- •Для выполнения лабораторных работ
- •Задание 3. Определение триптофана в зерне сельскохозяйственных растений
- •Задание4. Определение аминокислот методом тонкослойной хроматографии (тсх)
- •Задание 7. Определение изоэлектрической точки белков
- •Задание 8. Специфичность действия ферментов
- •Задание 9. Определение оптимальных значений pH для различных ферментов
- •Задание 11. Обнаружение каталазы и пероксидазы в растительных объектах
- •Обнаружение пероксидазы
- •Задание 12. Определение активности тирозиназы
- •Углеводы
- •Задание 16. Свойства моносахаридов и дисахаридов. Ферментативный гидролиз сахарозы
- •Задание 18. Определение сахарозы в сахарной свекле на поляриметре
- •Задание 20. Определение констант жиров
- •Витамины
- •Задание 23. Определение содержания аскорбиновой кислоты в растениях
- •Органические кислоты Задание 24. Определение общей кислотности
- •Задание 25. Определение свободных органических кислот
- •Небелковые азотистые соединения Задание 26. Определение нитратного азота потенциометрическим методом
Задание 9. Определение оптимальных значений pH для различных ферментов
Оборудование и реактивы: 1) 1% р-р клейстеризованного крахмала; 2) солод, разведенный водой в 10-20 раз и отфильтрованный; 3) 0,15 М р-р Na2HPO4 · 2H2O; 4) 0,15 М р-р KH2 PO4; 5) р-р йода в йодистом калии в капельнице (4 г йодистого калия и 2 г йода в 100 мл воды); 6) пробирки в штативе; 7) пипетки мерные на 100 мл; 8) фильтры бумажные; 9) воронки.
Характерным свойством ферментов является их чувствительность к изменению реакции среды. Активность ферментов резко меняется в зависимости от величины pH. Объясняется это тем, что при изменении pH меняется величина или даже знак заряда молекулы фермента, а в некоторых случаях и заряд молекулы субстрата. Все это приводит к тому, что успешное образование фермент-субстратного комплекса происходит только при вполне определенном значении pH.
Для определения оптимального значения pH фермента готовится ряд буферных растворов с различной величиной pH. К каждому раствору добавляется фермент. Величина pH раствора, в котором количество продуктов реакции окажется наибольшим, является оптимальным для данного фермента.
Определение оптимума pH для -амилазы основано на том, что -амилаза катализирует гидролитическое расщепление крахмала с образованием, главным образом, декстринов и небольшого количества мальтозы. За ходом реакции удобно следить по реакции с йодом. Образующиеся при гидролизе декстрины дают с йодом различную окраску в зависимости от величины молекулы декстрина. Ход гидролиза схематически можно представить так: крахмал амилодекстрины эритродекстрины ахродекстрины мальтодекстрины
Окраска с йодом в ходе гидролиза меняется следующим образом: синяя фиолетовая вишневая светло-коричневая бесцветная. В качестве источника -амилазы можно использовать солод.
Ход работы:
Небольшое количество солода развести дистиллированной водой в 10-20 раз и профильтровать. Приготовить 8 растворов с различными значениями pH: от 5,3 до 8,8 путем смешивания 0,15 М Na2HPO4 •2H2O и KH2PO4 в указанных соотношениях:
pH |
Na2HPO4, мл |
KH2PO4, мл |
pH |
Na2HPO4, мл |
KH2PO4, мл |
5.3 |
0.27 |
9,73 |
7,3 |
7,64 |
2,36 |
5.8 |
0.83 |
9,17 |
7,8 |
9,11 |
0,89 |
6.3 |
2.31 |
7,69 |
8,3 |
9,73 |
0,27 |
6.6 |
5.00 |
5,00 |
8,8 |
9,93 |
0,07 |
Все 8 пробирок заполняют буферными растворами с различными значениями pH (по 2,5 мл) с добавлением в каждую из них 5 мл раствора крахмала и 2,5 мл раствора солода. Содержимое пробирок необходимо тщательно перемешать и оставить на 15-20 мин. при комнатной температуре. Затем во все пробирки добавить по 2-3 капли раствора йода, пронаблюдать за развитием окраски и результаты занести в таблицу:
pH реакционной смеси |
Получаемая окраска |
pH реакционной смеси |
Получаемая окраска |
5,3 |
|
7,3 |
|
5,8 |
|
7,8 |
|
6,3 |
|
8,3 |
|
6,8 |
|
8,8 |
|
Определить, при каком значении pH гидролиз идет наиболее интенсивно и каково, следовательно, оптимальное значение pH для -амилазы, сравнить ферментативную активность солода в зависимости от рН реакционной смеси.
Задание 10. Влияние температуры на активность ферментов
Оборудование и реактивы: водяная баня, холодильник, весы, фарфоровые ступки, термометр, колбы на 100-200 мл, пипетки на 1, 2, 5, 10 мл, пробирки;
1–%-ный раствор сахарозы, фелингова жидкость, 0,1 М фосфатный буфер, рН 7,0.
Материалы: прессованные или сухие дрожжи.
На активность ферментов оказывает влияние температура: низкая температура снижает активность, а её повышение от минимальной до оптимальной увеличивает активность ферментов. Температура свыше 600 С денатурирует белки, что сопровождается потерей ферментативной активности. Инвертаза вызывает гидролитическое расщепление сахарозы на глюкозу и фруктозу .
Ход работы
1.Выделение фермента: 2 г сухих дрожжей растирают в течении 5-10 мин с кварцевым песком и 5 мл фосфатного буфера, затем добавляют 20 мл буфера, нагретого до 600 С и через 20 мин центрифугируют при 3000 об\мин в течении 10 мин.
2.Определение активности инвертазы. В каждую из четырёх пробирок наливают по 1 мл вытяжки дрожжей и пробирки помещают в разный температурный режим: 1 – в холодильник, 2 – при комнатной температуре, 3 – в водяную баню при температуре 4005 С, 4 – кипятят. Добавляют во все пробирки по 5 мл раствора сахарозы, перемешивают и через 15 мин во все пробирки приливают по 5 мл фелинговой жидкости и нагревают в кипящей водяной бане. Выпадает красный осадок закиси меди, по количеству которого судят о влиянии температуры на активность инвертазы.