2) Количественное определение ортофосфата методом Лоури-Лопеца

Принцип метода: Основан на образовании фосфомолибдатного комплекса (Н₇[Р(Мо₂О₇)₆] х nН₂О), который восстанавливают гидрохиноном и др. до молибденовой сини, колориметрируя затем интенсивность окраски. Белки, мешающие определению Фн, предварительно удаляют из проб общепринятыми способами. Один из самых простых и чувствительных (35-50 нмоль Фн на пробу) – метод Лоури-Лопеца, где восстановитель – аскорбиновая кислота.

Ход работы:1. За время инкубации системы брожения, каждая рабочая пара студентов маркирует 10 пробирок: 6 – для построения калибровочных проб и еще 4 – для разведенных центрифугатов.

2. В соответствии с таблицей 1, в пробирки 1-6 внести указанные объемы основного 10^-4М раствораNa₂HPO₄х 2H₂Oи дистиллята.

Таблица 1

Калибровка растворов для определения неорганического фосфата = Фн

3. Получив у дежурных мерные колбы 1 – 4 с разведенными центрифугатами исследуемых проб, отобрать из каждой по 2,7 мл раствора и, соответственно перенести их в пробирки 7 – 10.

4. Получить у лаборанта свежеприготовленные 1 % растворы:

а) молибдата аммония (NH₄)Mo₇O₂₄ х 4Н₂О в 6 н серной кислоте; б) аскорбиновой кислоты в 0,0005 н растворе сульфата меди (CuSO₄ х 5H₂O).

5. Во все 10 рабочих пробирок добавить по 0,4 мл 1 % раствора молибдата аммония.

6. Точно через 5 мин, также во все пробирки добавить по 0,4 мл 1% раствора аскорбата и, тщательно перемешав пробы, оставить их точно на 20 мин на столе для развития окраски.

7. Фотометрировать все 10 проб против воды, в кюветах на 5 мм и красном светофильтре, занося соответственно, результаты калибровки в таблицу 1, а исследуемых проб – в таблицу 2 протокола занятия.

9. На основании данных таблицы 2 построить калибровочный график зависимости А = абсорбции раствора от концентрации Фн в пробах.

10. С помощью калибровочного графика и, с учетом разведения проб в 50 раз, рассчитать и внести в таблицу 2 концентрации Фн в инкубационной среде.

Таблица 2

Динамика убыли ортофосфата в инкубационной среде

в процессе брожения

11. По результатам опыта, построить график динамики убыли фосфата в процессе брожения и сделать выводы.

2. Обнаружение продуктов дрожжевого сбраживания.

1. Обнаружение этилового спирта.

Из колбы системой брожения (смесь дрожжей и глюкозы), после окончания процесса инкубации (через 30-50 мин, при 37 ⁰С) отбирают 2-3 мл смеси в центрифужную пробирку и отфильтровывают, по алгоритму приведенному выше. В пробирку для качественных реакций поместить 1 мл надосадочной жидкости и добавить несколько капель 10% р-ра иодида (до получения желтого окрашивания), слегка нагреть. Через некоторое время ощущается характерный запах иодоформа. Значит, прошла реакции на обнаружение этилового спирта:

С₂Н₅ОН + 4I₂ + 6NaOH → CHI₃ + 5 NaI + HCOONa + 5H₂O

2. Обнаружение дегидрогеназы 3-фосфоглицеринового альдегида

Принцип метода: 3-фосфоглицериновый альдегид в ходе анаэробного превращения глюкозы дегидрогеназой 3-фофоглицеринового альдегида окисляется в 1,3-дифосфоглицериновую кислоту. При этом происходит восстановление НАД, который можно обнаружить по восстановлению метиленового синего в лейкосоединения.

ХОД РАБОТЫ

В пробирку вносят небольшое количество дрожжей, добавляют несколько капель 2% р-ра глюкозы, хорошо перемешать стеклянной палочкой до получения равномерной взвеси. Добавить 1-2 капли метиленового синего, перемешать стеклянной палочкой. Поставить пробирку в штатив и наблюдать за обесцвечиванием метиленового синего, процесс пойдет со дна пробирки. Сделать вывод.