24. Пцр: принцип работы, ферменты, температурный режим циклов.

ПЦР - экспериментальный метод молек. биологии, позволяющ. добиться значительного увеличения малых концентраций определенных фрагментов нукл. к-ты (ДНК) в биол. материале (пробе). Метод ПЦР основан на принципе естественной репликации ДНК, включающей: расплетение двойной спирали ДнК, расхождение нитей ДНК и комплементарное достраивание обеих нитей. В реак-ии уч-ют искусственно синтезированный олигонуклеотид, повторяющ. строение уч-ка гена МО, и Ф Tag-полимеразы. С пом. последнего происходит воспроизведение специфич. фрагмента ДНК. Вновь синтезированные фрагменты ДНК служат матрицей для синтеза новых нитей в следующем цикле амплификации – это и есть цепная реак-я. В рез-те 35-45 циклов амплификации из 1-10 копий ДНК нарабатывается до 10⁸копий фрагмента, достаточного для визуального учета р-ии методом электрофореза в агарозном геле. Методика проведения ПЦР: 1. выделение ДНК из биол. материала 2. проведение ПЦР 3. электрофорез (детекция продуктов амплификации). Ферменты. Таq ДНК-полимераза Taq ДНК-полимераза – термостабильная ДНК-полимераза термофильной бактерии Thermus aquaticus. Катализирует 5’ ->3’ синтез ДНК. Не имеет 3’ ->5’ корректирующей экзонуклеазной активности и обладает низким уровнем 5’->3’ экзонуклеазной активности. Источник получения: клетки E.coli, несущие клонированный ген pol из Thermus aquaticus. Характеристика: Очень термостабильная, устойчива к температурам до 95°C в течение более 40 мин. Включает модифицированные нуклеотиды (напр., биотин-, дигоксигенин, флуоресцен- меченные). Одна единица активности фермента катализирует включение в полинуклеотидную фракцию 10 нано моль дезоксирибонуклеотидов за 30 мин при 70°C. Частота ошибочного включения оснований Taq ДНК-полимеразой в ПЦР 2.2x10-5 ошибок на основание за цикл. Применение: Амплификация фрагментов ДНК длиной до 5 kb.; Мечение ДНК; Секвенирование ДНК; PCR-клонирование.

Температурный режим реакции. Температура денатурации является функцией ионной силы используемого буфера и концентраций дестабилизирующих ("денатурирующих") ДНК агентов (если они есть). Обычно берется в интервале от 90 до 95°С (93°). Чем ниже ионная сила и чем выше концентрации "денатурирующих" агентов, тем ниже температура при которой происходит денатурация ДНК. Температура отжига - температура, при которой возможно связывание праймерного олигонуклеотида с матрицей. Температура отжига зависит от длины праймера, его первичной структуры (процента GC-нуклеотидов) и ионной силы ПЦР-буфера. Высокая ионная сила буфера, высокое содержание GC-оснований в праймерном олигонуклеотиде увеличивают эффективную температуру отжига. Температура элонгации зависит от типа используемой ДНК-полимеразы. Обычно берется в интервале от 70 до 75°С (72°).

25. Олигонуклеотид-направленный мутагенез (онм). Применение пцр для генетического конструирования.

ОНМ – более простой и быстрый метод получения больших количеств мутантных генов, альтернативный системе с использованием фага М13, - сайт-специфический мутагенез в сочетании с ПЦР. Один из вариантов этого подхода: ген-мишень встраивают в плазмидный вектор и помещают препарат в 2 пробирки. В каждую из них добавляют по 2 специфических праймера для ПЦР: 1 и 2 в одну пробирку, 3 и 4 – в другую. Праймеры 2 и 3 полностью комплиментарны одному из участков клонированного гена или прилегающей к нему последовательности, 1 и 3 комплиментарны другому уч-ку, ног содержат один не комплиментарный нуклеотид и гидридизуются с разными цепями, так что в рез-те происходит замена обоих нуклеотидов данной пары. Положение сайтов гибридизации праймеров 1 и 2 в одной пробирке и 3 и 4 в другой таково, что ПЦР продукты в разных пробирках им разные концы. По окончанию ПЦР содержимое пробирок объединяют и проводят денатурацию, а затем ренатурацию. Поскольку концы амплифицированных мол ДНК из двух пробирок неодинаковы, одноцепочечные ДНК из разных пробирок ассоциирует с образованием кольцевых мол с двумя одноцепочечными разрывами. Эти разрывы репарируются после трансформации E.coli. При ренатурации одиночных цепей из одной пробирки образуются линейные молекулы. В клетках E.coli стабильно поддерживаются в виде плазмид и наследуются только кольцевые, а не линейные молекулы, при этом все они несут сайт-специфическую мутацию. Т.о., с пом. описанного метода можно вносить точковые мутации в клонированный ген, при этом отпадает необходимость во встраивании гена в ДНК фага М13, использовании мутантных штаммов E.coli и в переносе мутантного гена из М13-вектора в экспрессирующий вектор.

26. Основные методы клеточной инженерии растений. Это один из основных разделов современной БТ, основанный на выделении и культивировании тканей и клеток высших многоклеточных организмов. Культивирование тканей и клеток происходит вне организма – in vitro, в специально подобранных условиях. Базовым методом клеточной инженерии служит слияние (гибридизация) соматических клеток растений. Слияние клеток осущ-ся несколькими способами с использованием так называемых фузогенных (т.е. сливающих) агентов различного происхождения: физического (переменное электрическое или магнитное поле), химического (катионы, полиэтиленгликоль и др), биологического (вирусы). Растит кл-ки перед слиянием превращают в протопласты (т.е. кл-ки, лишенные внешней жесткой клет.стенки). Последующий отбор (скрининг) полученных гибридных кл-к позволяет отобрать те из них, кот. объединили геномы или фрагменты ДНК родительских кл-к. Клет. инженерия позволяет получать кл-ки или даже целые раст-я (растения-регенераты), скрещивая м/у собой филогенетически отдаленные орг-мы. В случае неполного слияния клеток получ-ся ассиметричные гибриды. Это расширяет возможности получения новых ценных сортов с/х растений. Типы культур кл. растений: суспензионная (глубинное культивирование) и каллусная (поверхностное культ.) Каллусная культура подразд-ся на 3 вида: плотные ткани с зонами редуцирования камбия и сосудов; ткани средней плотности с хорошо выраженными меристематическими очагами; рыхлые ткани, сильно обводненные, легко распадающиеся на отд кл (получение суспензии). Культивирование одиночных клеток.

Для получения отдельных клеток необходима процедура мацерации – разъединения клеток ткани в результате разрушения межклеточного вещества. В состав мацерирующих растворов обычно входит фермент мацераза (полигалактуроназа). После мацерации раствор клеток фильтруется через ткань. Клетки осаждаются центрифугированием или микрофильтрацией (капроновый фильтр) и промываются. Одиночные клетки в культуральной среде живут, но не делятся – необходим «кондиционирующий фактор» - метаболиты, выделяемые в среду клетками тканевой культуры. Для повышения концентрации кондиционирующего фактора в среде применяются методы: 1. Метод ткани-«няньки» - кондиционирующий фактор выделяется находящимися рядом с одиночной клеткой кусочками ткани-«няньки».2. Метод «кормящего слоя» - кондиционирующий фактор выделяют активно делящиеся клетки суспензионной культуры того же вида растений, что и одиночная клетка.3. Кондиционирование среды - осуществляется путем добавления в нее питательной среды, отфильтрованной от интенсивно делящихся клеток.4. Метод культивирования одиночных клеток - осуществляется в микрокапле, т.е. в очень малом объеме (20 мкл) богатой питательной среды.