9.4. Методы изучения обмена веществ

Методы изучения процессов метаболизма можно подразделить на две основные группы: методы изучения метаболизма на целых организмах и аналитически дезинтегрирующие методы.

Изучение процессов метаболизма на целом организме.

В опытах на животных с экспериментальным диабетом, у которых с мочой выводятся большие количества глюкозы, было установлено, что введение таких аминокислот, как аланин, серии, глутаминовая кислота, вызывает еще более усиленное выведение глюкозы с мочой. На этом основании было сделано заключение, что эти аминокислоты могут служить метаболическими предшественниками глюкозы. На целых организмах также установлено, что мочевина, содержащаяся в моче многих млекопитающих, представляет собой главный продукт катаболизма белковых тел. Исследования на целом организме - наиболее старый метод, но он значительно обновился в результате применения изотопов (меченых атомов).

Обычно используются либо стабильные изотопы элементов, отличающихся по массе от широко распространенных в организме элементов (тяжелые изотопы) либо радиоактивные изотопы. Из стабильных изотопов чаще используют изотопы водорода с массой 2 (дейтерий, Н), азот с массой

(N), углерод с массой (С) и кислород с массой (О). Из радиоактивных изотопов применяются изотопы водорода (тритий, Н), фосфора (РиР), углерода (С), серы (S), йода (I), железа (Fe), натрия (Na) и др.

Пометив при помощи стабильного или радиоактивного изотопа молекулу исследуемого соединения и введя его в организм, определяют затем меченые атомы или содержащие их химические группы в определенных соединениях, и, открыв их делают заключение о путях превращения меченого вещества в организме. С помощью изотопного метода можно установить время пребывания вещества в организме, которое с известным приближением характеризует период его полураспада, т. е. время, за которое количество изотопа или меченого соединения уменьшается вдвое, или получить точные сведения относительно проницаемости мембран отдельных клеток.

Изотопы применяются также, чтобы установить, является ли данное вещество предшественником или продуктом распада другого соединения. Наконец, при существовании нескольких путей обмена веществ можно определить, какой из них превалирует.

Аналитически-дезинтегрирующие методы. Принцип этих методов состоит в поэтапном упращении, а точнее дизинтеграции сложной биологической системы с целью изолирования отдельных ее частей. Если рассматривать эти методы в нисходящей последовательности, т.е. от более сложных к более простым системам, то их можно расположить в следующем порядке: удаление отдельных органов, метод тканевых срезов и клеточных культур, получение гомогенатов и субклеточных фракций частичная или полная реконструкция ферментной системы in vitro с использованием ферментов, коферментов и других компонентов реакции.

Удаление органов. При удалении органов имеются два объекта исследования: организм без удаленного органа и изолированный орган. В частности, путем изучения перфузата в опытах с изолированными органами было установлено, что печень служит главным местом образования кетоновых тел и мочевины.

Метод тканевых срезов и клеточных культур. Получив тонкие срезы органа (ткани) при помощи микротома, их помещают в специальную среду содержащую те или иные соединения, и при определенных температуре и составе газовой среды (опыты обычно проводят в сосудах аппарата Варбурга) исследуют получающиеся при этом продукты. Например, с помощью такой методики можно изучать тканевое дыхание (потребление кислорода и выделение углекислого газа.

Одним из подходов к изучению метаболизма является применение культуры клеток. При этом появляется возможность использовать «чистую» однородную клеточную популяцию, практически свободную от примеси других клеток. Особенно важен данный подход в тех случаях, когда необходимо исключить неирогормональное влияние на изучаемые процессы метаболизма.

Гомогенаты и отдельные субклеточные фракции. Разрушение клеточных мембран делает возможным непосредственный контакт между содержимым клетки и добавленными соединениями. Это дает возможность установить, какие ферменты, коферменты и субстраты имеют значение для исследуемого процесса.

Применение метода дифференциального центрифугирования гомогенатов позволяет изучать процессы обмена веществ, связанные с различными органеллами клетки митохондриями, лизосомами. рибосомами. ядром и др. Например для изучения путей и механизмов синтеза белка используют изолированные рибосомы, а для исследования окислительных реакций цикла Кребса или цепи дыхательных ферментов служат митохондрии.

Использование с целью интеграции высокоочищенныхферменпюв и коферментов. С помощью данного метода, например, стало возможным полностью воспроизвести систему брожения, которая имеет все существенные признаки брожения дрожжей.