Культивирование аэробных микроорганизмов.

Все способы глубинного культивирования аэробных микроорганизмов сво­дятся к увеличению поверхности соприкосновения питательной среды с кис­лородом воздуха. Следует иметь в виду, что при глубинном культивировании в жидких средах микроорганизмы используют растворенный кислород. Вместе с тем растворимость кислорода в воде невелика, поэтому, чтобы обеспечить рост аэробных микроорганизмов в толще среды, ее необходимо постоянно аэриро­вать.

При аэрации среды учитывают два показателя: интенсивность и степень аэрации. Интенсивность аэрации характеризуется скоростью растворения кис­лорода в единице объема культуральной жидкости за единицу времени. Сте­пень аэрации — это объем воздуха, продуваемый через определенный объем среды за единицу времени.

Наиболее простой и широко распространенный в лабораторной практике способ глубинного культивирования — выращивание на качалках, обеспечива­ющих встряхивание или вращение колб и пробирок с 100 — 200 об/мин и более. Чем больше частота вращения, тем больше соприкосновение среды с возду­хом и выше насыщение ее кислородом. Увеличить аэрацию среды при работе на одной и той же качалке можно за счет уменьшения объема среды или при­менения колб с отбойниками — вдавливаниями стекла внутрь в виде 4 — 8 отростков длиной 2 — 3 см. При вращении колб с отбойниками поверхность соприкосновения среды с воздухом заметно увеличивается благо­даря разбрызгиванию жидкости. Чем больше отбойников, тем сильнее раз­брызгивание жидкости, тем выше аэрация.

Интенсивность аэрации при выращивании микроорганизмов на качалке косвенно характеризуют сульфитным числом. В основе метода лежит определе­ние скорости окисления сульфита в сульфат в присутствии меди как катализа­тора.

Сульфит, оставшийся неокисленным, связывают йодом. Количество йода, не вступившего в реакцию с сульфитом, оттитровывают тиосульфатом. Таким образом выясняют, сколько сульфита в определенном объеме его раствора за определенное время окисляется кислородом воздуха. Метод дает лишь сравни­тельные данные о скорости поглощения кислорода раствором сульфита в усло­виях аэрации, аналогичных опытным.

Определение сульфитного числа.

Готовят следующие реактивы: 0,1 н. раствор тио­сульфата (Na₂S₂О₃) с установленным титром; 1%-й раствор крахмала; 0,1 н. свежепри­готовленный раствор йода; 0,8 н. свежеприготовленный раствор сульфита Na₂SО₃ с CuSО₄ Количество сульфата меди в растворе сульфита натрия соответствует 0,001 М. Сернокислую медь растворяют отдельно в небольшом объеме воды, а затем по расчету вносят в раствор сульфита.

Следует выяснить, какое количество йода полностью связывает количество взятого для работы сульфита. Для этого к 5 мл свежеприготовленного раствора сульфита в конической колбе на 250 мл приливают из бюретки раствор йода до появления светло-коричневой окраски. Так определяют объем раствора йода а. Затем добавляют 0,5 мл 1%-го раствора крахмала и титруют 0,1 н. раствором тиосульфата до исчезновения си­ней окраски. На титрование должно пойти 1 — 3 мл тиосульфата. Далее проверяют пра­вильность определения объема йода и титруют его тиосульфатом, так же, как в преды­дущем случае. Если объем йода подобран правильно, то на его титрование идет около 30 — 40 мл тиосульфата.

Для определения сульфитного числа используют конические колбы объемом 750 мл без отбойников и с отбойниками. Сульфит в колбы наливают в количестве 300 мл, 100 мл (колбы без отбойников) и 100 мл (колба с отбойниками). Затем из каждой колбы отбирают по 5 мл сульфита в конические колбы на 250 мл, в которые заранее наливают по а мл раствора йода. Колбы закрывают часовыми стеклами и оставляют в темноте на 5-10 мин, затем споласкивают часовые стекла дистиллированной водой в ту же колбу, которую они закрывали, и титруют ее содержимое 0,1 н. тиосульфатом. Количество миллилитров тиосульфата, пошедшего на титрование, П_н записывают в таблицу.

Колбы с разными объемами сульфита помещают на определенное время на качалку. Время включения и выключения качалки замечают с точностью до 1 мин. К момен­ту остановки качалки через 15 — 20 мин в три колбы на 100 мл наливают подобранный для работы раствор йода а. Остановив качалку, отбирают из встряхиваемых колб по 5 мл раствора сульфита и сразу же приливают пробы к раствору йода. Снова включают качалку еще на 20 — 25 мин. Отобранные пробы выдерживают в темноте и снова титру­ют 0,1 н. раствором тиосульфата, как указано выше. Количество миллилитров тиосуль­фата П_х1 записывают в таблицу. В ту же таблицу вносят результаты П_х2, полученные титрованием пробы сульфита, отобранной через последующие 20 — 25 мин. Рекомендуемая продолжительность встряхивания колб с сульфитом подобрана специально для условий настоящего опыта. В других случаях она может быть иной.

Сульфит при аэрации окисляется в сульфат, поэтому на его связывание требуется все меньше йода и соответственно все больше тиосульфата идет на титрование свобод­ного йода. Данные титрования, близкие к данным титрования йода без сульфита, для расчетов не используют, так как они свидетельствуют о полном окислении последнего к моменту отбора проб, и результаты определения будут ошибочными.

Сульфитное число рассчитывают следующим образом:

скорость поступления кислорода в раствор сульфита (мг О₂/л/мин) = [(П_х - П_н)/Т] • (0,8а),

где П_н — количество 0,1 н. раствора тиосульфата (мл), пошедшее на титрование 5 мл раствора сульфата до аэрации; П_х — количество 0,1 н. раствора тиосульфата (мл), по­шедшее на титрование 5 мл раствора сульфита после аэрации; Т — время аэрации в минутах; 0,8 — количество кислорода (мг), идущее на окисление 1 мл 0,1 н. раствора тиосульфата; а — коэффициент пересчета на 1 л сульфита (в данном случае он равен 200, так как на титрование берут 5 мл сульфита). Для каждой колбы рассчитывают сульфитные числа после первого и второго периодов аэрации и берут среднее из двух чисел или более достоверное число.

Для аэрации культуры микроорганизмов помимо перемешивания можно применять продувание стерильного воздуха через толщу среды. Этот способ час­то используют в лабораторных исследованиях, но особенно широкое приме­нение он нашел в промышленной микробиологии при получении биомассы и различных продуктов жизнедеятельности микроорганизмов — антибиотиков, ферментов, кислот. Скорость потока воздуха через среду необходимо контро­лировать. Для этого используют различные при­боры — газовые часы, ратометры и др. В фермен­терах количество пропускаемого воздуха поддер­живают на заданном уровне автоматически. Воз­дух стерилизуют путем прохождения через акти­вированный древесный уголь, стеклянную вату, пропитанную антисептиком, или специальные ткани из полимеров. В лабораторных опытах, когда объем и скорость поступления воздуха невели­ки, используют заранее простерилизованные ват­ные фильтры. Для возможно более сильного рас­пыления воздух пропускают через мелкопорис­тые пластинки — барботеры; в лабораторных опытах с этой целью применяют стеклянные фильтры. Для аэрации культур микроорганизмов, как правило, используют обычный воздух.

Продувание сред кислородом в лабораторных условиях не рекомендуется, так как чрезмерное насыщение среды кислородом (до 40 мг/л) мо­жет привести к угнетению роста микроорганиз­мов. В ферментерах принудительную аэрацию обычно совмещают с механическим перемешиванием среды мешалками, скорость вращения которых может достигать сотен и даже тысяч оборотов в минуту Схема ферментера для глубинного культивирования аэробных микроорганизмов приведена на рис. 1.

Рис. 1. Схема ферментера дляглубинного культивирования аэробных микроорганизмов:

1 — вход воздуха;

2 — выход воздуха;

3 — барботер;

4 — отбойники;

5 — мешалка

Культивирование анаэробных микроорганизмов.

Оно более сложно, чем культивирование аэробов, так как соприкосновение клеток анаэробов с кислородом воздуха должно быть сведено к минимуму или даже полностью исключено. Для этого используют разные приемы, нередко комбинируя их друг с другом.

Выращивание в высоком слое среды — наиболее простой способ ограниче­ния воздуха к клеткам микроорганизмов. Жидкую среду наливают в сосуды для культивирования высоким слоем. Поскольку нельзя стерилизовать среды, если они занимают более половины высоты сосуда, часть среды стерилизуют от­дельно и стерильно доливают ею сосуд для культивирования сразу после посе­ва. Непосредственно перед посевом среду кипятят или прогревают на кипящей водяной бане 30 — 40 мин, затем быстро охлаждают, чтобы в ней не успел раствориться кислород воздуха, и вносят на дно посевной материал.

Иногда используют метод культивирования в вязких средах. Диффузия кис­лорода в жидкость уменьшается с увеличением ее вязкости, поэтому в вязких средах, таких, как картофельная или среды с кукурузной либо другой мукой, хорошо развиваются некоторые облигатные анаэробы, например возбудители маслянокислого или ацетонобутилового брожения. Вязкость сред легко увели­чить добавлением к ним 0,2 —0,3 % агара.

Для получения изолированных колоний при выделении чистых культур или определении их численности анаэробные микроорганизмы выращивают в толще питательной среды. Для этого посевной материал вносят в расплавленную и остуженную до 48 — 50°С агаризованную, желательно осветленную среду, тща­тельно перемешивают и оставляют в пробирках или переливают стерильной пипеткой в заранее простерилизованные трубки Бурри или чашки Петри. По­верхность среды в пробирках заливают парафином. Трубки Бурри — это стек­лянные трубки длиной 20 — 25 см, диаметром 1,0—1,5 см. Трубки стерилизуют, закрыв оба конца ватными пробками. Перед посевом ватную пробку у одного конца заменяют стерильной резиновой, через другой конец трубки вносят среду с посевным материалом и закрывают также резиновой пробкой (рис. 3.2). При использовании чашек Петри для выращивания анаэробов засеянную агаризо­ванную среду наливают в крышку чашки и, после того как среда застынет, плотно прижимают к ее поверхности дно чашки. Зазор между стенками дна и крышки, где среда соприкасается с воздухом, заливают стерильным парафи­ном (рис. 3.3).

Анаэробные микроорганизмы можно выращивать в анаэростатах — вакуумных металлических камерах, снабженных манометром. Анаэростатом может служить обычный вакуумный стеклянный эксикатор. Из анаэростата откачивают воздух, а затем, как правило, заполняют его газовой смесью, состоящей из азота (90 — 80%) и углекислоты (10 — 20%), до давления порядка 67∙10³ Па (0,7 ати). Избыточное давление исключает возможность диффузии кислорода воздуха.

Принципы культивирования строгих анаэробов.

Они разработаны профессором Р.Хангейтом (США), и состоят в следующем: 1) все процедуры — приготовление и разлив сред, посевы, культивирование микроорганизмов и т.д., проводят с максимальной защищенностью от контакта с кислородом (анаэробный бокс, кипячение, работа в токе стерильного газа, использование герметически закрытых сосудов и т.д.); 2) до посева микроорганизмов в среды добавляют восстановители (цистеин, сульфид натрия, тиогликолат в щелочной среде) для химического поглощения следов кисло­рода, диффундирующего в сосуды для культивирования даже через резиновые пробки; 3) все пересевы и добавки в среды проводят с помощью шприцев, проду­тых газом, не содержащим кислород; 4) все трубки и шланги, используемые для пропускания газа, должны быть изготовлены из материала, не допускающего (медь) или допускающего в слабой степени диффузию сквозь него кислорода воздуха (бутилированная резина).

В качестве поглотителя кислорода из газов в лабораторной практике используют щелочные растворы пирогаллола или дитионита натрия, металлическое железо, медь, нагретую до 400°С, или некоторые другие реактивы. При этом необходимо учитывать поглощающую способность реактивов и объем замкнутого пространства, в котором выращивают микроорганизм. Например, на каждые 100 мл емкости используют 1 г пирогаллола и 10 мл 2,5 н. раствора гидроксида натрия. Поскольку многие анаэробы нуждаются в углекислоте, пирогаллол часто растворяют не в щелочи, а в насыщенном растворе бикарбоната натрия. Полноту поглощения кислорода контролируют раство­ром, содержащим окислительно-восстановительный индикатор. Для приготовления раст­вора смешивают равные объемы 0,024%-го NaОН, 0,015%-го водного метиленового синего и 6%-й глюкозы; в качестве антисептика к раствору добавляют тимол. Перед использованием в пробирку наливают 5 мл смеси и нагревают на кипящей водяной бане до обесцвечивания, быстро охлаждают и помещают в анаэростат или анаэробный бокс. В анаэробных условиях раствор остается бесцветным.

Для удаления следов кислорода из промышленных газов, которые поставляют в баллонах, содержащих до 1,5% воздуха, используют следующую процедуру: газ про­пускают через стеклянную трубку, заполненную медными стружками и нагретую до 400°С с помощью электронагревателя (для этой цели подойдет спираль от бытовой электроплитки с керамическими изоляторами). Обработанный таким образом газ практически не содержит кислорода, так как медь при высокой температуре эффективно связывает кислород с образованием СuО. Для регенерации меди используют газооб­разный водород: СuО + Н₂ = Сu + Н₂О. Такой газ необходим при заполнении переход­ного шлюза в анаэробном боксе.

В качестве восстановителя чаще всего используют сульфид и тиогликолат натрия. Обычно готовят 1%-е растворы этих восстановителей в 5%-м растворе бикарбоната натрия, стерилизуют автоклавированием и добавляют к средам сульфид натрия из рас­чета 250 — 500 мг/л, а тиогликолат — до 250 мг/л среды. Восстановители используют в концентрациях, не влияющих на рост микроорганизмов.

Работа со строгими анаэробами представляет большие трудности и требует специ­ального оборудования.