Картирование генов с использованием транслокаций и делеций.

Транслокация – межхромосомная перестройка, во время которой негомологичные хромосомы обмениваются участками.

Делеция – утрата участка.

Было установлено, что 3 гена, кодирующие синтез трёх ферментов, локализованы в Х-хромосоме, но в каком месте – неизвестно. Случайно обнаружили ♀ с транслокацией длинных плеч 14 хромосомы на длинные плечи Х-хромосомы.

Гибридизовали клетки женщины и клетки мыши, отобрали определённые клоны:

1. Обе перестроенные хромосомы – х/14, 14/х;

2. х/14;

3. 14/х

к лоны ферменты	х/14; 14/х	х/14	14/х
ГГРФТ	+	-	+
ФГК	+	-	+
Г-6-ФД	+	-	+

т.к. Х-хромосома несёт гены трёх ферментов, то с помощью эксперимента попытались выяснить локализацию генов этих ферментов на Х-хромосоме. Испытали клоны на синтез ферментов => гены всех трёх ферментов локализованы в длинном плече Х-хромосомы.

Для того, чтобы установить последовательность расположения генов в длинном плече, использовались клоны клеток с делециями длинного плеча Х-хромосомы.

к лоны
ГГРФТ	+	+	-	-
ФГК	+	-	-	-
Г-6-ФД	+	+	+	-

Отобрали клоны с делециями плеча разной длины. Затем клоны испытали на синтез трёх ферментов.

Можно установить последовательность расположения генов в хромосоме, используя др. ферменты или др. делеции.

• Метод днк-зондов.

ДНК-зонд - копия целого гена или его части, помеченная флуоресцентной или радиоактивной меткой.

Наиболее часто, зонды получают методом обратной транскрипции. Для этого необходимо выделить иРНК и с помощью ревертазы (фермент обратной транскрипции) получаем копию гена (ДНК) и помечаем её меткой:

иРНК

↓

О братная → ДНК

транскриптаза

помечают меткой

Из эритроцитов была выделена иРНК, кодирующая α и β цепи гемоглобина; на базе этой РНК получены меченые зонды. Приготовили хромосомные препараты из культуры клеток человека. На одном из этапов, клетки обработаны с целью вызвать частичную денатурацию белка. В это же время было добавлено большое количество зондов. Затем фактор, вызывающий денатурацию убрали => ренатурация. Т.к. зондов много, они могут занять участки на ДНК, которым они комплементарны. На участке хромосома+зонд будет наблюдаться флуоресценция.

Если хромосомы окрашены дифференциально, то можно определить какая это хромосома и какой участок.

Структура генов.

Вопрос о природе аллелизма. Сравнивая аллели гетерозигот: ген представляет собой элементарную неделимую структуру, которая при мутациях изменяется целиком, т.е. ген является единицей мутации и рекомбинации.

Ступенчатый аллелизм.

В 1929 – 1930 гг. Серебровский и Дубинин исследовали серию множественных аллелей, которые контролировали наличие и отсутствие щетинок на различных полях у дрозофил. Scute – каждая линия характеризовалась отсутствием определенных щетинок, локус локализован в Х-хромосоме.

Р : ♀ Х ♂

F1 : ;

Sc1 – отсутствие щетинок на участках А, В, С

Sc2 – отсутствие щетинок на участках В, С, D

Компаунд – гетерозигота по 2 мутантным аллелям.

Оказалось, что у компаундов отсутствуют щетинки на полях В и С. Проведя скрещивания с 13 различными линиями, они наблюдали одну и ту же закономерность как бы частичного восстановления признаков у компаундов.

Гипотеза: ген, как основа (базиген) состоит из частей, которые могут мутировать (трансгены). Т.е. ген дробим и мутирует не целиком, а по трансгенам, следовательно он не является единицей мутации.

Аллели – это разные состояния одного и того же гены, аллельными называют мутации, которые затрагивают один и тот же ген.

Как определить аллельны или не аллельны какие–либо 2 независимо возникшие мутации?

Функциональный критерий (Морган). Основан на том, что при скрещивании 2 мутантов, несущих изменения разных генов, возникает гибрид в F1, имеющий дикий фенотип.

Р: ♀ Х ♂

F1: => признаки не аллельны

Р: ♀ а₁а₁ х ♂ а₂а₂

слепые слепые

F1: a₁a₂ – зрячие => признаки аллельны

Морган предложил этот критерий для не сцепленных генов. Льюис предложил цис -, транс- испытание, где анализировались сцепленные гены.

Р: ♀ Х ♂ → → не аллельные признаки