- •Тканевая селекция земляники на устойчивость к комплексу грибных патогенов
- •Введение
- •1. Требования к организации работ, состав питательных сред
- •2. Сомаклональная изменчивость каллусных клеток и методы повышения ее частоты
- •3.Выбор исходного экспланта, индукция и культивирование каллусов
- •4. Тканевая селекция земляники на устойчивость к фитопатогенным грибам
- •4.1. Приготовление селективных сред
- •4.2. Отбор каллусов на резистентность к культуральным фильтратам фитопатогенных грибов
- •5. Индукция морфогенеза из изолированных тканей земляники
- •6. Клональное микроразмножение и укоренение побегов земляники. Адаптация растений-регенерантов к выращиванию в почве
- •7. Тестирование растений-регенерантов земляники на устойчивость к фитопатогенам и их морфо-биологическое описание
- •Заключение
- •Литература
- •394087, Воронеж, ул. Мичурина, 1
3.Выбор исходного экспланта, индукция и культивирование каллусов
Для получения культуры каллусов земляники исходный эксплант высаживают на среду каллусообразования.
По определению Х.М. Чайлахяна с соавторами [45] исходным эксплантом является фрагмент ткани или органа, инкубируемый самостоятельно или используемый для получения первичного каллуса. У земляники в качестве первичного экспланта могут быть взяты фрагменты листьев, корней или побегов.
Как показывает опыт проведения тканевой селекции земляники в лаборатории биотехнологии ВНИИГиСПР им. И.В. Мичурина, существенных различий, между каллусами разного происхождения не наблюдается. Поэтому мы рекомендуем в качестве исходных эксплантов использовать листья, как наиболее удобный объект. Предпочтение следует отдавать молодым листьям.
Листья можно брать с растений, произрастающих в грунте, или с растений, культивируемых на искусственной питательной среде.
При введении в культуру листовых эксплантов с растений, находящихся в грунте, необходима стерилизация. Сначала листья промывают в проточной воде, затем стерилизуют. В качестве стерилизующих растворов можно использовать 5-9 % (50-90 г/л) гипохлорит натрия или кальция, 10 %(100 г/л) перекись водорода, 0,1 % (1 г/л) диацид или 0,1 % (1 г/л) сулему.
Наилучшая стерилизация, на наш взгляд, достигается при использовании раствора сулемы, в который нужно поместить листья на 45-180 секунд, в зависимости от их возраста и размера. Для стерилизации молодых и слабо опушенных лмстьев время стерилизации не должно превышать 45-60 секунд. Листья сортов с сильным опушением следует стерилизовать не менее 90-120 секунд. Затем следует трижды промыть их дистиллированной водой.
После описанной обработки, манипулируя пинцетом и скальпелем (или ножницами) листья в ламинар-боксе разрезают на сегменты 0,5-I см2 и помещают горизонтально на агаризованную питательную среду.
В литературе нет единого мнения по поводу того, какой стороной лучше помещать листья на питательную среду [14, 15]. В наших опытах помещение листовых эксплантов земляники верхним эпидермисом к поверхности среды оказалось более эффективным для каллусогенеза.
Можно исключить процесс стерилизации, используя для взятия листовых эксплантов растения, культивируемые на искусственных средах. Методика получения таких растений достаточно подробно описана и сравнительно проста [15].
Небольшие листовые пластинки с растений, культивируемых in vitro, можно помещать на искусственную питательную среду целиком. Однако, чтобы ускорить каллусогенез лучше все же сделать срезы по краям. Именно на этих срезах и на срезе черешка начнет образовываться каллус.
У всех изучавшихся сортов земляники индукция каллусов успешно происходит на среде Мурасиге и Скуга в присутствии ауксинов. Однако, у земляники в связи с различиями в гормональном составе сред наблюдаются сортовые различия в интенсивности каллусообразования.
Так сорт Фейерверк интенсивно образовывал каллусы в присутствии 2-5 мг/л ИМК. У сортов Рубиновый кулон и Урожайная ЦГЛ наибольшая интенсивность каллусообразования наблюдалась в присутствии 2-5 мг/л НУК. Однако, каллусы, образовавшиеся в присутствии НУК, быстро темнели вследствие выделения фенолов и снижали способность к регенерации. Чтобы избежать этого, можно добавить в среду глутатион восстановленный в концентрации 100 мкМ или аскорбиновую кислоту (750 мкМ). Однако, если каллусные культуры предназначены для дальнейшего использования в тканевой селекции на устойчивость к стрессорам, применение антиоксидантов нежелательно, т.к. искажает картину действия селективного агента.
Применение ИУК, даже в оптимальных концентрациях (1-2 мг/л) приводило к образованию каллусов лишь у 5,5- 8,67 % эксплантов.
Наиболее универсальным веществом из группы ауксинов для всех изучаемых сортов оказалась 2,4-Д в концентрациях 2-4 мг/л. Образование и рост каллусов в ее присутствии шли на первых этапах значительно медленнее, чем на средах с НУК. Однако каллусы не темнели и сохраняли способность к регенерации после длительного субкультивирования.
Было отмечено также, что 2,4-Д значительно увеличивает частоту сомаклональных изменений, что делает данный ауксин особенно ценным для тканевой селекции.
Для индукции первичного каллуса экспланты земляники после высадки на среду помещают в темноту и инкубируют при t = 25± 2°С. Обычно, к концу четвертой недели экспланты образуют каллусы (у сорта Горноуктусская через 1,5 месяца). Для поддержания и размножения через каждые 35-40 дней их нужно пересаживать на свежие среды, для чего в ламинар-боксе стерильным скальпелем делят исходный каллус на кусочки размером около 0,3 см3 и переносят в культуральные сосуды со свежей средой. Условия выращивания аналогичны условиям, при которых происходило инициирование каллусных культур.
Примерно через 2,5-3 месяца общая масса каллусных культур становится достаточной для начала работ по тканевой селекции.