5 курс / Пульмонология и фтизиатрия / Бронхиальная_астма_В_2_томах_Том_1_Чучалин_А_Г_1997

Таблица 2

Показатели (отн.ед) и скорость (отн.ед/мин) агрегации тромбоцитов у больных бронхиальной астмой (М±ш)

Индуктор	Форма заболевания		Доноры
	Атопическая	Аспириновая	(п=8)
	бронхиальная астма	бронхиальная астма
	(п=7)	(п=6)
ФАТ 10-6 М	244,6134,1**	267.6138.4**	93,2±21,5
	50,0±7,8 **	42,0±2,9 **	23,0±3,4
ю - 7 м	95,3±28,3 *	175,6±40,3 *	17,616,4
	27,0±4,4 *	27,8± 3,8 *	8,3±2,2
ю - 8 м	13,1±2,6 *	59,5± 19,3 *	6.112.3
	3,6±0,1	17,7±4,7 *	6,012,3
АДФ 10 мкм	343,8123,3**	249,4±43,7*	131,3114,9
	55,5±9,1 *	37,9±6,6	33.816.2
4 мкм	212,3±43,5	205,2±43,0 *	110.6118.2
	44,4± 12,4 *	32,9±4,7	28,1+4,9
2 мкм	186.9±45.1 *	139.7±38.9 *	59.8111.7
	37,7± 10,9	27,4±4,8	22,115,8

Примечание. В числителе показатель агрегации, в знаменателе — скорость. Звездочки —различия создоровымидонорами достоверны (одна —р<0,05; две —р<0,01)

Статистически достоверных различий показателей тромбоцитарной аг­ регации в двух группах изучаемых больных нами выявлено не было. Одна­ ко следует отметить, что различия в агрегационных ответах тромбоцитов, индуцированных ФАТ, у больных атопической и аспириновой формами бронхиальной астмы были более значимыми при использовании низких доз агониста. Возможная причина более высоких агрегационных ответов на низкие дозы ФАТ у больных аспириновой формой заболевания связана с тем, что у больных атопической бронхиальной астмой отмечается более высокое содержание ФАТ в крови, что приводит к развитию феномена десенситизации рецепторов и снижению чувствительности тромбоцитов атопиков к воздействиям низких концентраций агониста (Алиева,1992).

Таким образом, исследование тромбоцитарной агрегации у больных бронхиальной астмой двумя различными методами выявило значительное ее усиление при воздействии различных агонистов. Метод лазерной нефе­ лометрии позволил отметить некоторые отличия агрегационных ответов

110

тромбоцитов при их индуцировании малыми дозами таких слабых агони­ стов, как ФАТ, у больных с различными формами заболевания.

Изучение метаболизма внутриклеточного кальция в тромбоцитах

Агрегация, то есть процесс прилипания тромбоцитов друг к другу, ини­ циируется агонистами агрегации, действие которых подчиняется общим закономерностям, одной из которых является мобилизация кальция из его внутри- и внеклеточных депо. Кальций участвует в активации тромбоци­ тов через эффекторные пути, опосредованные кальмодулинзависимой протеинкиназой, Са-зависимыми протеазами (фосфолипазы А и С) и протеинкиназой С (Кго1,1989). В неактивном состоянии в тромбоците содер­ жится около 100 нмоль кальция, а при стимуляции агонистами концент­ рация кальция повышается до микромолярных концентраций.

При изучении внутриклеточного содержания кальция с помощью флю­ оресцентного зонда “Fura-2” по методу Tsien (1982) у больных бронхиаль­ ной астмой нами выявлено значительное повышение базального и стиму­ лированного агонистом уровня кальция (табл.З), что свидетельствует как об исходном нарушении метаболизма внутриклеточного кальция, так и о высокой чувствительности тромбоцитов к медиаторным воздействиям.

Таблица 3

Содержание внутриклеточного кальция (нм)

в тромбоцитах больных бронхиальной астмой (М±ш)

Кальций	Форма заболевания		Доноры
	Атопическая	Аспириновая	(п=10)
	бронхиальная астма	бронхиальная астма
	(п=11)	(п=7)
Базальный	316,9± 19,3*	278,6± 26,9*	146,1±3,9
Стимулированный
ФАТ 10 " М	536,5±75,0*	519,7±45,5*	13,8±3,8
ФАТ 10-7 М	1654,4± 138,7*	1227,0± 121,9*	539,5±63,7

Примечание. Звездочка — различия со здоровыми донорами достоверны (р<0,05)

111

Секреция АТФ тромбоцитами больных бронхиальной астмой

Тромбоциты человека - секреторные клетки. При активации, в ходе ре­ акции высвобождения, они секретируют большое количество биологиче­ ски активных субстанций, в частности АТФ, серотонин, катехоламины, ФАТ, продукты метаболизма арахидоновой кислоты (Holmsen,1979).

Секреция тромбоцитами АТФ изучалась нами люциферин-люцифераз- ным методом при индуцировании агрегации различными дозами тромби­ на с использованием люмиагрегометра “Chronolog” (США).

Результаты исследований показали, что тромбининдуцированная сек­ реция АТФ тромбоцитами повышена у больных бронхиальной астмой в сравнении с группой здоровых доноров (табл.4).

Таблица 4

Секреция АТФ (нмоль) тромбоцитами больных бронхиальной астмой (М±ш)

Индуктор	Форма заболевания		Доноры
	Атопическая	Аспириновая	(п=9)
	бронхиальная астма	бронхиальная астма
	(п=7)	(п=4)
Тромбин 0,1 ед/мл	1,56±0,29*	1,2±0,05*	0,92±0,16
0,05 ед/мл	1,2±0,24 **	1,1±0,05 **	0,61±0,09

Примечание. Звездочка — различия со здоровыми донорами достоверны (одна —р<0.05; две —

р<0.01)

Наши результаты согласуются с данными Yasuba (1991) и отражают по­ вышенную готовность тромбоцитов больных бронхиальной астмой к вы­ делению биологически активных веществ.

Содержание ФАТ в плазме крови больных бронхиальной астмой

Среди многочисленных биологически активных субстанций, выделяе­ мых тромбоцитами, ФАТ является наиболее сильным идентифицирован­ ным на сегодняшний день спазмогеном. Существует большое количество исследований, подтверждающих роль ФАТ как медиатора астмы и гипер­ реактивности дыхательных путей.

Интратрахеальное введение ФАТ человеку вызывает бронхиальную об­ струкцию, отек слизистой, усиленное образование слизи и аккумуляцию

112

эозинофилов в легких (Wardlaw, 1990). Определение ФАТ в тканях и био­ логических жидкостях сопряжено с большими трудностями вследствие ни­ чтожно малого его содержания и довольно быстрого разрушения. В работе Nakamura (1987) впервые было показано повышение уровней ФАТ в крови больных бронхиальной астмой во время позднего астматического ответа.

При определении уровней ФАТ радиоиммунологическим методом по­ сле экстракции фосфолипидов плазмы крови по методу Bligh (1959) нами было показано, что у здоровых лиц в плазме крови регистрируются лишь следы ФАТ. При исследовании содержания ФАТ в крови больных бронхи­ альной астмой установлено значительное его повышение как в период обо­ стрения, так и ремиссии заболевания (табл.5). Интересно, что максималь­ ные показатели содержания ФАТ были отмечены нами у больных атопи­ ческой бронхиальной астмой, характеризующихся поливалентной сенси­ билизацией и наличием сопутствующих аллергических заболеваний —ато­ пического дерматита и рецидивирующего отека Квинке.

			Таблица 5
	Содержание ФАТ (пг/мл) в плазме крови
	больных бронхиальной астмой (М±ш)
	Форма заболевания	Стадия
		обострение	ремиссия
	Атопическая
	бронхиальная астма	3682,7±487,9*	697,8+154,9
	Аспириновая
	бронхиальная астма	1910,71310,6*	401,4±80,8

Примечание. Звездочка —различия с показателями в фазуремиссии достоверны (р<0,01)

113

Заключение

Результаты проведенных исследований показывают, что тромбоциты больных бронхиальной астмой претерпевают существенную морфологи­ ческую перестройку. У больных бронхиальной астмой увеличено содержа­ ние мегатромбоцитов и снижено количество нормотромбоцитов, отмеча­ ется трансформация их формы из дисковидной в сферическую, увеличи­ вается количество тромбоцитов с псевдоподиями и нарушениями ультраструктурной организации.

На сегодняшний день в литературе нет единого мнения о причинах столь выраженной тромбоцитарной гетерогенности. Предполагается, что коли­ чество мегатромбоцитов возрастает при повышенной их деструкции и ути­ лизации. При исследовании кинетики тромбоцитов с помощью радиоак­ тивной метки было установлено, что у больных бронхиальной астмой сред­ няя продолжительность жизни тромбоцитов значительно уменьшена (Taytard ,1986). Это ведет к активации процессов тромбообразования и преобладанию в циркуляции молодых тромбоцитов, имеющих больший объем и повышенную метаболическую активность (Hirch,1972). В то же время существует мнение,что между возрастом тромбоцитов и их разме­ рами не существует какой-либо связи, а свойства тромбоцитов строго де­ терминированы в тромбоцитопоэзе и во время циркуляции не просходит значительныхизменений ихобъема, плотностии реактивности (Penington, 1976). Кроме общепризнанной теории костномозгового происхождения тромбо­ цитов, ряд авторов выдвигают предположение об их активном образова­ нии в легких, точнее в легочном кровообращении, где,по их мнению, про­ исходит физикальная фрагментация мегакариоцитов и образование раз­ личных по размеру и физиологической активности тромбоцитов (Martin, 1983). Изменения в сосудах легких, связанные с гипоксией, могут вести к уменьшению количества звеньев фрагментации мегакариоцитов и обуславливать образование крупных тромбоцитов у больных бронхиаль­ ной астмой, тем более, что, как было замечено,кратковременная кислородотерапия, устраняющая гипоксическую вазоконстрикцию сосудовлегких, ведет к редукции размеров тромбоцитов (Wedzicha,1988).

Наши исследования свидетельствуют, что выраженные морфологичес­ кие нарушения тромбоцитов, отмеченные у больных бронхиальной аст­ мой, являются отражением их активного участия в патологическом про­ цессе. Hosford (1990) предполагает, что для больных бронхиальной астмой характерен феномен так называемого предвоспаленного легкого, являю­ щегося основой сенсибилизации и выявляемого при изучении активнос­ ти разнообразных клеток-мишеней, в том числе и тромбоцитов. При изу­

114

чении функциональной активности тромбоцитов у больных бронхиаль­ ной астмой нами отмечена активация клеток на всех ее этапах —от изме­ нения структуры клетки до процессов агрегации и секреции.

Нами проводилось тщательное изучение агрегационной способности тромбоцитов при воздействии ряда различных агонистов (ФАТ,АДФ, тром­ бина) двумя методами —Борна—О’Брайна (по изменению светопропускания) и корреляционной фотометрии ( по изменению среднего радиуса об­ разующихся агрегатов). Столь детальный подход был обусловлен тем, что данные литературы по этому вопросудовольно противоречивы. Так, Harwell (1973) отмечает отсутствие каких-либо изменений тромбоцитарной агре­ гации при бронхиальной астме, в исследованиях Астафьевой (1989), PalmaCarlos (1989) показано снижение агрегационной способности тромбоци­ тов у больных аспириновой бронхиальной астмой. Наши исследования показали преобладание гиперагрегационных ответов тромбоцитов, что нашло подтверждение и в целом ряде других исследований (Домникова, 1989; Евсюкова, 1991). Более того, при изучении размеров, формы, ульт­ раструктуры тромбоцитов и ряда их функциональных характеристик про­ слеживается отчетливая взаимосвязь между ними. Например, известно, что активация контрактильной системы тромбоцитов сопровождается значи­ тельным ростом концентрации цитоплазматического кальция. Обнаружен­ ные нами нарушения элементов цитоскелета согласуются с выявленным повышением базального и стимулированного уровней внутриклеточного кальция в тромбоцитах у больных бронхиальной астмой. Известно, что значительное повышение внутриклеточной концентрации ионов кальция нередко приводит к гибели клетки вследствие ее гиперактивации и исто­ щения. Очевидно, именно этим можно объяснить и появление большого количества “пустых”, лишенных грануломера, тромбоцитов, отмеченных нами при тяжелых формах бронхиальной астмы. Распад периферического кольца микротрубочек, поддерживающих дисковидную форму тромбоци­ тов, приводит к изменению ее на сферическую, что в свою очередь ведет к повышению способности тромбоцитов к агрегации и высвобождению со­ держимого гранул. Предполагают, что именно измененные тромбоциты приобретают возможность соприкасаться большей поверхностью, это при­ водит к их повышенной агрегации.

Таким образом, в результате комплексных морфофункциональных ис­ следований с использованием методов электронной микроскопии, оцен­ ки размеров тромбоцитов, их агрегации, секреции и изучения метаболиз­ ма внутриклеточного кальция было показано, что для бронхиальной аст­ мы характерна выраженная активация тромбоцитов, обусловленная вовле­ чением этих клеток в процессы аллергического воспаления и формирова-

115

ния гиперреактивности дыхательных путей при этом заболевании. В кро­ ви больных с атопической и аспириновой формами бронхиальной астмы отмечено высокое содержание одного из самых мощных медиаторов ал­ лергического воспаления —ФАТ, что подчеркивает близость патогенети­ ческих процессов при этих двух формах заболевания. ФАТ-индуцирован- ная активация тромбоцитов является важнейшим промежуточным звеном в патогенетической цепочке: триггерное воздействие-легочная эозино­ фильная аккумуляция-воспаление-бронхиальная гиперреактивность. Уточнение его роли и места требует дальнейшего изучения.

Результаты исследований оправдывают поиск новых подходов к лече­ нию бронхиальной астмы, связанный с коррекцией тромбоцитарных функ­ ций. Установлено, что кромогликат натрия и кетотифен подавляют ФАТиндуцированное накопление тромбоцитов в дыхательных путях экспери­ ментальных животных (Smith, 1989).

Другое направление связано с синтезом специфических антагонистов ФАТ-рецепторов. В экспериментах на животных было показано, что со­ единения типа BN 52021, WEB 2086 уменьшают проявления поздней аст­ матической реакции, эндотелиальное повреждение и аккумуляцию мече­ ных тромбоцитов в легких (Pretolani, 1989; Barnes, 1989). Нами с этой це­ лью был предложен и апробирован в клинике тромбоцитаферез —экстра­ корпоральный метод селективного удаления тромбоцитов из циркуляции (Татарский,1991).

ЛИТЕРАТУРА

Алиева К.М. Нарушения морфофункционального состояния тромбоцитов и их коррекция методом тромбоцитафереза у больных атопической и аспириновой бронхиальной астмой. Дисс.канд.мед.наук., М,1992.

Астафьева Н.Г. Роль тромбоцитов в развитии аллергических заболеваний.-Авто- реф.дисс.докт.мед.наук. Киев, 1989.-37с.

Вашкинель В.К.,Петров М.Н. Ультрастуктура и функция тромбоцитов человека. J I Наука, 1982.-88 с.

Габбасов З.А., Попов Е.Г., Гаврилов И.Ю. и др. Новый высокочувствительный метод анали­ за агрегации тромбоцитов. Лаб.дело. 1989,10:15-18.

Доминикова Н.П., Сидорова Л.Д., Логвиненко А. С и др. Состояние тромбоцитарного звена гемостаза у больных инфекционно-зависимой бронхиальной астмой.Тер.арх. 1989, 3:18-20.

Евсюкова Е.В. Особенности функциональной активности тромбоцитов у больных “аспи­ риновой” бронхиальной астмой. Клин. мед. 1991, 9: 26-29.

Татарский А.Р., ЭмироваА.С. Роль тромбоцитов в патогенезе некоторых форм бронхиаль­ ной астмы. Тер.арх. 1990, 3: 149-151.

Татарский А.Р., Эмирова А.С., Бобков Е.В. Изучение функционального статуса тромбоци­ тов у больных различными формами бронхиальной астмы. Пульмонология. 1993, 3: 31-38.

ЧерняевАЛ ., Воронина Л.М., Татарский А.Р., Алиева К.М. Электронно-микроскопическая характеристика тромбоцитов крови больных бронхиальной астмой при тромбоцитаферезе. Пульмонология. 1993, 3:38-47.

116

Barnes P. PAF antagonists in asthma. Lancet. 1989,13:1071-1088.

Bligh E., Dyer W. A rapid method oftotal lipid extraction and purification. Can.J.Biochem.Physiol. 1959, 37:911-17.

Born G. Aggregation of blood platelets by adenosine diphosphate and its reversal. Nature.1962, 194. (4832): 927-9.

Harwell М., Patterson J., Lieberman P. et al. Platelet aggregation in atopic and normal patients. J.Allergy Clin.Immunol. 1973, 51: 274-284.

Hirch J. Platelet age: its relationship to platelet size, function and metabolism. Br.J.Haematol. 1972, 23 (Supl.): 209-14.

Holmsen H., Weiss H. Secretable storage pools in platelets. Ann.Rev.Med. 1979, 30:119-34. Holmsen H. Physiological (Unction of platelets. Ann.Med. 1989, 21(1): 23-30.

Hosford D., Mencia-Huerta J., Braquet P. Platalet-activating factor (PAF) and PAF antagonists in asthma. Crit.Rev.Ther.Drug.Carrier Syst. 1990,17(3): 261-73.

Joseph М., Capron A., Ameisen J. The receptor for IgE on blood platelets. Europ.J.Immunol. 1986,

16:306-312.

Krol М., SchaferA. Biochemical mechanisms ofplatelet activation. Blood. 1989, 74:1181-1195. Lazaro F., Ruiz J., Ciordia M. et al. Actividad plaanetaria tamano plaquetario у asma.

Rev.Clin.Espan. 1989, 184(7): 393-4.

Martin J., Slater D., Trowbridge E. Abnormal intrapulmonary platalet production: a possible cause ofvascular and lung disease. Lancet. 1983,1: 793-796.

MorleyJ., Page C. Platelets in asthma. Lancet. 1984, 2:1143-1144.

Nakamura Т., Morita G., Kuriyama M etal. Platelet activating factor in late asthmatic responce. Int.Arch.Allergy Appl.Immunol. 1987, 82: 57-61.

O’Brien J.R. Platelet aggregation.P.2.Some results from a new method of study. J.Clin.Pathol., 1962,15(2): 452-8.

Page C.P., CoyleA. Platelets,eosinophils and asthma. Eur.Resp. J. 1989, 2(Supl.6): 483-487. Palma-Carlos М., Santos М., Palma-Carlos A. Aggregation plaquettaire dans l’asthme. Allergie et

Immunologie. 1989, 21(5): 177-182.

Penington D., Lee N., Roxburgh A., McGreddy J. Platelet density and size:the interpretation of geterogenecity. Brit.J.Haematol. 1976, 34: 365-76.

PolacekJ. Lyzosomal conceot of platelet secretion.Eur.J.Haemat. 1989, 50(Supl.l): 3-24. Pretolani M. From anti-asthma drugs to PAF acether antagonism and back.Present status.

Biochem.Pharmacol. 1989, 38:1373-1384.

Szczeklik A. Asthme.aspirine et leicotrienes. Bull.Eur.Physiopath. Resp. 1983,19(6): .531-538. Taytard A., Guenard H., Vuillemin L et al. Platelet kinetics in stable atopic astmatic patients.

Amer.Rev.Resp.Dis. 1986:134(5): 983.

Thompson C., Jacubovski I., Quinn P.,et al. Platelet size as a determinant of platelet function. J.Lab.Clin.Med. 1983,101(2): 202-213.

Tsien R., Pozzan Т., Ring T. Principle of measurement of free Ca2+ in platelets. J.Cell Biol. 1982, 94: 325-334.

Wardlaw A., Chung K., Moqbel R.et al. Effects of inhaled RAF in humans on circulating and bronchoalveolar lavage fluid neutrophils.Relationship to bronchoconstriction and changes in airway responsiveness. Amer.Rev.Resp.Dis. 1990,141(2): 386-92.

Wedzicha J., CotterF., Empey D. Platelet size in patients with chronic airflow obstruction with and without hypoxaemia. Thorax. 1988, 43:61-64.

White J., Gerrard G. Interaction of microtubules and microfilaments in platelet contractile physiology. Meth.Arh.Exp.Pathol. 1979, 9:1-39.

Yasuba H., Chihara J., Kino T. et al. Increased releasability of platelets products and reduced heparin-induced platelet factor 4 release from endothelial cells in bronchial asthma. J.Lipid mediat. 1991,4: 5-21.

Zucker-Franklin D. The submembranous fibrilsofhumanblood platelets. J.Cell Blood. 1970,47(1): 293-299.

117

6	Б.И. Шмушкович

Бета-адренергическая рецепция у больных бронхиальной астмой. Механизмы десенситизации

v/цним из основных патогенетических последствий воспаления дыха­

тельных путей, а также терапии больных бронхиальной астмой (БА) бетаагонистами, является генерализованное нарушение бета-адренергической рецепции. Концепция Szentivanyi (1968) подтверждается результатами ис­ следований последнего десятилетия, посвященных механизмам формиро­ вания гиперреактивности (ГР) бронхиального дерева. Они свидетельству­ ют о том, что десенситизация бета-рецепции, выявляемая в дыхательных путях астматиков (Van Koppen et al., 1989), может быть следствием дейст­ вия воспалительных медиаторов (Grandordy et al., 1987; Raaijmakers et al., 1989). Важность частичной блокады бета-рецепции в развитии ГР опреде­ ляется тем, что эта рецепторная система принимает участие в контроли­ ровании всех процессов, определяющих проходимость бронхов у млеко­ питающих (табл. 1).

Бета-2-адренорецепторы (Б2-АР) широко распространены в легких че­ ловека и животных, особенно плотно на эпителиальных клетках, в стен­ ках альвеол, а также, хотя и в меньшем количестве, в гладкой мускулатуре дыхательных путей и сосудов, в подслизистых железах (Мак et al., 1994).

Важность наличия бета-рецепторов в эпителии дыхательных путей, а подавляющее большинство (более 90%) рецепторов этого типа в клетках цилиндрического и базального эпителия составляет подтип Б2-АР (Kelsen et al., 1994), определяется, в частности, тем, что эти рецепторы участвуют в контролировании частоты биения ресничек эпителия и, следовательно, му­ коцилиарного клиренса (Kanthakumar et al., 1994), транспорта натрия и

118

воды, секреции слизи (Mardini et al., 1994), а также в регуляции тонуса кле­ ток гладкой мускулатуры бронхов. Активация эпителиальных бета-рецеп­ торов ведет к прямой бронхиальной миорелаксации. Кроме того, актива­ ция этих рецепторов может оказать влияние на тонус гладкой мускулату­ ры опосредованно, за счет регуляции мукоцилиарного клиренса и осво­ бождения провоспалительных медиаторов (Morrison et al., 1993).

Таблица

Бета-адренергическая рецепция контролирует:

Развитие легких плода Функцию эпителия бронхов

Тонус гладкой мускулатуры бронхов Пролиферацию гладкой мускулатуры бронхов Функциональную активность тучных клеток

Функциональную активность вторичных воспалительных клеток Функциональную активность Т-лимфоцитов Микрососудистую проницаемость Секрецию подслизистых желез

Функциональную активность альвеоцитов (продукцию сурфактанта) Функциональную активность парасимпатических ганглиев бронхов

Молекулярная структура системы бета-адренергический рецептор—АЦ включает в себя три белковых компонента (Swillens, Dumont, 1980; Stadel et al., 1982). Первым является рецептор клеточной поверхности, вторым — гуанин-нуклеотидсвязывающий белок (ГТФ-связывающий активирующий или ингибирующий белок Gs и Gi), играющий роль регулятора (регуля­ торная субъединица аденилатциклазы — АЦ) в связывании агонист-ре- цепторного взаимодействия с активацией или ингибированием третьего компонента — каталитической субъединицы АЦ.

В механизме активации этой системы важное значение имеет образова­ ние комплекса гормон (бета-агонист) + рецептор + ГТФ-связывающий белок, ответственного за высокий аффинитет рецепторного связывания. Этот комплекс является обязательным посредником гормонального сти­ мулирования скорости активации АЦ гуаниннуклеотидами (Stadel et al., 1980). Его высокая аффинность определяется связью между бета-рецеп­ тором и ГТФ-связывающим белком, который играет челночную роль в непрямой трансмембранной связи рецептора с каталитической субъеди­ ницей АЦ (Cassel et al., 1977). В присутствии ГТФ этот комплекс превра­ щается в два промежуточных соединения: гормон + рецептор (низкоаф­ финный бета-адренорецептор) и ГТФ-связывающий белок + ГТФ. Вдаль­ нейшем происходит образование активного энзимного комплекса (ГТФ-

119