- •Способы подготовки к исследованию и методы изучения клетки
- •Постоянные микротомные препараты
- •Подбор объектов для исследования и подготовка их к фиксации
- •Специальная обработка объектов перед фиксацией
- •Фиксаторы, их состав и использование
- •Фиксация
- •Промывание и обезвоживание
- •Пропитывание промежуточной жидкостью и парафином
- •1. Растворители парафина и их основные свойства
- •Приготовление парафиновых блоков
- •Удаление парафина и окрашивание срезов
- •Монтирование препаратов
Способы подготовки к исследованию и методы изучения клетки
Рассмотрим методы исследования, при помощи которых накапливают данные о строении, функции, химическом составе клетки и ее структурных компонентов. К ним относятся: прижизненные наблюдения, изучение фиксированных и окрашенных клеток и тканей, высушенных замороженных (лиофилизированиых) объектов, цитохимия, дифференциальное центрифугирование, авторадиография, культура клеток и тканей, микрургия и др.
Почти каждый из перечисленных методов исследования непременно сопряжен с одним или несколькими методами наблюдения. Исследователь для получения информации о протекающих процессах на уровне клетки должен быть хорошо знаком с разными способами исследования клетки, которые неравноценны между собой, и каждый имеет свои достоинства и недостатки.
Прижизненные наблюдения объектов очень распространены в цитофизиологии. Пыльцевые зерна, пыльцевые трубки, рыльца, столбики, волоски тычиночных нитей нередко для изучения морфологии клетки, прижизненной кислотности, окислительно-восстановительного потенциала, степени дисперсности коллоидов протопласта, жизнеспособности, проницаемости и т.д. приходится смотреть под микроскопом в капле жидкости. Метод используют при просмотре искусственных культур клеток растений, грибов, бактерий. Вследствие низких показателей преломления содержимого живой клетки прижизненные наблюдения часто проводят на темном поле, в фазовом контрасте, поляризованном свете, флуоресцентным методом.
Препараты с живыми объектами недолговечны, а использование при работе с ними красителей ограничено вследствие их токсичности. Такие красители, как янус зеленый, нейтральный красный, метиленовый синий и другие, применяют для окрашивания живых объектов в слабой концентрации (от 10-4 до 10-5) и обрабатывают ими ткани всего несколько минут. Специальные красители – флуорохромы – применяют для изучения живых объектов в люминесцентном микроскопе. Для прижизненных наблюдений используют следующие среды: воду, р-р сахарозы, вазелиновое, парафиновое, силиконовые (ВИЖ-94а, полисилаксан) масла и др.
В 1970 г. И.Д. Романов наблюдал движение цитоплазмы, сочетая прижизненные наблюдения с методом фазового контраста. Таким образом, он исследовал пыльцевые зерна пшеницы, ржи, овса от момента обособления пыльцевых зерен до образования крахмала, что совпадает с периодом спермиогенеза, используя в качестве среды 5%-ный раствор сахарозы.
Фиксация с последующим окрашиванием клеток и тканей – один из наиболее распространенных способов подготовки объектов к исследованию в цитологии и эмбриологии. Под действием химических фиксаторов (этиловый спирт, формалин, уксусная кислота и др.) в клетке прекращаются жизненные процессы, а ее химические компоненты осаждаются. После фиксации объект промывают. Дальнейшая обработка зависит от типа приготовления препарата. Можно окрасить материал сразу для изготовления временного препарата. Для получения тонких срезов толщиной в несколько микрометров объект обезвоживают, заключают в парафин и режут на микротоме. Срезы наклеивают на предметные стекла, освобождают от парафина и окрашивают. Красители подбирают так, чтобы повысить контрастность изображения отдельных структур, а в ряде случаев и выявить их химический состав, например ДНК, РНК, белки и др. Точное содержание химических веществ определяют на приборе – цитофотометре.
При цитохимических исследованиях приходится считаться с тем, что химические фиксаторы могут вызывать артефакты, т. е. изменения в клетках, вызванные тем или иным фактором. Чтобы избежать этого, используют метод высушивания замороженных объектов, в процессе которого химические компоненты клетки не осаждаются. Кусочки ткани толщиной около 0,1-1 мм и площадью 1 мм2 замораживают в изопентане, охлаждаемом жидким азотом до минус 170 °С. Замороженный объект переносят в сушильный аппарат, где при низкой температуре (минус 30-40 °С) в вакууме из него удаляют воду. Высушенный материал затем готовят для микроскопического исследования. В нем хорошо сохраняются нуклеиновые кислоты, белки, липиды, некоторые полисахариды и другие соединения и не происходит нежелательного перераспределения вещества.
Дифференциальное центрифугирование применяют для изучения химического состава ядер, митохондрий и других структур. В этом случае объект измельчают с использованием сахарозы в специальном приборе – гомогенизаторе. Полученный гомогенат путем дробного центрифугирования разделяют по плотности на фракции, состоящие из определенных, но изолированных клеточных структур. При сравнительно небольших ускорениях на центрифуге из гомогеиата осаждают клеточные ядра. При значительно больших ускорениях центрифугированием надосадочной жидкости выделяют митохондрии, а затем рибосомы и другие структуры.
Метод авторадиографии применяют для изучения локализации и синтеза нуклеиновых кислот в клеточных структурах с использованием меченых соединений и определения продолжительности митотического цикла. При работе этим методом используют изотопы, при распаде которых образуются электроны с малым запасом энергии.
Для регистрации α- и β-излучений необходимы специальные фотоэмульсии, при контакте которых с меченым объектом на них остаются следы электронов. Так изотоп подает сигнал о своем местонахождении, и это позволяет проследить движение, перераспределение и превращения определенных веществ клетки. Разработаны способы количественного анализа радиоавтографов, что расширяет возможности метода.
Метод культуры клеток и тканей используют при подготовке к исследованию живых клеток в условиях, благоприятных для их жизнедеятельности и размножения. Небольшие кусочки тканей, органы или отдельные клетки можно культивировать в стерильных условиях на питательной среде in vitro при оптимальной для них температуре. Культуру периодически переносят в свежую питательную среду для длительного сохранения жизнеспособности. Однослойные культуры клеток удобны для прижизненных наблюдений методом фазового контраста и киносъемки. Так можно проследить весь жизненный цикл клеток. Из отдельных клеток можно вырастить целые растения. В последние годы интерес к этому методу возрос в связи с возможностью использовать его при изучении генетики соматических клеток: в биотехнологии – для выращивания зародышей на искусственной питательной среде, при клеточной инженерии, позволяющей получать парасексуальиые гибриды путем слияния изолированных протопластов разных видов растений и гаплоидов из клеток пыльников.
Нередко возникает необходимость вмешаться во внутренние процессы, протекающие в клетке. Это достигается при помощи тонкого метода исследования – микрургии. Она позволяет проводить трансплантацию ядер из клетки в клетку, определять прижизненную кислотность отдельных структур, измерять биотоки, температуру и т. д. Для выполнения подобных операций необходимы прибор микроманипулятор ММ-1 с микроскопом и набор стеклянных игл, пипеток, петель, электродов и т. д.
В цитологии микрургические операции проводят обычно на клеточном уровне, в эмбриологии – на зародышах или их органах. Для микрургии объект заключают в стеклянную камеру, заполненную определенной средой, и все операции выполняют под микроскопом.
В зависимости от цели и объекта исследования можно использовать один или несколько указанных выше методов. Так, в кариологии чаще работают методом фиксации с последующим окрашиванием тканей и клеток. Цитофизиологи предпочитают прижизненные наблюдения, а в цитохимии сочетают фиксацию, лиофилизацию, авторадиографию, прижизненные наблюдения, окрашивание и др.
Совокупность приемов, направленных на выявление локализации определенных веществ в тканях и клетках, получила название микроскопической гистохимии. В последние годы для изучения химии клеточных структур все чаще используют абсорбционные оптические методы, которые>в совокупности называют цитофотометрией. Она делится на ультрафиолетовую и видимую. Последняя базируется на применении специфичных красителей.
Для фотометрирования используют микрофотометрические насадки (ФМЭЛ-1, ФМЭП-1), цитофотометры (МЦФВ-1, МЦФУ-1), универсальные микроскопы-фотометры, микроспек-трофотометры. Цитофотометр состоит из микроскопа и микропроектора. Анализ препарата ведут в монохроматическом свете с длиной волны, лежащей в пределах поглощения исследуемого вещества. Методы цитофотометрии позволяют измерить содержание поглощающих веществ в клетке и ее структурах.