4. Окраска

Методы

простые сложные

(ориентировочные) (дифференцирующие)

1) окрашивают одним красителем 1) используют несколько краси-

анилинового ряда - основным или телей (основная и вспомога-

кислым: - кислый фуксин тельные краски, обесцвечи-

- эозин вающие жидкости (этанол)

- метиленовый синий - метод Грама

- окраска по Нейссеру

- генциановый фиолетовый - Гинса-Бурри

- Ожешко

2) используются для изучения 2) используются для определения

морфологии микроорганизмов морфологии, химического состава,

структуры микробных клеток

Преимущественно для окраски микроорганизмов используют основные красители, в которых красящий ион - катион.

Краситель наливают на поверхность мазка на определенное время, затем мазок промывают до тех пор, пока струи воды не станут бесцветными, осторожно высушивают фильтровальной бумагой. Если мазок правильно окрашен и промыт, то поле зрения абсолютно прозрачно, а клетки микробов интенсивно окрашены.

Методика окраски по Граму:

1 этап. Используется основная краска генциановый фиолетовый, затем раствор Люголя. Образуется прочное комплексное соединение «генциановый фиолетовый + йод». Все микробы окрашиваются в сине-фиолетовый цвет.

2 Этап. Обработка этанолом (дифференциация)

одни микробы другие микробы

сохраняют комплекс генциановый теряют комплекс генциановый

фиолетовый + йод, не обесцвечиваются фиолетовый + йод, обесцвечиваются. Это связано с тем, что: объясняется тем, что:

- клеточная стенка толстая, - клеточная стенка микробов тонкая,

- в ее состав входит много пеп- - пептидогликана мало,

тидогликана,

- имеются тейхоевые кислоты - тейхоевых кислот нет

- по строению клеточная стенка - структура клеточной стенки

представляет собой прочное мозаичная, рыхлая, поэтому

образование, поэтому после обра- после обработки этанолом поры

ботки этанолом поры клеточной остаются прежними, краска

стенки суживаются и краска не вымывается, микробы обесцве-

вымывается. чиваются

3 Этап. Окраска фуксином

одни микробы другие микробы

остаются сине-фиолетовыми, окрашиваются в красный цвет,

грамположительные: грамотрицательные:

1. Все кокки за исключением 1. Гонококки и менингококки

гонококков и менингококков

2. Все спорообразующие палочки 2. Большинство неспорообразующих

палочек

3. Из неспорообразующих бактерий 3. Спириллы

туберкулезная и дифтерийная палочки

4. Актиномицеты 4. Риккетсии

5. Грибы 5. Микоплазмы

Окраска по методу Грама не используется при изучении спирохет, простейших и вирусов.

Сущность метода окраски по Граму: отношение бактерий к окраске по Граму определяется их способностью удерживать образовавшийся в процессе окраски комплекс генцианового фиолетового и йода. У грамположительных бактерий основным веществом клеточной стенки (до 90%) являются мукопептиды-муреин (пептидогликан). У грамотрицательных бактерий однослойный муреин располагается в глубине клеточной стенки, значительно больше содержится белков и липидов, которые вместе с полисахаридами образуют поверхностные слои в виде мозаики, их цитоплазма содержит РНК и ДНК в соотношении 8:1 и 1:1 соответственно. Кроме того, проницаемость клеточной стенки у грамположительных бактерий меньше, чем у грамотрицательных. Это объясняется большим содержанием мукопептида в составе клеточной стенки грамположительных бактерий и меньшим диаметром пор, что способствует удержанию образовавшегося комплекса при обработке бактерий этиловым спиртом.

Другие методы окраски микроорганизмов.

Метод окраски кислотоустойчивых бактерий. Кислотоустойчивость обусловлена наличием в клеточной стенке бактерий повышенного количества липидов, воска, и миколовой кислоты. Раствор карболовой кислоты разрыхляет клеточную стенку и тем самым повышает её тинкториальные свойства, а высокая концентрация красителя и нагревание в процессе окраски усиливает реакцию взаимодействия красителя с бактериальными клетками, которые окрашиваются в красный цвет. Таким образом при обработке препарата серной кислотой некислотоустойчивые бактерии обесцвечиваются и окрашиваются метиленовым синим в голубой цвет, а кислотоустойчивые бактерии остаются окрашенными фуксином в красный цвет.

Методика окраски по методу Циля- Нильсена

1. На фиксированный препарат – мазок нанести карболовый раствор фуксина через полоску фильтровальной бумаги и подогреть до появления паров в течении 3-5 мин;

2. Снять бумагу, промыть мазок водой;

3. Нанести 5% раствор серной кислоты или 3% раствор смеси спирта с хлороводородной кислотой на 1-2 мин до обесцвечивания;

4. Промыть водой;

5. Докрасить мазок водным раствором метиленового синего в течении 3-5 мин;

6. Промыть водой, высушить, микроскопировать.

Метод окраски спор. Споры с трудом вступают в физико-химические реакции с различными веществами, в том числе и красками. Поэтому при обычных способах они не прокрашиваются, оставаясь бесцветными внутри окрасившихся тел бактерий. Для того, чтобы споры прокрасились, требуется специальная обработка мазка в виде предварительного прогревания в кислоте для размягчения оболочки, или «протравливания» и воздействия концентрированных растворов красок при высокой температуре. При этом споры настолько прочно адсорбируют краску, что не обесцвечиваются и становятся видимыми только при дополнительном окрашивании контрастной краской. Таким образом, применяемые способы окраски спор основаны на следующем принципе: сначала сильно прокрашивают весь препарат, затем частично обесцвечивают его, отнимая краску у вегетативных тел и оставляя её у спор, и, наконец, окрашивают вегетативные тела в дополнительный контрастный цвет.

Методика окраски по методу Ожешко

1. На нефиксированный мазок нанести 0,5% раствор хлороводородной кислоты и подогреть на пламени в течение 2-3 мин.

2. Кислоту слить, препарат промыть водой, просушить и фиксировать над пламенем. Затем окрасить по Цилю- Нильсену. Споры бактерий приобретают красный цвет, а вегетативные формы - синий.

Методы выявления включений. Зерна волютина – это запас питательных веществ, являющиеся внутриклеточным резервом фосфатов. Характерная особенность волютина – его способность к метахромазии, т.е. окраске в иной цвет, чем цвет красителя. Таким образом, зерна волютина представляют собой соединения, имеющие в отличии от цитоплазмы щелочную реакцию, и поэтому избирательно воспринимают ацетат синьки, окрашиваясь в темно- синий цвет. Цитоплазма клетки, обладающая кислой реакцией, воспринимает щелочной краситель везувин и окрашивается в желтый цвет.

Методика окраски по методу Леффлера (простой метод)

1. Фиксированный мазок окрасить метиленовым синим 3-5 мин.

2. Промыть препарат водой, высушить и ми кроскопировать.

Зерна волютина выглядят красно- фиолетовыми на голубом фоне цитоплазмы.

Методика окраски по методу Нейссера (сложный метод)

1. На фиксированный мазок нанести ацетат синьки Нейссера на 2-3 мин.

2. Добавить раствор Люголя на 10-30 сек.

3. Промыть мазок водой.

4. Мазок докрасить водным раствором везувина или хрезоидина в течение 0,5-1 мин.

5. Промыть мазок водой, высушить и микроскопировать.

Метод выявления капсулы. Многие микроорганизмы имеют капсулу, которая окружает микробную клетку в виде слизистого слоя. Капсулы могут быть различной величины и химического состава. Чаще они состоят из высокомолекулярных полисахаридов, реже в их состав входят белки. Основная функция капсул - защитная. Капсулы не воспринимают красители при обычных методах окраски. Для их выявления используют метод Бурри – Гинса.

Методика окраски по методу Бурри - Гинса (сложный метод)

1. Смешать каплю взвеси микробных клеток с каплей туши и при помощи стекла со шлифованным краем сделать мазок таким же образом, как мазок крови, высушить и зафиксировать.

2. На мазок нанести водный раствор фуксина на 1-2 мин.

3. Промыть водой, высушить на воздухе и микроскопировать.

Бактерии окрашиваются в красный цвет, а неокрашенные капсулы контрастно выделяются на черно - розовом фоне.

Методы, используемые для изучения нативных препаратов:

Метод «раздавленной» капли. На поверхность обезжиренного предметного стекла наносят каплю исследуемого материала или суспензию бактерий и покрывают ее покровным стеклом. Капля должна быть небольшой, не выходящей за край покровного стекла. Микроскопируют препарат с объективом 40х.

Метод «висячей» капли. Препарат готовят на покровном стекле, в центр которого наносят одну каплю бактериальной культуры. Затем предметное стекло с лункой, края которой предварительно смазывают вазелином, прижимают к покровному стеклу так, чтобы капля находилась в центре лунки. Быстрым движением переворачивают препарат покровным стеклом вверх. В правильно приготовленном препарате капля должна свободно висеть над лункой, не касаясь ее дна или края. Для микроскопии вначале используют сухой объектив 8х, под увеличением которого находят край капли, а затем устанавливают объектив 40х и исследуют препарат.

Прижизненная (витальная) окраска. Взвесь микроорганизмов вносят в каплю 0,001% раствора метиленового синего или нейтрального красного. Затем готовят препарат «висячая» или «раздавленная» капля и микроскопируют. После микроскопии препараты «висячей» или «раздавленной» капли опускают в дезинфицирующий раствор.

Самостоятельная работа во внеурочное время

1. Дайте определение:

а) морфологические свойства - __________________________________________________

__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________б) тинкториальные свойства - ____________________________________________________

__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

2. Заполните таблицу