Физико-химические закономерности взаимодействия антиген-антитело:

Процесс соответствующих взаимодействий, имитирующих те, которые доминируют в биохимических процессах и относящихся к нековалентным, получил название "молекулярное узнавание". Молекулярное узнавание можно определить как процесс, включающий в себя как связывание, так и выбор молекулы - "гостя" данной молекулой -"хозяином". Просто связывание молекул не является молекулярным узнаванием. Согласно Лену , "узнавание - это связывание с целью". Данное поведение характерно для многих биохимических процессов, таких как ферментативные реакции, связывание "рецептор-субстрат", сборка белковых молекул, иммунное взаимодействие антиген-антитело, транспорт через мембрану и т.д. Одним из критериев молекулярного узнавания является то, что константа ассоциации между "хозяином" и "гостем" является значительно более высокой по сравнению с константами образования комплексов между другими молекулами, присутствующими в системе. В связи с этим особое значение приобретает исследование энергетики межмолекулярных взаимодействий биомолекул. Энергетические параметры позволяют судить о силе взаимодействия, наличии или отсутствии ассоциации между молекулами, а также выявить и описать влияние растворителя на процесс молекулярного узнавания.

Иммуноферментный анализ - наиболее надежный, экономичный и высокочувствительный метод, применяемый для количественной оценки антител и антигенов. Его отличает простота проведения реакции, возможность инструментального учета и автоматизации всех ее этапов.

Из-за разнообразия объектов исследования — от низкомолекулярных соединений до вирусов и бактерий, и многообразия условий проведения ИФА существует большое количество вариантов этого метода.

ИФА основан на использовании антител, конъюгированных или связанных с ферментами, в основном пероксидазой хрена или щелочной фосфатазой. Комплексы антител с ферментами называются конъюгатами. Механизм реакции при определении антигена заключается в следующем:

На твердый носитель, которым могут быть целлюлоза, полиакриламид, декстран и различные пластмассы, сорбируют антитела к искомому веществу или инфекционному агенту. Чаще носителем служит поверхность лунок микропанелей. Затем несорбированные белки отмывают специальным раствором и в лунки добавляют исследуемый материал, например сыворотку крови, где находятся искомые антигены (вирусы или бактерии и т.д.). Антитела, закрепленные на пластиковой подложке, «подбирают» антигены, присутствующие в крови пациента, специфически с ними связываясь. Затем добавляют антитела, связанные с ферментом - конъюгаты. Оставшиеся молекулы сформируют «сэндвич», состоящий из следующих слоев: фиксированное на подложке антитело —антиген — связанное с ферментом антитело.

Чтобы обнаружить образовавшиеся иммунные комплексы, т.е. соединения меченых антител с антигенами, добавляют субстрат, разлагаемый присоединенным к антителам ферментом. После добавления в данную систему хромогенного субстрата последний расщепляется ферментом конъюгата, в результате чего изменяется цвет раствора в лунке.

Интенсивность окрашивания пробы исследуемого материала прямо пропорциональна содержанию в ней искомого антигена. Учет интенсивности реакции опытных и контрольных проб проводят на основании измерения оптической плотности на специальных приборах - спектрофотометрах. Чем выше оптическая плотность в данной ячейке, тем большее количество специфических антител содержится в пробе.

В случае, когда неизвестным компонентом является антитело, первая реакция происходит между искомым антителом и очищенным антигеном возбудителя, фиксированным на поверхности лунок планшета. Для выявления образовавшихся иммунных комплексов проводят вторую реакцию, в которой в качестве антигена выступает специфически связавшееся антитело, а в качестве антител к нему — конъюгат. Это вариант непрямого иммуноферментного анализа. Например, с помощью этого вариант ИФА определяют антитела к токсоплазмозу - паразитарному заболеванию кошек, собак и человека.

В последнее время все более широкое распространение в ветеринарии получили экспресс-тесты диагностики инфекционных заболеваний. Экспресс-тесты не требуют специальной длительной подготовки проб, просты в применении, отсутствует необходимость в использовании дополнительных реагентов и оборудования, поскольку все иммунореагенты находятся в составе тест-кассеты. время исполнения анализа не более - 15-25 минут. И в то же время этот метод достаточно надежен - достоверность достигает 92-98%. Их можно применять в любом месте: в кабинете, при выезде на дом, в лаборатории. Иммунохроматографические диагностические методы являются позднейшей разработкой, отвечающей всем требованиям, и наиболее широко используемыми в мире диагностическими экспресс-методами.

От наличия возможности быстро обнаружить возбудителя инфекционного заболевания может зависеть здоровье и жизнь животного, поэтому быстрая диагностика позволит назначить адекватное лечение в минимальные сроки.

Принцип работы экспресс-тестов основан на методе иммунохроматографии (ИХА), сущность которого заключается в следующем: при нанесении исследуемого образца жидкости (сыворотка крови, смывы со слизистых) на специальную нитроцеллюлозную мембрану на которой закреплены специфически связывающиеся агенты (антитела или антигены), раствор с исследуемым биологическим материалом проходит вдоль мембраны за счет капиллярных сил. В случае присутствия в исследуемом материале тестируемого антигена или антитела происходит связывание с агентами на подложке (мембране). В результате чего на мембране появляются одна или две четко окрашенные полосы, свидетельствующие о негативном или позитивном результате теста.

Наиболее известны диагностические иммунные сыворотки (антисыворотки), с помощью которых выявляют Аг возбудителей в клиническом материале, а также проводят серологическую идентификацию микроорганизмов из выделенных культур. Для установления принадлежности микроорганизмов к конкретному виду применяют видовые антисыворотки (AT). Для распознавания Аг, общих для групп микроорганизмов одного вида, применяют групповые антисыворотки (AT). Серовароспецифичные антисыворотки позволяют различать серологические варианты (серовары) микроорганизмов в пределах одного вида.

Для получения антисывороток с титром, удовлетворительным для проведения ИФА, часто требуется 4-5-кратное повторение циклов иммунизации. Отбор крови каждый раз проводится на 7 - 9-й день после последней инъекции.