Фактори, що впливають на ступінь екстракції речовин з водних витяжок органічними розчинниками:

• Природа речовини, яка екстрагується.

• Значення рН середовища.

• Природа екстpaгенту.

• Температура.

• Наявність висолювачів.

• Співвідношення об’ємів водної й органічної фаз.

• Числа повторних екстракцій.

Кількість екстрагованої речовини залежить від дисоціації її у водній фазі.

При екстракції недисоційовані молекули переходять в органічну фазу, а йони, що добре гідратовані молекулами води, залишаються у водній фазі.

При зміні рН водної фази змінюється співвідношення йонізованої і молекулярної форм «лікарських» отрут у водній витяжці, що впливає на екстракцію речовин у нейонізованій формі органічними розчинниками.

Вибір оптимальних умов екстракції: рН середовища, природи органічного розчинника - залежать від фізико-хімічних властивостей отруйних речовин. Наприклад, максимальна кількість кокаїну ексграгується з водної фази хлороформом при рН 7,0 - 8,5 (80 - 83 %), мінімальна кількість - диетиловим ефіром при рН 8,0 - 8,5 (57 - 62 %).

Зміна температури впливає:

• На константу розподілу речовини, яка екстрагується. При зміні температури неоднаково змінюється розчинність отрут і домішок у водній і органічній фазах, а також змінюється взаємна розчинність фаз.

• На зміну дисоціації й асоціації речовин у відповідній фазі.

• На зміну кількості співекстрактивних домішок. Оптимальною температурою для проведення процесу екстракції отрут є 25⁰С тому, що при збільшенні температури зростає кількість домішок.

Hаявність висолювачів (NaCl, Na₂SO₄ , (NH₄)₂SO₄) також збільшує ступінь екстракції отрут і домішок.

Розрахунок ступеня екстракції, константи розподілу і числа повторних екстракцій, необхідних для практично повного витягу досліджуваних речовин з розчинів проводиться за допомогою формул:

• Число повторних екстракцій ( m )

де С_В - початкова концентрація речовини у водному розчині (моль/л);

[A_m]_B - концентрація речовини, що залишилася, у водному розчині після m

екстракцій (моль/л);

P₀ - константа розподілу;

r - відношення об’єму водної фази до об’єму органічного розчинника

(V_B/V₀).

• Ступінь екстракції (R):

• Константа розподілу (P₀):

4. Методи очищення витяжок від домішок і концентрування виділених речовин.

Для очищення аналізованих сполук від співекстрактивних речовин (білки, жири, пігменти й ін.) використовують різні методи:

• Фільтрування і центрифугування.

• Осадження білків різними реактивами і прийомами.

• Екстракція.

• Хроматографія - на папері, колонці, в тонких шарах сорбенту (ТСХ-метод), гель-хроматографія.

• Електрофорез.

• Дистиляція з водяною парою.

• Возгонка.

• Діаліз.

Фільтрування і центрифугування. Фільтрування дозволяє очистити витяжки від механічних забруднень (дрібних часточок біологічного матеріалу). Однак при фільтруванні витяжок можлива адсорбція отрути на фільтрі і часткова її втрата, а також неповне очищення витяжки від домішок, обмежене діаметром пор фільтра. Ці недоліки ліквідуються центрифугванням.

Осадження білків різними реактивами зумовлено утворенням малорозчинних у воді комплексів (фосфорновольфрамова, фосфорномолібденова, вольфрамова, трихлороцтова, метафосфорна кислоти) або коагуляцією білків (етанол, ацетон).

Для осадження білків використовуються різні прийоми: нагрівання, висолювання, зміна рН середовища.

• При підвищенні температури більше 40⁰С відбувається денатурація білків, знижується їхня розчинність.

• Ефективність висолювання як методу очищення витяжки залежить від концентрації і природи електролітів. При низьких концентраціях електроліти (Na₂SO₄; NaCl; (NH₄)₂SО₄ підвищують розчинність білків, що пояснюється зміною ступеня дисоціації іонізованих (-СООН; -ОН; -SH) груп білків. Підвищення концентрації солей (насичені розчини) приводить до перерозподілу молекул води в гідратних оболонках білків і введених іонів Na⁺; Сl^־; SO₄^2- ; NН₄⁺, що знижує розчинність білків.

• Осадження білків з витяжок можливо при зміні рН середовища до значення, що відповідає ізоелектричній точці білка, при якому білок не несе сумарного заряду. Результатом досягнення зазначеного рН розчину є відсутність електростатичного відштовхування молекул білків, що сприяє утворенню осаду.

• Недоліком методів очищення витяжок при осадженні білків є здатність осадів домішок адсорбувати на своїй поверхні аналізовані отрути, що може бути однією з причин їх втрат у ході дослідження.

В основі екстракційного методу очищення лежить закон розподілу речовин між розчинниками, які незмішуються, а також їх здатність розчинятися в органічних розчинниках, а солей, які вони утворять - у воді. Метод простий, доступний і ефективний.

Схема екстракційного очищення отрут основного характеру

Кодеїн - основа Кодеїну гідрохлорид – сіль

(при рН 9-10 – (при рН 2-3 –

екстрагент отрути – хлороформ екстрагент солі – вода

екстрагент домішок - вода) екстрагент домішок - хлороформ)

Для екстракції домішок з витяжок необхідне встановлення відповідного значення рН середовища і застосування відповідного розчинника. При неправильному виборі цих факторів разом з домішками можуть екстрагуватися і аналізовані отрути.

Схема екстракційного очищення отрут кислого характеру

Барбітал – імідна форма Барбітал натрію – імідольна форма

(при рН 2-3 – (при рН 9-10 –

екстрагент отрути – хлороформ екстрагент отрути – вода

екстрагент домішок – вода) екстракт домішок – хлороформ)

В основі ТСХ-методу лежить розподіл отрути між рідкою і твердою фазою, нанесеної на тверду підкладку. Вибирають системи, у яких домішки залишаються на старті або рухаються разом із фронтом розчинника. Метод простий, доступний, дозволяє не тільки зробити очищення отрут від домішок, але й одночасно виконати їх визначення.

Для очищення екстрактів, отриманих з об'єктів, що знаходяться на стадії гнильних змін, ефективне використання сполучення екстракційного методу і методу тонкошарової хроматографії.

В основі електрофорезу на папері лежить розподіл речовин на папері, вміщеному в електроліт, під дією електричного поля. Йони досліджуваної суміші рухаються до електроду протилежного знака. По своїй ефективності метод наближається до ТСХ-методу, але вимагає спеціального устаткування.

Очищення екстрактів за допомогою гель-хроматографії основане на різній поведінці молекул стосовно пор гелю: малі молекули отрути проникають у пори і затримуються в них, великі молекули домішок обходять пори або уримаються на поверхні гелю. Метод гель-хроматографії застосовується для очищення водних витяжок. Він трудомісткий, але ефективний.

Дистиляція з водяною парою і метод возгонки засновані на леткості окремих представників досліджуваної групи отрут (алкалоїди похідні піридину і піперидина, барбитурати). Цей метод простий, але його використання раціональне при аналізі тільки великих кількостей отрут, що буває вкрай рідко при проведенні хіміко-токсикологічних досліджень.

Метод діалізу заснований на застосуванні напівпроникних мембран, через пори яких здатні проходити йони, невеликі молекули органічних речовин у той час, як великі молекули (білки, пептиди й ін.) залишаються по іншу сторону мембран. Метод має обмежене застосування для очищення речовин досліджуваної групи отрут, тому що він тривалий, можливі значні втрати аналізованих сполук.

Для проведення аналізу екстрактів їх необхідно сконцентрувати (працювати з великими об’ємами незручно).

Існують різні методи концентрування екстрактів:

• екстракційний,

• упарювання під вакуумом,

• адсорбція отрут твердим сорбентом з наступною десорбцією.

Вибір методу очищення залежить від стану об'єкту і методу ізолювання аналізованої отрути з біологічного матеріалу.

До складу методів ізолювання входять окремі етапи очищення, але вони не можуть забезпечити повне видалення домішок.

№ п/п	Група отрут, які ізолюються	Методи ізолювання	Методи очистки від домішок, які входять до складу методу
1	2	3	4
1	„Лікарські отрути”	Водою, підкисленою оксалатною кислотою (метод А.А.Васильєвої)	Проціджування; Центрифугування
2	„Лікарські отрути”	Спиртом, підкисленим оксалатною кислотою (метод Стаса-Отто)	Упарювання витяжки до густоти сиропу Осадження білків спиртом Фільтрування
1	2	3	4
3	„Лікарські отрути”	Ацетоном (метод Карташова)	Центрифугування Фільтрування Екстракція домішок гексаном (рН 2-3)
4	Алкалоїди	Водою, підкисленою сульфатною кислотою (метод В.Ф.Крамаренко)	Проціджування; Центрифугування Висолювання домішок з допомогою (NH4)2SO4 Екстракція домішок ефіром (рН 2-2,5)
5	Похідні барбітурової кислоти	Водою, підлужненою натрій гідроксидом (метод П.Валова)	Проціджування; Центрифугування Осадження білків вольфраматом натрію Екстракція домішок ефіром (рН 2)
		Водою, підкисленою сульфатною кислотою (метод В.І.Попової)	Проціджування; Центрифугування Гель-хроматографія
6	Похідні фенотіазину	Спиртом, підкисленим оксалатною кислотою (модифікація методу Стаса-Отто по Є.М.Саломатіну)	Упарювання витяжки до густоти сиропу Осадження білків спиртом Фільтрування Екстракція домішок ефіром (рН 2-3)
		Ацетонітрилом, підкисленим хлористоводневою кислотою (модифікація методу Сшедзинського по Є.М.Саломатіну)	Фільтрування Висолювання домішок з допомогою Nа2SO4 Екстракція домішок ефіром (рН 2-3)
7	Похідні 1,4-бенздіазепіну	Ізолювання метаболітів похідних 1,4-бенздіазепіну (метод Б.Н.Ізотова)	Деструкція тканин органів для проведення кислотного гідролізу Центрифугування Фільтрування

Тому після ізолювання отрут полярними розчинниками для очищення витяжок використовуються вищевказані методи, серед яких найбільш часто застосовують методи екстракційного очищення і тонкошарової хроматографії або їх сполучення.

Тема: ПРИНЦИПОВА СХЕМА ІДЕНТИФІКАЦІЇ І КІЛЬКІСНОГО ВИЗНАЧЕННЯ РЕЧОВИН, ЯКІ ІЗОЛЮЮТЬСЯ ЕКСТРАКЦІЄЮ ПОЛЯРНИМИ РОЗЧИННИКАМИ

План лекції

1. Принципова схема аналізу «лікарських» отрут.

2. ТСХ-скринінг «лікарських » отрут.

3. Хімічні методи дослідження «лікарських» отрут.

4. Фізико-хімічні методи ідентифікації препаратів.

5. Фармакологічні дослідження «лікарських» отрут.

6. Кількісне визначення «лікарських» отрут.