- •Предисловие
- •Введение в биохимический практикум
- •I. Материал и его подготовка для биохимических исследований
- •2. Основные методы разделения и выделения веществ при биохимиеских иследованиях
- •3. Основные приборы, используемые в практикуме
- •Фотометрические приборы
- •Флуориметрические приборы
- •Центрифуги
- •Приборы для электрофореза
- •4. Применение единиц си для выражения результатов клинико-биохимических исследований Общие положения
- •Некоторые рекомендации по применению единиц си в клинико-биохимических исследованиях
- •1.Химическая природа простых белков
- •Работа 1. Качественные (цветные) реакции на функциональные группы белков и аминокислот
- •Работа 2. Качественный анализ некоторых белковых препаратов
- •Работа 3. Хроматографический метод разделения аминокислот
- •2. Исследование физико-химических свойств белков
- •Работа 4. Диализ белков
- •Работа 5. Определение изоэлектрической точки белка
- •Приготовление буферных систем для определения иэт казеина
- •Работа 6. Исследование денатурации белков
- •Работа 7. Исследование высаливания белков
- •3. Количественный анализ белков
- •Работа 8. Количественное определение белка в сыворотке крови
- •4. Состав и свойства сложных белков
- •Работа 9. Химическая природа гемпротеидов
- •Работа 10. Выявление углеводного компонента гликопротеидов
- •Работа 11. Качественные реакции на фосфопротеиды
- •Работа 12. Количественное определение содержания сиаловых кислот в сыворотке крови методом Гесса
- •Работа 13. Химическая природа нуклеопротеидов
- •Нуклеиновые кислоты
- •1. Исследование химической природы нуклеиновых кислот
- •Работа 14. Качественные реакции на компоненты нуклеиновых кислот
- •Количественные методы определения нуклеиновых кислот
- •Работа 15. Спектрофотометрический метод количественного определения нуклеиновых кислот по а.С.Спирину
- •Работа 16. Фотоколориметрические методы количественного определения нуклеиновых кислот
- •Работа 17. Исследование фосфолипидов
- •Работа 18. Качественные реакции на стероиды
- •Ферменты
- •Сравнительное действие ферментов и небиологических катализаторов
- •Работа 19. Сравнение действия α-амилазы слюны и соляной кислоты на реакцию гидролиза крахмала
- •2. Выявление ферментов, относящихся к разным классам
- •Работа 20. Обнаружение оксидоредуктаз в биологическом материале
- •Работа 21. Обнаружение холинэстеразы
- •В сыворотке крови экспресс-методом Херцфельда и Штумпфа
- •Работа 22. Определение активности фруктозо-1,6-бисфосфатальдолазы в сыворотке крови по методу в.И.Товарницкого и е.Н.Волуйской
- •Построение калибровочного графика
- •Работа 23. Определение глюкозофосфат-изомеразы
- •В сыворотке крови
- •3. Изучение кинетических свойств ферментов
- •Работа 24. Кинетика ферментативных реакций на примере α-амилазы слюны
- •4. Специфичность действия ферментов
- •Работа 25. Демонстрация абсолютной субстратной специфичности
- •5. Модификаторы активности ферментов
- •Работа 27. Активаторы и ингибиторы α-амилазы слюны
- •Мышечной ткани
- •Работа 29. Неконкурентное ингибирование каталазы крови
- •6. Количественное определение активности ферментов
- •Работа 30. Количественное исследование активности препарата лактатдегидрогеназы по Корнбергу
- •Работа 31. Фотоколориметрический метод исследования активности лактатдегидрогеназы в сыворотке крови по Севелу и Товареку
- •Работа 32. Определение активности щелочной фосфатазы в сыворотке крови по Боданскому
- •7. Исследование изоферментов
- •Работа 33. Разделение изоферментов лактатдегидрогеназы сыворотки крови методом электрофореза в полиакриламидном геле по Дитцу и Лубрано
- •Работа 34. Определение активности γ-глутамилтрансферазы в сыворотке крови
- •Биохимия пищеварения
- •Работа 35. Исследование кислотных компонентов желудочного сока
- •Работа 36. Определение кислотности желудочного сока диагностическим набором «Ацидотест»
- •Работа 37. Гидролиз белка ферментами пищеварительного тракта
- •Работа 38. Изучение динамики гидролиза триацилглицеринов под действием панкреатической липазы
- •Энергетический обмен (биоэнергетика)
- •1. Исследование процессов биологического окисления в животных тканях Работа 39. Обнаружение цитохромоксидазы в мышечной ткани
- •Работа 40. Демонстрация процесса окислительного фосфорилирования и действия на него разобщителей
- •Работа 41. Выявление гликолиза в мышечной ткани
- •Работа 42. Анализ адениннуклеотидов методом ионообменной тонкослойной хроматографии
- •Работа 43. Определение активности креатинфосфокиназы в сыворотке крови по Эннору и Розенбергу
- •Анализ пигментов и окислительных процессов фотосинтезирующих организмов
- •Работа 44. Качественные реакции на пигменты растений
- •Работа 45. Определение активности пероксидазы в растительном материале по методу а.Н.Бояркина
- •Обмен углеводов
- •Работа 46. Определение содержания глюкозы в крови
- •Работа 47. Количественное определение содержания глюкозы в крови глюкозооксидазным методом
- •Работа 48. Определение содержания молочной кислоты в крови по Баркеру и Саммерсону
- •Работа 49. Определение содержания пировиноградной кислоты в крови по Фридеману и Хаугену
- •Обмен липидов
- •Работа 50. Определение содержания суммарных липидов в сыворотке крови по реакции с сульфофосфованилиновым реактивом
- •Работа 51. Определение содержания β- и пре- β-липопротеидов сыворотки крови турбидиметрическим методом по Бурштейну и Самай
- •Работа 52. Определение содержания холестерина в сыворотке крови по методу Илька
- •Работа 53. Определение содержания общих фосфолипидов в сыворотке крови
- •Работа 54. Разделение липидов сыворотки крови методом тонкослойной хроматографии
- •Обмен белков и аминокислот
- •Работа 55. Определение содержания белковых фракций сыворотки крови турбидиметрическим методом
- •Работа 56. Определение активности катепсинов в сыворотке крови по а.А.Покровскому, а.И.Арчакову и о.Н.Любимцевой
- •Катепсины
- •Работа 57. Определение активности аспартат- и аланин- аминотрансферазы в сыворотке крови по Райтману и Френкелю
- •Работа 58. Определение активности гистидазы в сыворотке крови по Табору и Мелеру в модификации в.А.Буробина
- •Работа 59. Определение содержания свободного гидроксипролина в моче по Нейману и Логану в модификации п.Н.Шараева
- •Обмен азотсодержащих небелковых веществ
- •1. Исследование общих продуктов азотистого обмена
- •Работа 60. Количественное определение остаточного азота в крови фотоколориметрическим методом
- •Работа 61. Количественное определение мочевины в сыворотке крови и моче
- •Работа 62. Количественное определение креатина и креатинина по методу Брауна
- •2. Изучение обмена нуклеиновых кислот и нуклеотидов
- •Работа 63. Определение активности кислой дезоксирибонуклеазы (днКазы) в сыворотке крови по а.А.Покровскому, а.И.Арчакову и о.Н.Любимцевой
- •Работа 64. Определение содержания мочевой кислоты в сыворотке крови по методу Мюллера и Зейферта
- •3. Исследование порфиринового (пигментного) обмена
- •Работа 65. Определение билирубина и его фракций в сыворотке крови по Йендрашику, Клеггорну и Грофу
- •Молекулярная патология
- •1. Экспресс-диагностика патологии аминокислотного обмена Работа 66. Выявление гипераминоацидурии
- •Работа 67. Экспресс-методы диагностики фенилкетонурии
- •Работа 68. Диагностика тирозиноза пробой Миллона на тирозин
- •Работа 69. Выявление алкаптонурии пробой на гомогентизиновую кислоту
- •Работа 70. Выявление цистинурии иод-азидной пробой на цистин и гомоцистин в моче
- •2. Экспресс-диагностика патологий углеводного обмена Работа 71. Выявление пентозурии пробой Биаля
- •Работа 72. Выявление фруктозурии пробой Селиванова
- •Работа 73. Выявление мукополисахаридозов пробой с толуидиновым синим на мукополисахариды
- •Работа 74. Определение содержания порфобилиногена в моче
- •Работа 75. Количественное определение содержания дельта-аминолевулиновой кислоты в моче
- •Работа 76. Количественное определение содержания копропорфирина в моче по методу Соулсби в модификации Римингтона
- •Регуляторы обмена веществ
- •1. Исследование витаминов Работа 77. Качественные реакции на витамины
- •Работа 78. Определение содержания тиамина и рибофлавина флуориметрическим методом в поливитаминных препаратах
- •Работа 79. Количественное определение аскорбиновой кислоты в лекарственных растениях
- •2. Исследования гормонов, медиаторов и их метаболитов
- •Работа 80. Качественные реакции на белково-пептидные гормоны.
- •Работа 81. Качественные реакции на гормоны – производные аминокислот
- •Работа 82. Качественные реакции на стероидные гормоны и их метаболиты
- •Работа 83. Регуляция инсулином и адреналином уровня глюкозы в крови животных
- •Работа 84. Количественное определение гистамина в крови с диазотированным n-нитроанилином по н.В.Климкиной и с.И.Плитману
- •Исследование биологических жидкостей
- •1. Биохимические исследования крови Работа 85. Определение содержания гемоглобина в крови по его светопоглощению
- •Работа 86. Определение содержания фетального гемоглобина в эритроцитах крови человека
- •Работа 87. Определение содержания гликозилированного гемоглобина в эритроцитах крови фотоколориметрическим методом
- •Работа 88. Определение концентрации гаптоглобинов в сыворотке крови фотоколориметрическим методом
- •Работа 89. Проба Вельтмана в модификации Тейфеля на коллоидную устойчивость белков сыворотки крови
- •Работа 90. Определение активности α-амилазы в сыворотке крови амилокластическим методом
- •Работа 91. Определение содержания кальция в сыворотке крови мурексидным методом
- •Работа 92. Тимоловая проба по Хуэрго и Поппер
- •Работа 93. Сулемово-осадочная реакция
- •Работа 94. Количественное определение содержания железа в сыворотке крови
- •2. Биохимическое исследование мочи
- •Работа 95. Исследование физико-химических свойств мочи
- •Работа 96. Определение кетоновых тел и глюкозы в моче
- •Работа 97. Определение белка в моче по методу Бранденберга-Робертса-Стольникова
- •Работа 98. Качественное определение индикана в моче
- •Работа 99. Обнаружение некоторых пигментов в моче.
- •Метаболизм ксенобиотиков
- •Исследование процессов окисления и конъюгации ксенобиотиков Работа 100. Выявление дыхательной активности микросом
- •Работа 101. Исследование окислительного n-деметилирования в микросомах печени по Нашу
- •Работа 102. Определение гидроксилазной активности микросом печени по Като и Жилете
- •Работа 103. Метод оценки активности монооксигеназ эндоплазматической сети клеток печени по выделению метаболитов амидопирина с мочой по т.А.Попову и о.Д.Леоненко
- •Работа 104. Определение активности алкогольдегидрогеназы в сыворотке крови по Шкурски и др. С дополнениями и.В.Бокия, м.С.Усатенко и в.Ф.Трюфанова
- •Работа 105. Определение ацетилирующей способности организма по выделению с мочой свободной и ацетилированной форм сульфаниламидов по а.М.Тимофеевой в модификации г.А.Пономарева
- •Работа 106. Выявление ацетилирования (инактивации) гидразида изоникотиновой кислоты (гинк) в организме
- •Исследование пероксидного окисления липидов биологических мемебран
- •Работа 107. Определение чувствительности эритроцитов к пероксидному гемолизу
- •Работа 108. Определение скорости пероксидного окисления липидов в биомембранах
- •Приложение
- •2.Биохимические показатели плазмы крови
- •1.Общие клинические нормы
- •2. Специальное исследование мочи
- •Желудочный сок
- •2. Фосфатный буфер (0,1 м, рН 5,8-8,0)
- •3. Трис-буфер (0,1 м, рН 7,1-9,2)
- •4. Ацетатный буфер (0,2 м, рН 3,6-5,8)
- •5. Глициновый буфер (0,05 м, рН 8,6-10,6)
- •3. Приготовление некоторых реактивов
- •Оглавление
Предисловие
Практикум по биологической химии, изданный в 1986 году, подвергся существенной переработке, а также дополнен новыми лабораторными работами в разделах белки, липиды, биохимия пищеварения, обмен углеводов, белков, молекулярной патологии и особенно в разделе исследований биологических жидкостей.
Практикум содержит лабораторные работы разной степени сложности, позволяющие студентам приобрести навыки самостоятельного биохимического анализа материала. Ряд работ можно использовать при проведении студентами учебно-исследовательской и научной работы.
Каждый раздел имеет краткое введение и ссылки на учебник Е.А.Строева «Биологическая химия».
В начале каждой работы приведен перечень реактивов, оборудования и материалов, требуемых для ее выполнения. Прописи приготовления некоторых многокомпонентных реактивов, буферных растворов и перечень биохимических констант вынесены в приложение.
В практикуме представлено значительное число унифицированных методов, применяемых в клинике для диагностики заболеваний, приведены скрининг-тесты, для выявления молекулярных болезней, биохимические методы анализа лекарственного растительного сырья и биогенных препаратов. Кроме того, при описании лабораторных работ кратко излагается практическое использование данного метода в медицинской, фармацевтической и биохимических исследованиях.
При переработке практикума авторы руководствовались опытом преподавания биохимии на лечебном, фармацевтическом факультетах Рязанского государственного медицинского университета имени академика И.П.Павлова.
Введение в биохимический практикум
Биохимические исследования проводятся для получения информации о многочисленных химических и физикохимических процессах, протекающих в клетках и тканях живых организмов в норме и при патологии. В зависимости от цели исследования используются специальные приемы обработки биологического материала и соответствующие физикохимические методы, которыми студенты овладевают при выполнении биохимического практикума. Однако прежде чем приступить к изучению конкретных методик исследования, необходимо познакомиться с некоторыми общими положениями и приемами практической биохимии.
I. Материал и его подготовка для биохимических исследований
Объект биохимических исследований. В экспериментальных условиях можно получить любой биологический материал для биохимических исследований. В клинике такие возможности ограничены. Для клинико-биохимических анализов используют:
а) биологические жидкости внутренних сред организма – плазму (или сыворотку) крови, спинно-мозговую жидкость, лимфу, амниотическую, внутрисуставную и внутриглазную жидкости, а также эксудат и транссудат;
б) биологические выделения (экскреты) – мочу, желчь, слюну, желудочный и кишечный соки, кал, пот, слезную жидкость, женское молоко и молозиво, семенную жидкость, слизистые выделения.
Получение этих жидкостей и экскретов относительно несложно и безвредно. В то же время изучение биохимических процессов непосредственно в клетках, тканях и органах человека сопряжено с большими трудностями. Прижизненное взятие кусочков тканей и органов – биопсия – осуществляется во время операции или с помощью специального инструментария, что позволяет получить материал для исследований – биоптат. Ввиду сложности, а порой и небезвредности получения биоптатов их используют для биохимических анализов в клинике относительно редко. Лишь клетки крови, процедура получения которых проста, все чаще служат объектом обстоятельных клинико-биохимических лабораторных исследований. В судебно-медицинских целях и для более обстоятельного изучения причин и исхода болезни проводятся посмертные биохимические анализы тканей и органов.
Объектом биохимических исследований в фармацевтической практике служит биологический материал животных и сами лекарственные препараты. Взятие для анализа биологического материала экспериментальных животных используется при стандартизации и контроле качества лекарств. Например, по концентрации глюкозы в крови проводится стандартизация и контроль качества препаратов инсулина. В то же время анализ таких биологических препаратов, как ферментные, проводится только биохимическими методами.
Получение и хранение проб для биохимических исследований. Точность биохимического анализа зависит от правильного отбора и при необходимости хранения проб биологического материала. Остановимся на ряде общих положений этого раздела.
Моча чаще всего исследуется в клинико-биохимических лабораториях. Для этой цели, как правило, собирают в стеклянную или полиэтиленовую бутыль суточную мочу (для специальных случаев собирают ее порционно) и хранят в холодильнике. Иногда анализируют отдельно ночную и дневную порции мочи. Бактериальные загрязнения обычно мало влияют на результаты исследования мочи, но если необходимо задержать рост микроорганизмов, то добавляют консервант, например, толуол. При некоторых специальных исследованиях, например, при определении стероидных гормонов и их метаболитов, в мочу добавляют концентрированную HCl (из расчета 10мл на 1 л мочи) и т.д. При определении ферментов целесообразно проводить анализ свежевыпущенной мочи.
Для сбора мочи у мелких лабораторных животных (белые крысы или мыши) их помещают в стеклянные выделительные воронки (рис.1), обычно на 12 или 24 ч. Моча через стеклянную воронку для фильтрования, в отверстие которой вставлен стеклянный «гвоздик» (для задержки фекалий), стекает в мерный цилиндр.
Кровь для исследования берут утром натощак.
Капиллярную кровь получают чаще всего из пальца руки, у маленьких детей ее берут путем прокола мочки уха, большого пальца ноги или пятки. На лабораторных занятиях обычно используется для биохимических исследований капиллярная кровь.
Техника взятия крови из пальца для лабораторного анализа. Как правило, кровь берут из безымянного пальца левой руки. Если по каким-то причинам это сделать невозможно, то ее получают из любого другого пальца. Сначала участок кожи пальца обследуемого очищают ватным тампоном, смоченным этиловым спиртом, а затем эфиром. Левой рукой захватывают безымянный палец левой руки обследуемого и слегка сдавливают мякоть пальца в месте предполагаемого укола. Наиболее удобно делать укол в мякоть пальца слева от срединной линии, несколько отступя от ногтя. Прокол кожи производят стерильной иглой одноразового пользования, причем иглу располагают строго перпендикулярно относительно места укола и вводят почти на всю длину ее острия, рассекая кожу поперек папиллярных линий (это способствует большему зиянию ранки и более длительному кровотечению). Появившуюся каплю крови удаляют ватным тампоном. Затем кровь, свободно выделяющуюся из ранки или после легкого надавливания на мякоть пальца, берут для анализа с помощью микропипетки, обычно предварительно смоченной антикоагулянтом (противосвертывающим веществом). Кончиком микропипетки следует касаться капель выступающей крови, избегая попадания в нее пузырьков воздуха. Кончик микропипетки, куда забирают кровь, должен располагаться несколько выше, чем другой ее конец, что помогает лучшему поступлению крови в микропипетку. После того как кровь будет взята, к ранке прикладывают ватный тампон, смоченный настойкой иода, и прижимают палец к ладони до остановки кровотечения.
Для получения большого количества крови ее берут из локтевой вены (у маленьких детей из подкожных вен головы) обязательно с соблюдением необходимых мер предосторожности. В зависимости от целей биохимическому исследованию может подвергаться цельная кровь или ее составные части – форменные элементы (клетки), плазма или сыворотка. Если для анализа необходимы плазма и клетки крови, то взятую из вены кровь смешивают в пробирке с подходящим антикоагулянтом, который предотвращает ее свертывание. В качестве антикоагулянта обычно используют раствор оксалата или цитрата натрия (концентрации 0,1 моль/л), который связывает ионы кальция в крови и не дает ей свернуться. В тех же целях применяется и гепарин, которого добавляют около 2 мг на 10 лмл крови. Благодаря большому отрицательному заряду он взаимодействует с белками, участвующими в свертывании крови, и препятствует образованию сгустка. Взятую цельную кровь с добавлением антикоагулянтов используют для получения плазмы и форменных элементов путем центрифугирования.
Для получения сыворотки кровь собирают в сухую пробирку без антикоагулянта и оставляют свертываться, помещая пробирку в холодильник на ночь. Выделившуюся после образования сгустка сыворотку отсасывают пипеткой и используют для анализа. Сыворотка отличается от плазмы тем, что в ней отсутствуют фибриноген и другие белки крови, участвующие в ее свертывании и вошедшие в сгусток. Взятую кровь хранят в холодильнике.
Другие биологические жидкости и экскреты берут, как правило, с помощью специального инструментария и хранят в холодильнике.
Биоптаты получают с помощью скальпеля или специальных игл для биопсии, или с помощью специальной эндоскопической техники, снабженной инструментом для взятия кусочков ткани. Хранить ткани можно в замороженном состоянии при -20С. Перед исследованием их размораживают.
Обработка биологического материала. В зависимости от вида биохимического исследования полученный биологический материал обычно подвергают предварительной обработке. Как правило, при проведении исследования требуется определить содержание какого-нибудь нормального или патологического компонента в биологическом материале или изучить отдельные биохимические реакции, катализируемые ферментами.
Плазма или сыворотка крови и другие биологические жидкости (включая экскреты) представляют собой смесь различных природных веществ, растворенных в водной среде. При определении ферментов биологическую жидкость используют для исследования целиком, не подвергая какой-либо обработке. Лишь при высокой концентрации фермента в средах их перед определением разводят. В то же время присутствие ферментов часто мешает определению в биологических жидкостях тех веществ, превращение которых они катализируют. Поэтому полученный материал сразу обрабатывают реактивом, прекращающим действие ферментов, и осаждающим как ферментные, так и любые другие белки. Для осаждения используют трихлоруксусную, хлорную, азотную, фосфорно-вольфрамовую, серную и другие кислоты, гидроксид бария с сульфатом цинка или просто термическую обработку биологического материала.
При биохимическом исследовании клеток, тканей и органов приемы их обработки усложняются, поскольку изучаемый компонент может быть локализован в каком-либо органоиде или даже его части, например, в мембране. Поэтому сначала клетки или ткань подвергают разрушению различными способами. Чаще всего применяют механическое разрушение ткани с помощью гомогенизатора. Он представляет собой стеклянный стакан, форма которого и размеры могут быть различны. В этот стакан помещают кусочек ткани, измельченный ножницами, и соответствующую жидкую среду (обычно раствор сахарозы, хлорида калия), позволяющую сохранить интактность выделяемых структурных образований клетки.
Растирание ткани осуществляется при движении вверх и вниз вращающегося в стакане гомогенизатора пестика, который соединен через привод с осью электромоторчика. На время гомогенизации стакан гомогенизатора помещают в лед, чтобы избежать нагревания и повреждения субклеточных структур.
В простейшем случае гомогенат получают, растирая ткань с толченым стеклом или кварцевым песком в фарфоровой ступке.
Возможно также разрушение ткани и клеток высокочастотными ультразвуковыми колебаниями и с помощью «осмотического шока». Последний метод используют при разрушении эритроцитов и других клеток крови. Он заключается в том, что при добавлении дистиллированной воды мембрана клеток разрывается от избыточного внутриклеточного осмотического давления.
Гомогенизация ткани и разрушение клеток – стадия обработки, предшествующая разделению клеточных компонентов.