2. Выявление «узких мест» в метаболизме микробной клетки
Скорость роста микроорганизмов - функция скоростей координированного биосинтеза всех компонентов биомассы и скорости клеточного деления - регулируется на многих этапах метаболизма.
Однако в сложной сети биохимических реакций, где каждая из ячеек в определенных условиях может лимитировать общую скорость процесса, удается выделить наиболее «слабое» звено, которое даже в оптимальных условиях роста остается «узким местом», лимитирующим скорость размножения клеток.
«Узкое место» - один из участков сложной сети биохимических реакций, в определенных условиях лимитирующий общую скорость метаболизма и, даже в оптимальных условиях роста, лимитирующий скорость размножения клеток. Выявление такого «узкого места» чрезвычайно важно для получения максимального выхода биомассы и ценных для человека продуктов метаболизма в случае использования микроорганизмов в биотехнологических процессах.
Рассмотрим значение для управления скоростью роста уровней регуляции метаболических процессов в соответствии со схемой.
1. Этап репликации в отношении синтеза макромолекул обычно не является «узким местом» метаболизма, хотя скорость элонгации цепи ДНК -величина достаточно постоянная, составляющая примерно 2000 пар нуклеотидов в секунду (у E.coli), и мало зависит от условий роста (в оптимальной области концентраций предшественников). Объясняется это наличием специальной организации регуляторных механизмов, «настроенных» таким образом, что при улучшении условий повышается частота инициации новых циклов репликации ДНК.
2. В процессе этапа транскрипции скорость элонгации цепей РНК достаточно постоянна и составляет около 50-80 нуклеотидов в секунду, а увеличение общей скорости процесса достигается путем повышения частоты инициации (или снижения частоты терминации).
1-5 - уровни регуляции биосинтеза белковых посредников
- репликация,
- транскрипция,
- сборка аппарата трансляции,
- трансляция,
- посттрансляционная модификация;
6-8 - уровни функционирования белковых посредников
- ферментативная активность,
- транспорт субстратов,
- выделение продуктов;
а-г - основные механизмы регуляции
а - участие транскрипции в репликации (оРНК),
б - воздействие трансляции на транскрипцию (гуанозинполифосфаты и др.),
в - индукция,
г - репрессия,
д - обратимая ковалентная модификация,
е - управление субстратом активностью ферментов,
ж - управление продуктом активностью ферментов (аллостерическая регуляция),
з - цис-управление транспортом,
ж - транс-управление транспортом.
На схеме не обозначено участие белков в процессах репликации, транскрипции, трансляции, транспорта и выделения веществ
3. Этап сборки компонентов аппарата трансляции и увеличение скорости биосинтеза - это основной способ повышения эффективности трансляции в быстро растущих клетках. Именно этот этап - одно из наиболее «узких мест» метаболизма, где концентрируются эффекты регуляторных механизмов управления скоростью роста, включающихся в ответ на сигналы, полученные из внешней среды. О важной роли аппарата трансляции в регуляции скорости роста свидетельствуют следующие факты:
между содержанием рибосом (рРНК) и скоростью роста бактерий существует прямая пропорциональность;
при изменении условий выращивания, влияющих на скорость роек та, в первую очередь изменяется скорость синтеза рРНК, а изменение скорости синтеза белка в основном определяется сдвигом в количестве функционирующих рибосом.
4. В процессе этапа трансляции скорость элонгации полипептидной цепи также сравнительно мало зависит от условий среды, хотя в медленно растущих клетках скорость элонгации (10-12 аминокислот в секунду на рибосому) может быть в 1,5 раза ниже, чем в быстро растущих клетках (14-17 аминокислот в секунду на рибосому).
6. Этап функционирования ферментов может оказаться лимитирующим рост звеном метаболизма лишь при отсутствии в клетке необходимого количества фермента (либо у дефектных мутантов, у которых фермент малоактивен, хотя и синтезируется в большом количестве). В первом случае обычно включается механизм индукции синтеза фермента субстратом или происходит снятие репрессии, оказываемой конечным продуктом. Для конструктивных ферментов возможна также стимуляция на уровне трансляции. Только при недостаточной эффективности всех этих механизмов регуляции количество фермента может оказаться неадекватным условиям роста.
Процесс клеточного деления наиболее жестко регулируется на этапе сборки клеточной перегородки. Именно длительность этого этапа определяет теоретически возможное минимальное время генерации.
7. Этап транспорта субстратов - обычно его скорость точно сбалансирована со скоростью метаболизма соответствующих субстратов (для большинства сахаров и органических кислот), а иногда превышает ее (для аминокислот). В последнем случае в клетке формируется резерв (пул) субстратов, способный оказывать разнообразное, в том числе тормозящее, действие на метаболизм клетки, если отсутствует транс-регуляторное ингибирование транспорта этих субстратов из среды их внутриклеточным.
При некоторых условиях транспорт оказывается лимитирующим этапом метаболизма; например, при дефиците в среде необходимых субстратов и кофакторов, в частности в случае микроорганизмов, не способных к синтезу данных веществ (ауксотрофы) или осуществляющих этот синтез с пониженной скоростью (брадитрофы). Аналогичная ситуация создается при недостаточной эффективности транспортных систем («криптические» мутанты), даже при наличии избытка субстрата в среде.
8. Этап выделения продуктов может лимитировать рост, если продукт обладает ингибиторным или отрицательным регуляторным действием на метаболизм. В этих случаях в клетке может вырабатываться специальный механизм (мембранный транспортный канал) для активного удаления указанных веществ.
В тех случаях, когда транспортный процесс становится «узким местом», лимитирующим общую скорость метаболизма, воздействие, активирующее транспортный процесс или избирательно повышающее проницаемость клеточной оболочки, может положительно влиять на скорость роста микроорганизма.