лок, родственный ростовому фактору фибробластов. Гены Erb В, fins, kit ко­ дируют измененные рецепторы росто­ вых факторов с известными лиганда­ ми; несколько других онкогенов про­

дуцируют белки, которые имеют структуру, сходную со структурой ре­ цепторов ростовых факторов, лиганды которых еще предстоит идентифици­ ровать. Продукты генов семейства ras находятся в цепи передачи сигнала. Точные функции src, abl и других нерецепторных киназ до сих пор окон­ чательно не установлены, возможно, они необходимы для амплификации поступающего сигнала. Некоторые из онкогенов кодируют цитоплазматические киназы, которые специфичны для тирозина (fps) или для серина и треонина (rаf, mos). Все ядерные он­ когены контролируют транскрипцию. Некоторые из них (fos, jun, rel) явля­ ются транскрипционными факторами, другие (онкогены семейства туc) час­ то активируются в опухолях человека.

Следует подчеркнуть, что в опухо­ лях разного происхождения в гистоге­ незе могут наблюдаться изменения в онкогенах без какой-либо специфич­ ности, но тем не менее можно пред­ положить, что качественные и коли­ чественные изменения в этих генах, контролирующих пролиферацию кле­ ток, являются одним из ключевых мо­ ментов, приводящих клетки к некон­ тролируемому размножению.

5.2.5. Цис-активация под действием вирусов

Многие ретровирусы, которые не содержат в своем составе онкогена, тем не менее способны к индукции опухолей у животных, причем спектр опухолей, вызванных этими вирусами, фактически не отличается от таковых, вызываемых транедуцирующими рет­ ровирусами: это саркомы, различные виды лейкозов и карциномы. Основ­ ное же отличие состоит в продолжи­ тельности латентного периода, кото­ рый в случае вирусов без онкогена может варьировать от нескольких не­ дель до нескольких месяцев. Кроме того, эти вирусы не способны вызы­ вать онкогенную трансформацию кле­ ток в культуре. Опухоли, вызванные нетранедуцирующими ретровируса-

280

ми, имеют несколько важных свойств для понимания их функционирова­ ния. Все они содержат интегрирован­ ный провирус. Провирусные последо­ вательности обнаруживаются в одном и том же хромосомальном сайте во всех клетках одной определенной опу­ холи, следовательно, каждая опухоль является моноклональной, т. е. про­ исходит из одной трансформирован­ ной клетки. Хотя инфекция иниции­ руется недефектным вирусом, кото­ рый проходит множественные циклы репликации, провирусы, идентифици­ рованные в опухолевых клетках, как правило, являются дефектными и со­ держат лишь часть вирусного генома. Основным фрагментом, который все­ гда сохраняется в опухолях, является "левый" LTR, а часть кодирующих по­ следовательностей (а иногда и все) могут быть утеряны. Это свидетельст­ вует о том, что последовательности, кодирующие белки вириона, не явля­ ются необходимыми для поддержания трансформированного фенотипа. Но наиболее важным является тот факт, что имеются предпочтительные сайты клеточного генома, куда интегрирует­ ся вирусный геном. В нескольких ти­ пах опухолей эти сайты локализуются в непосредственной близости от кле­ точного онкогена, что является харак­ терным и для трансдуцирующих рет­ ровирусов.

В результате интеграции ретровируса поблизости от онкогена наблюдает­ ся повышение его экспрессии. Такой феномен получил название инсерционной (вставочной), или цисактивации. Идентифицировано два принци­ пиальных механизма такого типа акти­ вации: инсерция промотора и инсерция энхансера. В случае инсерции про­ мотора происходит образование химер­ ной РНК, содержащей LTR ретровируса с последовательностями клеточного онкогена. Естественно, что если акти­ вация происходит с 5'-LTR, то в состав химерной Р Н К могут входить и после­ довательности кодирующих вирусных генов. Если же активация инициирует­ ся с З'-LTR (что бывает чаще), то ви­

русные последовательности в химер­ ной Р Н К отсутствуют. Предпочтитель­ ный интеграционный сайт при инсер­ ции промотора локализуется внутри онкогена, что сопровождается редук­ цией кодирующих последовательно­ стей онкогена или удалением некодирующих доменов, которые содержат негативные регуляторные элементы. В случае инсерции энхансера интеграция провируса в правильной ориентации по отношению к клеточному онкогену не является обязательной, и он может локализоваться "down stream" по отно­ шению к клеточному гену. В случае инсерции энхансера транскрипты он­ когена не содержат вирусных последо­ вательностей.

Классическим примером цисактивации является лимфолейкоз птиц, вызванный вирусом ALV. При этом провирус (вирус, ассоциированный с вирусом саркомы Рауса RAV1 или RAV2)

интегрируется в В-клеточных лимфомах, возникающих через не­ сколько месяцев после инокуляции, в соседстве с онкогеном тус и резко ак­ тивирует его экспрессию. Другим примером такого рода является эритролейкоз, возникающий у некоторых линий кур, также вызываемый виру­ сом RAVI. В этом случае провирус интегрируется в соседстве с геном erb В1, экспрессия которого возрастает в опухолевых клетках.

Еще одним вирусом, который функционирует по типу инсерционного мутагенеза, является вирус опу- холй молочных желез (ММТV). Этот вирус имеет несколько предпочти­ тельных сайлюв итеграции. Среди них наиболее часто встречаются та­ кие, которые локализуются в непо­ средственной близости к трем клеточ­ ным генам: int1, int2 и int3. Эти гены локализованы на разных хромосомах, и гомология в нуклеотидных последо­ вательностях этих генов отсутствует. В опухолях молочных желез, индуцируе­ мых MMTV, вирус повышает транс­ крипцию соседних локусов int, и именно этот феномен играет ключе­ вую роль в развитии опухолей.

281

Ген Intl (или wntl), по-видимому,

SV40 и полиомы вызывают образова­

играет роль в развитии, int2 принадле-

ние опухолей у многих эксперимен­

жит к семейству ростовых факторов, а

тальных животных, но не у природ­

intЗ

— также к генам, участвующим в

ных хозяев.

развитии.

Выше

отмечалось,

что

трансфор­

мирующий потенциал РНК-содержа-

5.2.6. Онкогенность,

щих онкогенных вирусов

фактически

не

связан

с

продукцией

вирусных

индуцируемая транс-

частиц.

В

противоположность

этому

активирующими

онкогенные

свойства

ДНК-содержа-

ретровирусами

щих вирусов тесно связаны со спо­

Еще один механизм, по которому

собностью этих вирусов к продуктив­

ретровирусы могут индуцировать он-

ной инфекции. Онкогены ДНК - со -

когенез, состоит в продукции белко­

держащих

вирусов

являются

необхо­

вых продуктов, кодируемых вирусным

димыми вирусными генами и в отли­

геномом,

которые

способны активи­

чие от РНК-содержащих не имеют

ровать клеточные

гены,

необходимые

клеточных

гомологов.

Следователь­

для

контроля

клеточной

пролифера­

но, инфекция клеток, которая явля­

ции.

ется

пермиссивной

для

репликации

Наиболее

ярким

представителем

вируса, будет приводить к продуктив­

этой группы

вирусов

является

вирус

ной

инфекции, выделяя

значитель­

Т-клеточного лейкоза человека (НТ-

ное количество вирусных частиц, что

LV), содержащий в составе своего ге­

часто приводит к гибели клеток. В

нома последовательность, которая мо­

этом

случае

трансформирующий

по­

жет кодировать несколько белков, об­

тенциал не может быть выражен.

ладающих

трансактивирующими

по­

Только в том случае, если инфекция

тенциями.

вирусом происходит в непермиссив-

ных условиях, при которых процесс

5.2.7. Механизм

репликации вируса ограничен,

фено­

мен

трансформации

может

прояв­

трансформации клеток

ДНК-содержащими вирусамиляться.

Эффективность

трансформации

В каждом семействе ДНК-содер-

после

инфекции

непермиссивных

жащих вирусов выявлены

представи­

клеток

аденовирусом,

вирусом

SV40

тели, обладающие онкогенным потен­

или полиомы очень низка, как прави­

циалом. Среди них имеются вирусы,

ло, ниже 10-5. Эта неэффективность,

вызывающие

опухоли

у

природных

по-видимому, связана с тем, что воз­

хозяев, в том числе и у человека, в

можность

сохранения

интактности

других случаях они способны к ин­

вирусных

генов,

интегрированных

в

дукции трансформации

в

клеточных

клеточный геном с последующей их

культурах и к образованию опухолей у

активной экспрессией, достаточно ма­

неприродных

хозяев.

Классическим

ла.

Трансформирующие

потенциалы

примером вирусов первого типа явля­

ДНК-содержащих вирусов проявля­

ется вирус папилломы человека, этио­

ются прежде всего в их способности

логически связанный с раком шейки

стимулировать

покоящиеся

клетки

к

матки у человека, а вирусов второго

вхождению в клеточный цикл, т. е.

типа — аденовирусы, которые инду­

нарушению

контроля

клеточного

де­

цируют опухоли у грызунов, а их ви­

ления, и этот процесс осуществляется

русные гены Е1А и Е1В трансформи­

в

результате

функционирования

ви­

руют клетки млекопитающих в куль­

русных онкогенов. Следовательно, ко­

туре (хотя отсутствуют какие-либо

нечным

результатом

является

приоб­

данные, что эти вирусы ассоциирова­

ретение клетками способности к авто­

ны

с опухолями у

человека). Вирусы

номной репликации.

282

5.2.8. Онкогены					чием в геноме этих вирусов собствен­
ДНК-содержащих					ного	онкогена		(онкогенов),		которые
вирусов					индуцируют		синтез белковых			продук­
					тов,	способных		взаимодействовать с
Вирусная инфекция			делится	на	различными клеточными				генами или
раннюю и позднюю стадии, и в каж­					их продуктами,			которые	осуществля­
дой из этих стадий действуют разные					ют контроль за пролиферацией кле­
вирусные гены. Ранние гены кодиру­					ток.
ют белки, участвующие в репликации					Кроме		того,	может	проявляться
вирусной Д Н К ,	в то время как позд­				еще один механизм, связанный с ин­
ние гены осуществляют синтез белков					теграцией вирусного генома в клеточ­
вирусной оболочки. Для ДНК-содер­					ный, который может приводить к
жащих вирусов только ранние вирус­					формированию			нового "слитного" ге­
ные гены ответственны за трансфор­					на, содержащего как вирусные, так и
мацию клеток.					клеточные		последовательности				с не­
Что касается	молекулярных меха­				известными		функциями		(см.		схему
низмов действия, то он связан с нали­					5.4). Однако количество таких новых
С х е м а	5.4. Функции вирусных онкогенов
			Вирусы папиллом .
Ген Е6		-	инактивация гена - супрессора р53
Ген	E7	-	инактивация гена - супрессора pRb					105
	-	взаимодействие			с циклинами
		(регуляторы		клеточного		цикла)

Вирус Эпстайна-Барр

Гены EBNA-LP - взаимодействие с циклином D2,

иEBNA 2 взаимодействие с геном резистентности

кинтерферону (IFN)

Гены LMP и EBNA 3 - взаимодействие с геном bcl 2

Вирус герпеса 8-го типа (HHV 8)

Гены EBNA 2

и EBNA - LP - взаимодействие с циклином D2 Гены LMP 1 и EBNA 3 - взаимодействие с bcl 2

Ген gp340/220 - взаимодействие с интерлейкином 6 (IL 6) Ген EBNA 2 - ген резистентности к интерферону (INF)

Вирус гепатита В

Ген Х- активация транскрипции собственных и других

вирусных генов, трансактивация некоторых факторов транскрипции

Вирус Т-клеточного лейкоза человека (HTLV I)

Ген Tax - транс-активация генов нескольких факторов роста,

интерлейкинов, протоонкогенов

283

идентифицированных "слитных" генов

лот),

которые

синтезируются

со

невелико и их роль в канцерогенезе

сплайсированных Р Н К и, по-видимо­

неизвестна.

му, осуществляют разные функции.

Белок большего размера участвует в

5.2.8.1. Аденовирусы

транспорте

вирусных м Р Н К из ядра в

цитоплазму и, кроме того, может

Для

клеток,

трансформированных

взаимодействовать с продуктом гена-

аденовирусами,

характерно

присутст­

супрессора

опухолевого

роста р53,

что

вие большей части вирусных последо­

позволяет

предполагать

важную

роль

вательностей в интегрированной фор­

этого белка в процессах канцероге­

ме, но во всех типах трансформиро­

неза.

ванных

клеток

всегда

присутствуют

только

последовательности,

локализо-

5.2.8.2. Вирусы группы

ванные в "левой" части вирусной

полиомы

ДНК . Данные по трансформации раз­

личных

фрагментов

вирусного

генома

Два

основных

представителя

этой

четко показали, что именно последо-

группы — вирус полиомы мышей и

вательности "ранней"

части

генома

SV40 обезьян — высокородственны по

контролируют

процесс

трансформа­

структуре генома, но различаются по

ции. Последующие исследования вы­

его организации и функциям ранних

явили внутри этого участка две разли-

генов,

ответственных за

трансформа­

чающиеся

транскрипционные

едини­

цию. Оба вируса кодируют мульти-

цы,

кодирующие стабильные

мРНК,

функциональный

белок,

получивший

которые обнаруживаются в

цитоплаз­

название большой Т-антиген, кото­

ме трансформированных клеток и на

рый участвует в инициации реплика­

ранних

фазах

продуктивной

инфек­

ции вирусной Д Н К путем специфиче­

ции. Эти две транскрипционные еди­

ского связывания с участком начала

ницы, обозначаемые как Е1А и Е1В,

репликации (origin of replication). Хотя

кодируют два основных типа м Р Н К

такая способность является

необходи­

путем

альтернативного

сплайсинга

мой для

репликации Д Н К

и

продук­

двух первичных транскриптов. Основ-

тивной инфекции, эта активность не

ные продукты гена Е1А представлены

является

необходимой

для

трансфор­

белками, состоящими из 289 и 243

мации. Другие же активности Т-анти-

аминокислот,

которые

идентичны по

гена и, в частности, способность свя­

первичной структуре, но один из бел­

зываться

с

различными

клеточными

ков имеет дополнительные 43 амино­

белками,

контролирующими

проли­

кислоты в середине белковой после­

ферацию

клеток,

являются

опреде­

довательности. Белок большего разме­

ляющей

для

трансформации,

при

ра необходим для активации транс­

этом функции Т-антигена SV40 и ви­

крипции при литической инфекции, и

руса полиомы хотя и перекрываются,

за это ответственны

последовательно­

но тем не менее отличны друг от дру­

сти, локализованные в 3'-области это-

га. Так, оба из них способны связы­

го

гена

(домен

CR3).

Указанная ак-

ваться с Rb, но только большой Т-ан­

тивность

не

является

необходимой

тиген

SV40

способен

связываться с

р53.

для проявления трансформации. Дру­

гие домены белка Е1А способны взаи­

Оба вируса кодируют также низко­

модействовать

со многими

клеточны­

молекулярный белок (малый t-анти-

ми белками, включая продукт гена ре-

ген), который содержит как последо­

тинобластомы

(Rb),

однако

прямых

вательности, общие с таковыми на N-

доказательств

роли

такого

взаимодей­

конце большого Т-антигена, так и

ствия пока не получено. Ген Е1В ко­

уникальные. Одной из основных ми­

дирует два белка — 55 кДа (495 ами-

шеней его действия является транс­

нокислот)

и

19

кДа (175

аминокис-

крипционный

фактор

E2F.

Именно

284

малый t-антиген играет ключевую роль в трансформации, которая с большей эффективностью проявляет­ ся при взаимодействии с большим Т- антигеном.

В отличие от SV40 вирус полиомы кодирует еще один ранний белок — средний Т-антиген, который играет ключевую роль в трансформации кле­ ток под действием вируса полиомы. Средний Т-антиген также имеет на Ν- конце общие последовательности с большим Τ и малым t-антигенами. В отличие от других трансформирующих белков вирусов полиомы и аденовиру­ са, которые локализованы в ядре, средний Т-антиген вируса полиомы является интегральной частью плазма­ тической мембраны и способен акти­ вировать некоторые киназы, участ­ вующие в передаче сигнала.

5.2.8.3.Вирусы папиллом

Увирусов папиллом в отличие от вируса полиомы и SV40 считывание информации происходит только с од­ ной нити Д Н К , при этом синтезиру­ ются различные типы Р Н К . Образо­

вание различных форм Р Н К связано с тем, что в процессе их синтеза ис­ пользуются альтернативные сайты инициации транскрипции, альтерна­ тивный сплайсинг и альтернативные сайты полиаденилирования. Эти ви­ русы содержат 7 генов, два из кото­ рых (LJ и L2) кодируют белки вирус­ ной оболочки, а пять других (E1, Е2, Е4, Е5, Е6, Е7) относятся к группе ранних, причем только два гена (Е6 и Е7) связаны со злокачественной трансформацией клеток. Механизм действия этих генов сводится к взаи­ модействию с продуктами двух ге- нов-супрессоров р53 и Rb и после­ дующей их инактивации, что приво­ дит к неконтролируемому росту. По­ скольку вирусы этой группы играют ключевую роль в развитии опухолей шейки матки у человека, детально вирусы этой группы и механизм их действия рассмотрены в специальном разделе 5.3.

5.2.9. Общие механизмы действия онкобелков ДНК-содержащих вирусов

5.2.9.1. Инактивация функций белка гена ретинобластомы

Как было описано выше, белок Е1А аденовирусов, Т-антиген вируса SV40 и белок Е7 вируса папиллом способны взаимодействовать с белком гена ретинобластомы. В это взаимо­ действие вовлечены полипептидные последовательности, нужные и для проявления трансформирующего по­ тенциала. Исследование роли белков Е1А в транскрипционной активации вирусных генов позволило идентифи­ цировать вирусный транскрипцион­ ный фактор E2F, который оказался необходимым для транскрипции аде­ новирусного гена Е2. Этот транскрип­ ционный фактор находится в боль­ шинстве клеток в комплексе с други­ ми белками, и в таких комплексах фактор E2F не функционирует. Белок Е1А разрушает такие комплексы, и освобождающийся E2F может исполь­ зоваться для транскрипции гена Е2. Способность Е1А вызывать эту диссо­ циацию оказалась зависимой от ви­ русных последовательностей, необхо­ димых для проявления онкогенного потенциала, включая способность связываться с Rb. Кроме того, было показано, что белковые комплексы, включающие Rb, способны связывать­ ся с Д Н К , и специфичность этого связывания определяется последова­ тельностями, узнающими E2F. Эти данные привели к выводу, что транс­ крипционный фактор E2F физически связан с Rb-белком и белок Е1А раз­ рушает этот комплекс, освобождая E2F и в свою очередь связываясь с Rb.

Кроме Rb, с Е1А способны взаи­ модействовать два Rb-родственных белка — p 107 и p 130 (так называемые pocket-белки), которые также нахо­ дятся в ассоциации с фактором E2F.

Т-антиген SV40 и белок Е7 HPV действуют по тому же принципу, раз­ рушая комплекс Rb/E2F.

285

Связывание Rb или родственных белков с E2F ингибирует активационные возможности фактора E2F, не влияя при этом на ДНК-связующие свойства. Для аденовируса активация E2F играет важную роль в продуктив­ ной инфекции, поскольку E2F акти­ вирует промотор гена Е2, необходи­ мого для синтеза вирионов. В геноме SV40 и HPV отсутствуют Е2Р-связую- щие сайты и, следовательно, E2F мо­ жет активировать какие-то иные кле­ точные гены, участвующие в процес­ сах трансформации. По-видимому, мишенями могут служить гены, спо­ собные активировать переход клеток из G1 в S-фазу клеточного цикла. Возможными кандидатами для акти­ вации могут быть также различные транскрипционные факторы. Кроме того, возможно взаимодействие Rb с циклинами D-типа, что также может контролировать клетки в течении G1 стадии клеточного цикла.

5.2.9.2. Инактивация функций

р53

Ген р53 относится к числу геновсупрессоров и часто подвергается му­ тациям в опухолевых клетках.

Каждый из ДНК-содержащих ви­ русов кодирует белок, который спосо­ бен взаимодействовать с белком р53 и как результат — инактивировать функции р53. В отличие от Rb в каж­ дом из вирусных белков последова­ тельности, взаимодействующие с р53, различаются между собой. Разные ви­ русные белки узнают разные последо­ вательности в гене р53, причем это свойство может отличать вирусы внут­ ри одной группы. Так, Т-антиген ви­ руса SV40 способен взаимодейство­ вать с р53, в то время как Т-антиген вируса полиомы этой способностью не обладает.

Несмотря на то что механизм взаи­ модействия Е1В аденовирусов, Т-ан­ тигена SV40 и гена Е6 вируса папил­ ломы с р53 не является консерватив­ ным механизмом из-за различия во взаимодействующих последовательно­

стях, конечный результат этого взаи­ модействия один и тот же — потеря функций р53. Если взаимодействие Т- антигена с р53 приводит к стабилиза­ ции р53 в его неактивной форме, то взаимодействие белка Е6 HPV с р53 приводит к деградации за счет актива­ ции убиквитиновой системы.

Какие же нормальные функции р53 нарушаются вирусными генами? По-видимому, это прежде всего функ­ ционирование р53 в качестве транс­ крипционного фактора. Белок р53 способен взаимодействовать с опреде­ ленными последовательностями в Д Н К , которые могут выполнять функ­ ции промоторов. Одним из таких ге­ нов является WAF1, 21 кДа белок ко­ торого идентифицирован как ингиби­ тор Gl-циклинкиназной активности. Эта киназа является критической для прогрессии G1-стадии клеточного цикла и пролиферации клеток.

Инактивация функции р53 вирус­ ными онкогенами может нарушать нормальные функции еще одного кле­ точного гена — mdm2. Увеличение продукции этого гена приводит к ак­ тивации функций р53.

Необходимо отметить еще одну важную функцию онкобелков — ин­ дукция апоптоза. Интересно, что сочетанное действий Е1А и Е1В аденовиру­ сов приводит к онкогенной трансфор­ мации чувствительных клеток в культу­ ре, в то время как экспрессия только Е1А приводит к противоположному эффекту — апоптозу. Сходный эффект проявляется и в системе с вирусами папиллом — гены Е6 + Е7 вызывают трансформацию определенных клеточ­ ных линий, в то время как ген Е7 в одиночестве — апоптоз.

Следовательно, инактивация генов-

супрессоров является одним из основ­ ных механизмов проявления онкогенного потенциала ДНК-содержащих виру­ сов. Однако существуют и другие пу­ ти, приводящие к реализации этого потенциала и связанные главным об­ разом с активацией других клеточных генов, контролирующих процессы пролиферации клеток.

286