6.Пример промышленного биотехнологического получения ферментов.

В производстве грибной амилазы главным компонентом питательной среды является смесь пшеничных отрубей и крахмала, иногда к ним добавляют белковые отходы, солодовые ростки, получаемые в производстве пива, соевую муку и т.п.

Для выращивания производственной культуры компоненты питательной среды смешивают, распределяют тонким слоем в кюветах, увлажняют мицелляльным раствором, содержащим небольшое количество хлористоводородной кислоты, стерилизуют при добавлении 0,15 МПа в течение одного часа, или острым паром в течение 30 мин, а затем охлаждают.

В охлажденную до 35 С питательную среду вносят суспензию спор Aspergillus oryzae.

Стерильную, засеянную спорами Aspergillus oryzae питательную среду, в кюветах помещают в камеры для выращивания, в которые подают очищенный воздух, с определенной температурой и относительной влажностью. Через 30 – 36 ч инкубации для культуры гриба Aspergillus oryzae в этих камерах при температуре 30 С развивается масса спорообразующего мицелия. Массу снимают, высушивают и измельчают для получения сырой амилазы или экстрагируют для получения очищенной амилазы.

Технологический процесс поверхностного культивирования данной культуры состоит из семи стадий:

1. Введение (получение и поддержка роста) чистой культуры в лабораторных условиях;

2. Приготовление посевного материала в отделении чистой культуры;

3. Подготовка питательной среды;

4. Выращивание производственной культуры;

5. Дробление готовой культуры;

6. Сушка;

7. Расфасовка и упаковка готовой продукции.

Описанная схема поверхностного культивирования требует значительных затрат ручного труда.

Более современный вариант, применяемый для крупнотоннажного производства поверхностных культур плесневых грибов, предусматривает использование механизированных растительных установок с разъемными кассетами и автоматической разгрузкой. При этом создается возможность выращивать в сутки 1,2 т культуры гриба.

Приготовленная, простерилизованная и засеянная культурой гриба Aspergillus oryzae питательная среда загружается в растительные камеры и по рельсовому пути подается в растительное отделение, через диффузоры к камерам подается кондиционированный воздух. Аэрирование культуры осуществляется через вертикальные каналы, имеющиеся между кюветами и через отверстия в стенках кювет. Система аэрации рассчитана на рециркуляцию и очистку воздушного потока, подсос свежего воздуха и поддержание условий, предотвращающих подсыхание выращиваемой культуры. Процесс культивирования проводят в течение 42 – 46 ч. После этого производят разгрузку растительных камер на вибрационном столе, отделив предварительно вертикальную стенку кюветы.

Освобожденная от культуры камера перемещается по рельсовому пути в моечное отделение, затем в стерилизатор и на вибрационный стол для новой загрузки.

Использование механизированной линии по выращиванию культуры гриба Aspergillus oryzae дает возможность поддерживать высокий уровень стерильности, что очень важно для целенаправленного синтеза амилазы. В случае необходимости можно оперативно локализовать и изолировать инфицированный материал безопасности заражения сопутствующей микрофлорой других камер.

Выращенную поверхностную культуру гриба передают на стадию экстракции, минуя операцию сушки, измельчения и фасовки, имеющих место при серийном производстве «амилорозиина - П».

Задание 2:

1. Произвести посев культуры продуцента фермента на сыпучий субстрат.

2. Установить основные принципы обнаружения ферментов в биологических объектах.

3. Ознакомится с основными свойствами ферментов.

1. Посев культуры продуцента фермента на сыпучий субстрат.

Посев микроорганизма-продуцента фермента на сыпучий субстрат осуществляют взвесью спор гриба стерильной пипеткой.

Взвесь спор гриба готовят путем смыва спор микроорганизма с поверхности агаризованной среды физиологическим раствором, которую затем переливает в стерильную колбу.

1. Протереть поверхность стола дезинфицирующим раствором.

2. Зажечь спиртовку.

3. Взять стерильную пипетку, завернутую в бумагу, осторожно освободить ее от бумаги, начиная с верхней части пипетки. Освобожденную от бумаги пипетку провести через пламя спиртовки.

4. Взять в левую руку пробирку со взвесью спор продуцента фермента.

5. Не выпуская из руки пипетки, мизинцем или безымянным пальцем правой руки прижать ватно-марлевую пробку пробирки к ладони, вынуть ее из пробирки. В пробирку ввести пипетку, набрать ее взвесь спор продуцента фермента. Вынуть пипетку из пробирки и закрыть ее снова ватно-марлевой пробкой.

6. Удерживая пипетку пальцами правой руки, захватить мизинцем и безымянным пальцем ватную пробку флакона (колбы), прижать ее к ладони и открыть флакон (колбу) около пламени горелки. Ввести пипетку, содержащую взвесь спор гриба в колбу с сыпучим субстратом, равномерно распределяя взвесь по всей поверхности зерна. Закрыть флакон (колбу) ватно-марлевой пробкой.

7. Пипетку опустить в стакан с дезинфицирующим раствором.

8. Флакон с сыпучим субстратом осторожно потрясти для равномерного распределения культуры по всей поверхности зерен перловой крупы.

Флакон или колбу с сыпучим субстратом, засеянный продуцентом фермента подписать и поместить в термостат при температуре 24 – 26 С. Продолжительность выращивания – 10 – 12 суток.

2. Определение активности ферментов.

Ферменты обнаруживают и оценивают по двум критериям:

1. по появлению продуктов реакции;

2. по исчезновению субстратов.

Ферменты проявляют специфичность в отношении субстратов и типа реакции. Активность ферментов зависит от температуры среды, рН среды, концентрации субстрата и концентрации фермента.

Вариант 1. Исследование специфических свойств ферментов.

Обнаружение активности ферментов.

а) Обнаружение активности амилазы слюны:

В пробирку наливают 0,5 мл слюны (разведение 1:10) и 1 мл 1 % раствора крахмала. Через 5 мин инкубации проводят реакцию на наличие крахмала, добавляя 1 – 2 капли раствора йода. Синее окрашивание не образуется.

б) Обнаружение активности уреазы:

В пробирку наливают 1 мл раствора мочевины, 2 капли фенолфталеина и мл вытяжки из арбузных семян (источник уреазы). Через 1 – 2 мин раствор приобретает малиновую окраску, так как происходит защелачивание среды аммиаком.

Количественное определение активности ферментов.

Количественная оценка активности фермента основывается на измерении количества образовавшегося продукта реакции или убыли субстрата в единицу времени, отнесенного к 1 мг белка или к 1 мл биологической жидкости.

Метод количественного определения активности амилазы слюны по Вольгемуту основан на определении наименьшего количества амилазы (при максимальном разведении слюны), полностью расщепляющего весь добавленный крахмал. Амилазная активность слюны выражается количеством 0,1 % раствора крахмала (мл), которое расщепляется 1 мл неразведенной слюны при 38 С в течение 30 мин. В норме амилазная активность слюны составляет 160 – 320.

В 10 пробирок наливают по 1 мл разведенной в 10 раз слюны. Содержимое этой пробирки перемешивают и 1 мл смеси переносят во 2-ю пробирку, содержимое которой перемешивают и 1 мл смеси переносят в 3-ю пробирку и т.д. до 10-й. Из 10-й пробирки 1 мл смеси выливают. Во все пробирки добавляют по 1 мл воды и по 2 мл 0,1 % раствора крахмала, перемешивают, встряхивают пробирки и помещают в термостат при 38 С на 30 мин. После инкубации пробирки охлаждают холодной водой, добавляют по 1 капле 0,1 % раствора йода и перемешивают. При реакции с йодом жидкость в пробирках окрашивается в желтый, красный, фиолетовый и синий цвета. Отмечают последнюю пробирку с желтой окраской, где гидролиз крахмала прошел полностью и делают расчет.

Отмечают номер пробирки (разведение слюны), где гидролиз прошел полностью. Записывают пропорцию Х мл слюны (разведение слюны для анализируемой пробирки) расщепляет 2 мл 0,1 % раствора крахмала:

У= (2*1)/Х.

3. Определение других свойств ферментов.

1. Определение термолабильности ферментов.

В чистую пробирку наливают небольшое количество разведенной в 10 раз слюны (2 мл) и кипятят ее в течение 2 – 3 мин, после чего охлаждают. В 3-ю пробирку наливают по 10 капель 1 % раствора крахмала. В 1-ю пробирку добавляют 10 капель слюны, разведенной в 10 раз; во 2-ю – 10 капель прокипяченной слюны; в 3-ю – 10 капель воды (в качестве контроля). Спустя 5 – 10 мин инкубации проводят реакцию с йодом на наличие крахмала.

2. Определение влияния рН среды на активность ферментов.

В 3 пробирки наливают по 2 мл буферных растворов с различными значениями рН: рН 1,0; рН 7,0; рН 10,0. Затем в каждую пробирку добавляют по 1 мл слюны (разведение 1:10) и по 1 мл 1 % раствора крахмала. Через 10 мин инкубации содержимое всех пробирок проверяют на наличие крахмала реакций с йодом.

3. Определение специфичности ферментов.

Уреаза катализирует гидролиз мочевины и не действует на тиомочевину, вещество, структурно сходное.

NH₂ – CS – NH₂.

Берут две пробирки. В 1-ю отмеривают 1 мл 1 % раствора мочевины, а во 2-ю – 1 мл 1 % раствора тиомочевины. В каждую пробирку добавляют по 2 капли фенолфталеина и по 1 мл вытяжки арбузных семян (источник уреазы). Содержимое обеих пробирок встряхивают, оставляют на несколько минут при комнатной температуре и наблюдают появление розовой окраски в пробирке с мочевиной и отсутствие окраски в пробирке с тиомочевиной.

Вариант 2. Определение активности L-аспарагиназы в бесклеточном экстракте микробных клеток E. coli.

Целью данной работы является освоение методики определения активности L-аспарагиназы (L-аспарагин-аминогидролаза), катализирующей необратимое дезаминирование

L-аспарагина. Аспарагин и аспарагиновая кислота осуществляют сопряжение азотного и углеводного обмена как аминокислота, образующаяся в процессе первичной ассимиляции аммония, и как метаболит, связанный с ЦТК происхождения своего углеродного скелета. Все это предопределяет взаимосвязи ферментов азотного и углеводного обмена с аспарагиназой. Основной функцией аспарагиназы совместно с глутаминазой и обеими синтетазами амидов является направление потоков углерода и азота для удовлетворения биосинтетических или биоэнергетических потребностей клетки.

L-аспарагиназа – фермент, получаемый из бактерий E. coli, обладающий специфическим избирательным действием на опухолевые клетки (лимфобластного лейкоза, лимфосаркомы, ретикулосаркомы и др.) и входящий в число 10 всемирно признанных лекарственных средств, наиболее широко используемых в терапии лейкозов. Чувствительность опухолевых клеток к L-аспарагиназе обусловлена зависимостью их роста от присутствия аспарагина, поэтому значительное уменьшение концентрации аспарагина в крови при введении в организм препаратов микробной L-аспарагиназы приводит к подавлению развития опухоли. В то же время микробная L-аспарагиназа мало влияет на нормальные кроветворные функции микроорганизма.

Сущность метода: В процессе дезаминирования L-аспарагина образуется аммиак, который в кислой среде образует аммонийные соли. Соли аммония при взаимодействии с реактивом Несслера дают желтое окрашивание:

L-аспарагин + вода  L-аспартат + аммиак.

Исследуемый материал: клетки культуры E. coli.

Техника выполнения работы: Получение бесклеточного экстракта белков: суточные или двухсуточные культуры E. coli, выращенные на мясопептонном агаре при 37 С смывают с косого агара холодным физиологическим раствором.

Бактериальные клетки разрушают растиранием с кварцевым песком в сочетании с попеременным замораживанием и оттаиванием или обработкой ультразвуком. Экстракцию белков проводят охлажденным 0,1 М фосфатным буфером, рН 7,4. Неразрушенные клетки удаляют центрифугированием на лабораторной центрифуге при 8000 об/мин в течение 20 мин.

Гидролазную активность L-аспарагиназы определяют прямой несслеризацией: в пробирку приливают 0,2 мл бесклеточного экстракта, 0,2 мл 0,1 М раствора L-аспарагина и 1,2 мл 0,1 М фосфатного буфера, рН 8,0. Общий объем пробы равен 1,6 мл. Реакционную смесь инкубируют 15 мин при 36 С в термостате. Ферментативную реакцию останавливают добавлением 0,4 мл 25 % раствора ТХУ. Осадок белков отделяют центрифугированием при 5000 об/мин в течение 5 мин и отбрасывают. Затем в пробирки отбирают 0,2 мл надосадочной жидкости и добавляют 4,3 мл очищенной воды и 0,5 мл реактива Несслера. Контролем служит проба, в которую добавлен 25 % раствор ТХУ перед внесением в инкубационную среду L-аспарагина. Через 10 мин опытные и контрольные пробы колориметрируют па ФЭКе при длине волны 49010 нм в пятимиллиметровых кюветах. По калибровочному графику определяют количество выделившегося аммиака в мкг.

Расчет: Активность L-аспарагиназы выражают числом единиц фермента в 1 мл бесклеточного экстракта. За единицу активности L-аспарагиназы принимают такое количество фермента, которое катализирует освобождение 1 мкмоля аммиака за 1 минуту при 37 С.

а*500

Активность фермента = ,

15*0,2

где а – количество выделившегося аммиака в мкг, найденное по калибровочному графику;

500 – разведение бесклеточного экстракта;

15 – время проведения ферментативной реакции, мин;

0,2 – объем взятого для проведения реакции бесклеточного экстракта, мл.

Литература:

1. Биологическая химия: Руководство к лабораторным занятиям/ Сост. Комов В.П., Шведова В.Н., Кириллова Н.В., Спасенкова О.М., Фирсова В.И., Троицкая Л.А. – СПб.: СПХФА. – 1998.

2. Биотехнология в 8-ми томах./ Под ред. Егорова Н.С., Самуилова В.Д. – М.: Высш.шк. – 1988.

3. Биотехнология: принципы и применения./ Под ред. Хиггинса И., Беста Д., Джонса Дж. – М.: Мир. – 1988.

4. Елинов Н.П. Основы биотехнологии. СПб.: ИФ Наук. – 1995.

5. Колесова В.Г., Марченко В.А., Сыровежко Н.В. Лекарственные растения: мифы и реальность. Традиционная (народная) медицина в объективе науки. – СПб.: СПХФА. – 1998. – 261 с.

3. Лекционный материал по биотехнологии.

4. Микробная биотехнология: Методическое пособие к лабораторным для студентов III курса факультета промышленной технологии лекарств/ Е.П. Яковлева, О.А. Алексинцева, Н.В. Котова, В.А. Колодязная. – СПб.: СПХФА - 2000. – 56 с.

5. Сельскохозяйственная биотехнология: Учеб. / Под ред. В.С. Шевелухи. – М.: Высш. шк. – 1988. – 416с.

6. Сассон А. Биотехнология: свершения и надежды./ Пер. с англ. Мехедова С.Л., Миркина С.М. – М.: Мир. – 1987. – 410с.

7. Словарь по биотехнологии / Симонян А.В., Покровская Ю.С. – Волгоград. – 2002.

8. Чуешов В.И. Промышленная технология лекарств: Учебник в 2-х т./ Под ред. Чуешова В.И. – Харьков: МТК-Книга; Издательства НФАУ. – 2002. – 716 с.

Темы рефератов.

1. Ферменты, используемые как лекарственные средства (протеолитические, амилолитические, липолитические ферменты).

2. Ферментные препараты как биокатализаторы в фармацевтической промышленности.

3. Примеры промышленного биотехнологического производства ферментных препаратов.

4. Проблемы стандартизации ферментных препаратов.

20