Приведенные на рис. 72 спектральные характеристики достаточно хорошо согласуются с полученными разнообразными методами сведениями относительно соотношения белков, ДНК и РНК в гигантских нейронах моллюсков. Однако необходимо отметить, что комплект использованных в этом методе красителей (печатающий зеленый В и акридиновый оранжевый), по-видимому, не является иаилучшим и описание метода приведено здесь скорее для иллюстрации возможностей, связанных с новым аспектом применения хорошо известных люминесцентных красителей.
Поиск люминесцирующих в голубой области спектра меток на белки следует, вероятно, в первую очередь производить среди так называемых оптических отбеливателей. Эти новые в бытовой химии вещества [279] выполняют свое назначение благодаря способности к интенсивной люминесценции в голубой области спектра. Вместе с тем к ним предъявляются требования высокой стабильности и способности прочно связываться с тканями, в том числе шелковыми и шерстяными.
3.3. Анализ спектральных характеристик
Обсуждение задач, для решения которых двух- и трехволновые методы регистрации являются наиболее удобными, можно было бы продолжить, включив такие вопросы, как, например, определение соотношения живых и мертвых клеток, грампопожительных и грамотрицательных микроорганизмов, специфичность и неспецифичность связывания антител, меченных разными по цвету люминесценции соединениями и т.д.
Существует, тем не менее, один методический вопрос, который, хотя бы кратко, должен быть рассмотрен здесь. Речь идет об определении соотношения интенсивностей полос люминесценции отдельных красителей в суммарном спектре люминесценции препарата. С возникающими при этом затруднениями мы сталкивались и в предыдущей главе (см. рис. 31). Их можно проиллюстрировать рис.73, где приведены спектры люминесценции двух красителей и суммарный спектр их смеси. Если, например, определять отношение интенсивности люминесценции в 530 нм (максимум кривой 2) к таковой в длине волны 450 нм (максимум кривой 1), измеряя амплитуды в соответствующих (530 и 450 нм) длинах волн регистрируемого суммарного спектра (рис. 73, 3), будет получена ошибочная величина этого отношения, равная 2,1. В то же время истинная величина этого отношения, определяемая по амплитудам парциальных спектров люминесценции красителей (рис. 73, 1, 2), равна
1,5.
Рис. 73. Суммарный (3) спектр люминесценции смеси двух красителей (1, 2).
Причиной такой ошибки является то, что суммарный спектр образуется сложением парциальных спектров. При этом обычно спектры люминесценции красителей представляют собой относительно широкие полосы асимметричной формы с достаточно резким подъемом в коротковолновой (относительно максимума) области и медленным плавным спадом в длинноволновой области спектра. При аддитивном сложении таких парциальных спектров это обстоятельство приводит к тому, что длинноволновый спад полосы излучения красителя, максимум которого расположен в более коротковолновой (по сравнению со вторым красителем) области, «приподнимает» полосу излучения красителя с более длинноволновым максимумом, как это видно на примере влияния полосы красителя (1) на амплитуду полосы красителя (2) в их суммарном спектре
(3). В то же время благодаря резкому спаду коротковолновой части полосы излучения красителя (2) ее присутствие в суммарном спектре мало влияет на амплитуду люминесценции красителя (1) с
максимумом в более коротковолновой области спектра.
В ряде случаев, когда максимумы люминесценции отстоят достаточно далеко один от другого (например, 3,4-бензпирен и этидиум бромид, рис. 66), или в случае красителей с линейчатым спектром взаимным влиянием полос люминесценции красителей можно пренебречь. Однако в большинстве случаев этот эффект необходимо учитывать. Простейший способ учета вклада соседних полос люминесценции в интенсивность излучения в максимуме одного из красителей в суммарном спектре был описан ранее (рис. 31) и состоит в предварительном нормировании спектра люминесценции красителя (1). Тогда, измерив его амплитуду в максимуме, можно всегда определить и интенсивность люминесценции этого красителя в длине волны, совпадающей с максимумом люминесценции красителя (2). Вычитая определенный таким образом вклад красителя (1) из общей интенсивности люминесценции в максимуме красителя (2), получают истинную интенсивность люминесценции красителя, используемую затем для вычисления безразмерного параметра (ξ, α, β и т.д.), характеризующего соотношение тех или иных веществ в клетке.
При большом объеме данных перспективным является применение вычислительной техники для автоматизации этой процедуры. Информация может вводиться в УЦВМ в виде магнитной записи [280], перфоленты [281] или непосредственно в графической форме с бланка самописца. В память машины вводятся также парциальные спектры люминесценции красителей. По соответствующим алгоритмам УЦВМ производит разбиение суммарных спектров люминесценции препарата на парциальные спектры соединений, использованных для его окраски.
Например, с помощью спектрочитающего устройства в УЦВМ «Раздан-2» были введены с бланка самописца парциальные спектры люминесценции, моделирующие характеристики мышечной клетки (рис. 30; рис. 74, 1, 2). По требованию оператора в соответствии с алгоритмом УЦВМ произвела сложение этих спектров (рис. 74, 3), а затем из суммарного спектра вычла один из составляющих компонентов (рис. 74, 1) и в результате получила, как это и должно быть, кривую 4 (рис. 74), практически совпадающую по форме и амплитуде с исходным спектром (рис. 74, 2).
Рис. 74. Сложение (3) и вычитание (4) двух спектров (1, 2) с помощью УЦВМ.
Трудоемкость анализа при использовании ЦВМ может быть значительно снижена, если помимо записи спектров в графической форме на самописце будет параллельно производиться запись той же информации в цифровой форме на магнитный носитель или на перфоленту [281].
Другой подход к решению этой задачи заключается в использовании специализированных аналоговых вычислительных машин, позволяющих синтезировать суммарный спектр из отдельных полос, меняя их форму, амплитуду и положение в спектральном диапазоне. Примером реализации такого подхода может служить разработанный в Институте белка АН СССР и выпускаемый СКБ БП АН СССР прибор СК-2 [282].
Подбирая амплитуду и форму составляющих суммарный спектр полос излучения (до 7 отдельных полос) с максимумами, расположенными в известных длинах волны, исследователь может синтезировать суммарный спектр, совпадающий с полученным в эксперименте, и таким образом определить парциальные составляющие анализируемого спектра (рис. 75). Преимуществом такого способа является то, что в этом случае отпадает необходимость в трудоемкой операции перекодировки исходных данных из аналоговой формы в цифровую и обратно. Имея в виду возможность использования этого прибора не только для полуавтоматического анализа оптических спектров, но и для обработки спектров ЯМР, ЭПР, хроматографических кривых и т. д., можно предполагать, что такого типа системы обработки данных будут иметь широкое распространение.
Рис. 75. Синтез суммарных спектров на приборе СК-2. Обратить внимание на смещение левого максимума люминесценции в суммарном спектре в случае достаточно широкой (а) полосы компонента. При сужении (б) полосы левого компонента сдвиг в суммарном спектре не наблюдается.
Более прямой метод устранения взаимного влияния полос излучения и поглощения красителей состоит в раздельном возбуждении люминесценции каждого из них излучением с заранее выбранной длиной волны. Интенсивности люминесценции красителей при этом измеряются также раздельно в области максимумов излучения, что требует коренного изменения техники возбуждения и регистрации люминесценции. Такой подход был использован Чансом и соавт. [283] при раздельном измерении люминесценции восстановленных пиридиннуклеотидов и окисленных флавопротеинов перфузируемых тканей (печень и сердце), а также И.Я.Барским и Г.В.Папаяном в микрофлуориметре, описанном ниже [284].
Большие перспективы открываются также с разработкой систем, позволяющих регистрировать спектры люминесценции образцов через малые и изменяемые промежутки времени (10-9 с) после прекращения возбуждения. В этом случае появляется возможность разделить спектры соединений с разным временем жизни возбужденного состояния.
Глава 4. Люминесцентные красители.2. Исследование динамики функциональной организации клеточных структур
В данной главе приводится ряд примеров использования красителей, квантовый выход которых сильно меняется при связывании их с различными компонентами клеточных структур и зависит от окружения, для изучения молекулярной организации функциональных механизмов клетки. Выбор примеров достаточно произволен, и основная задача их - проиллюстрировать как возможности, так и трудности применения люминесцентных меток для изучения живой клетки и ее органоидов.
4.1.Взаимодействие контрактильных белков в процессе мышечного сокращения
Одной из возможных причин возникновения сил, позволяющих мышце совершать механическую работу за счет использования потенциальной энергии химических связей АТФ, является взаимодействие полярных групп сократительных белков. Поэтому исследование топографии разноименно заряженных полярных групп белков в структуре элементарной ячейки сократительного аппарата мышцы (саркомера) и ее изменения в процессе сокращения - один из важнейших аспектов изучения механизма мышечной деятельности. Использование люминесцентных красителей-меток и техники спектрального анализа клеток открывает новые возможности в этом направлении.
Для исследования использовались живые и глицеринизированные мышечные волокна psoas кролика, портняжной мышцы лягушки и запирательного мускула Balanus [54, 285]. Приготовление глицеринизированных волокон производилось по общепринятой методике [286, 287].
Локализацию красителей в структуре саркомера определяли, фотографируя препараты на люминесцентном микроскопе. Распределение оптических плотностей на негативах измеряли на
модифицированном микрофотометре МФ-4. Спектры люминесценции регистрировали с помощью универсального микроспектрофлуориметра, снабженного приставкой для регистрации изменения интенсивности люминесценции в двух избранных интервалах (10-12 нм) видимой области спектра [105]. Люминесценцию объекта возбуждали линией излучения дуговой ртутной лампы ДРШ-250 с длиной волны 365 нм, выделяемой светофильтром УФС-6. Размер фотометрируемого участка составлял 5×15 мкм. Применение многоканального самописца позволяло параллельно с изменением интенсивности люминесценции в двух длинах волн регистрировать натяжение мышечного волокна, используя для этой цели пьезокерамические датчики или тензодатчики.
Ввиду того, что многие органические красители, в особенности анионные, помимо электростатического взаимодействия способны к гидрофобному взаимодействию с макромолекулами белков [288], в первую очередь была изучена гидрофобная структура саркомера. С этой целью применялась аммонийная соль 8-анилино-1-нафталеносульфоната (АНС), обладающего способностью избирательно связываться с гидрофобными участками белковых молекул. Свойство этого красителя резко (в 20-100 раз) увеличивать интенсивность люминесценции при адсорбции на гидрофобную область белковых молекул позволило использовать его для обнаружения локальных деформаций мышечных белков [51, 52], для определения локализации гидрофобных участков в саркомере [53] и для оптической регистрации изменения структуры мембраны при возбуждении нервного волокна.
АНС 8-анилино-1-нафталеносульфонат
С16Н15N2SО3
Спектр поглощения этого анионного красителя приведен на рис. 76. Интенсивность люминесценции АНС с максимумом 548 нм весьма незначительна в растворе и резко увеличивается при связывании его с волокном. При этом происходит смещение максимума люминесценции в область 490 нм. Добавление раствора АТФ к препарату окрашенного волокна вызывает его изотоническое сокращение и увеличение интенсивности люминесценции.
Рис. 76. Спектры поглощения растворов красителей (фосфатный буфер, рН=6,8). а – АНС
(1) и аурамин 00 (2) в концентрации 10-5 г/мл; б – тиазоловый желтый в концентрации
2,5 10-5 г/мл.
Это изменение интенсивности люминесценции могло быть обусловлено следующими факторами:
1.Увеличением количества окрашенного субстрата в поле зрения микроскопа при сокращении мышечного волокна.
2.Увеличением количества возбуждающего люминесценцию излучения, поглощенного волокном, за счет увеличения светорассеяния при сокращении [289].
3.Увеличением квантового выхода красителя.
4.Увеличением количества групп, специфически связывающих краситель.
Возможно также, что все эти факторы вносят свой вклад в наблюдаемое увеличение интенсивности люминесценции красителя. Локализация АНС в А- и Z-полосах саркомера совпадает с описанной ранее [53].
С целью изучения распределения электроотрицательных полярных групп белков в структуре саркомера был использован катионный краситель аурамин ОО, ценным качеством которого является полное отсутствие его люминесценции в растворе. Электростатическое взаимодействие аурамина ОО с отрицательно заряженными полярными группами субстрата позволяет молекулам этого красителя приобрести необходимую жесткость структуры и сопровождается появлением интенсивной люминесценции их с максимумом 520 нм.
АУРАМИН ОО Тетраметилдиамино-дифенилкетоими- ногидрохлорид
С17Н22N3Cl м. в. 303,84
При окрашивании глицеринизированных миофибрилл аурамин ОО локализуется так же, как и АНС, в области А- и Z-полос саркомера. Изотоническое сокращение окрашенного аурамином ОО глицеринизированного волокна под действием АТФ приводит к увеличению интенсивности люминесценции красителя на 60-70%.
Ввиду того, что роль гидрофобных взаимодействий при связывании катионных красителей с белками мала [288], можно предполагать, что в данном случае аурамин ОО выявляет локализацию электроотрицательных групп белков в структуре саркомера. Аналогичным образом взаимодействует с мышечными белками и другой катионный краситель - акридиновый оранжевый [206, 290], основным недостатком которого является значительная люминесценция его в растворе.
Для определения локализации электроположительных групп белков в структуре саркомера был использован анионный краситель - тиазоловый желтый. Ценной особенностью, определившей использование этого красителя, является относительно слабая люминесценция его с максимумом 420 нм в растворе. Интенсивность люминесценции тиазолового желтого резко возрастает при связывании его субстратом. При этом происходит смещение максимума в область 450 нм.
ТИАЗОЛОВЫЙ ЖЕЛТЫЙ (Титановый желтый)
С28Н19N5О6S4Na2
м. в. 695,75
При окрашивании тиазоловым желтым глицеринизированных миофибрилл оказалось, что он локализуется так же, как АНС и аурамин ОО, в области А- и Z-полос саркомера. Однако в отличие от этих красителей, интенсивность люминесценции глицеринизированного волокна, окрашенного тиазоловым жёлтым, незначительно уменьшается при изотоническом сокращении волокна под действием АТФ. Поэтому можно предполагать, что связывание тиазолового желтого с мышечными белками в отличие от АНС не является гидрофобным.
В то же время, если наблюдаемое увеличение интенсивности люминесценции АНС и аурамина ОО при сокращении мышечного волокна под действием АТФ может быть объяснено влиянием чисто физических и аппаратурных факторов, таких, как увеличение количества окрашенного субстрата в поле зрения микроспектрофлуориметра или увеличение оптической плотности волокна при сокращении, то уменьшение интенсивности люминесценции тиазолового желтого может быть объяснено только взаимодействием его с исследуемым субстратом.
Для выявления локализации полярных групп в структуре саркомера было изучено взаимодействие более чем 100 различных люминесцентных меток с белками глицеринизированных миофибрилл. Установлено, что положительно и отрицательно заряженные полярные группы белков имеются только в области А- и Z-полос. Там же локализуются и метки гидрофобных участков белковых молекул.
Ни одним из использованных красителей не удается окрасить I-полосу саркомера. Это означает, что в актиновых нитях не имеется свободных полярных или гидрофобных групп. Судя по распределению интенсивности люминесценции в А-полосе (различие между Н-зоной и областью перекрытия актиновых и миозиновых нитей), приближение миозиновых нитей «активирует» появление заряженных групп в актиновых нитях в области перекрытия. Возможно, что именно этот механизм лежит в основе возникновения положительной обратной связи, обеспечивающей генерацию силы или перемещение при сокращении.
Исследование изменения полярной структуры саркомера в процессе его сокращения представляет достаточно сложную в методическом отношении задачу. Внимательный анализ накопленного опыта показывает, что известные методы использования красителей-меток неприменимы для изучения процессов, протекающих при сокращении мышечного волокна, ввиду резкого изменения оптических и геометрических параметров самого объекта. В этом случае
изменение интенсивности люминесценции красителя, связанного с волокном, зависит от многих, в том числе и от аппаратурных факторов.
С целью обойти трудности, возникающие в связи со спецификой объекта, были разработаны новые методические подходы, основанные, в частности, на одновременном применении двух люминесцентных меток. Измеряемым параметром при этом служит не изменение абсолютной интенсивности люминесценции метки, а изменение соотношения интенсивностей люминесценции двух меток, взаимодействующих с определенными группами белков и между собой. Этот параметр уже в значительной мере не зависит от аппаратурных факторов и отражает в основном перестройки макро-молекулярной структуры сократительного аппарата. Такой подход оказался хотя и трудоемким (особенно этап подбора соответствующих меток, когда из 100-120 предварительно изученных соединений удается отобрать 2-3 пригодных для дальнейшей работы), но в достаточной мере перспективным. В частности, таким образом была выявлена донорно-акцепторная пара - тиазоловый желтый и аурамин ОО.
Оба этих красителя локализуются в одних и тех же участках саркомера - в области А- и Z- полос. При последовательной окраске вначале аурамином отрицательно, а затем тиазоловым желтым положительно заряженных групп белков глицеринизированного мышечного волокна спектр люминесценции его состоит из двух полос излучения (рис. 77, 1) примерно равной интенсивности с максимумами 450 нм (тиазоловый желтый) и 520 нм (аурамин ОО).
Добавление АТФ в концентрации 10-2 М к окрашенному таким образом глицеринизированному волокну приводило к изотоническому сокращению его, сопровождающемуся уменьшением интенсивности полосы излучения тиазолового желтого и увеличением интенсивности полосы излучения аурамина ОО (рис. 77, 2).
Рис. 77. Взаимодействие люминесценции меток при сокращении мышцы. а – спектры люминесценции глицеринового мышечного волокна, окрашенного последовательно аурамином 00 и тиазоловым желтым, до 91) и после (2) сокращения волокна под действием АТФ; б – схема возможного распределения полярных групп и люминесцентных меток в А-диске саркомера. Длина волны возбуждения 365 нм.
Дополнительные исследования [285] показали, что в основе наблюдаемого эффекта лежит миграция энергии возбуждения от молекул тиазолового желтого к молекулам аурамина ОО благодаря почти полному перекрытию полосы излучения тиазолового желтого с полосой поглощения аурамина ОО. При этом степень миграции энергии зависит от расстояния между молекулой-донором (тиазоловый желтый) и молекулой-акцептором (аурамин ОО) так, что гашение люминесценции тиазолового желтого на 10% наблюдается при расстоянии между метками около 250 Å. Сближение этих молекул до 170-180 Å увеличивает степень гашения люминесценции тиазолового желтого до
70% (рис. 78).
Таким образом, данные о локализации тиазолового желтого и аурамина ОО (А- и Z-полосы) и зависимости степени гашения люминесценции тиазолового желтого аурамином ОО от расстояния между ними позволяют интерпретировать приведенный на рис. 77 эффект. По-видимому, в сократительных белках актомиозиновой области саркомера имеются чередующиеся положительно и отрицательно заряженные полярные группы, с которыми связываются тиазоловый желтый (—) и аурамин ОО (+) соответственно. Сокращение окрашенного таким образом глицеринизированного волокна приводит к сближению разноименных полярных групп сократительных белков и связанных с ними красителей, что сопровождается гашением люминесценции тиазолового желтого приблизившимся к нему аурамином ОО. Разноименно заряженные группы сократительных белков актомиозиновой части несокращенного саркомера расположены на расстоянии более 250 Å. В
противном случае часть люминесценции тиазолового желтого была бы уже погашена и не наблюдалось бы столь сильного тушения его люминесценции (до 72%), как это показано на рис. 77. При сокращении волокна эти группы сближаются до расстояния около 150 Å, и степень гашения люминесценции тиазолового желтого составляет 70-80% (рис. 77, 78). Сближение этих красителей до меньшего расстояния приводило бы к практически полному гашению люминесценции, однако, при полном сокращении волокна всегда остается заметной полоса излучения тиазолового желтого, интенсивность которой составляет около 15-20% от исходной.
Рис. 78. Зависимость интенсивности люминесценции раствора (10-4 М) тиазолового желтого о концентрации аурамина 00 в этом же растворе.
Приведенные оценки расстояний между разноименно заряженными группами белков являются ориентировочными и требуют уточнения, так как, например, сохранение люминесценции тиазолового желтого при полном сокращении волокна может происходить и за счет связанного в области Z-полосы красителя, возможно не меняющего свою излучательную способность при сокращении. В заключение необходимо отметить, что применение метода двойной окраски к исследованию живого мышечного волокна наталкивается на определенные трудности, связанные с многокомпонентностью этой системы. Закономерности изменения спектров люминесценции здесь более сложные. Естественно, для интерпретации изменения спектра люминесценции окрашенного аурамином и тиазоловым желтым глицеринизированного волокна необходимо попытаться точнее установить природу мест связывания этих меток на волокне. Такая попытка может быть сделана с использованием модельных объектов.
В качестве модели были выбраны интактные митохондрии [291], позволяющие изменять количество отрицательно заряженных групп на их поверхности. Известно, что сдвиг соотношения окисленных и восстановленных форм компонентов дыхательной цепи интактных митохондрий сопровождается изменением количества полярных групп на внешней митохондриальной мембране
[55, 56, 292].
Изменение окислительно-восстановительного состояния может быть вызвано действием соответствующих ингибиторов, субстратов или разобщителей окислительного фосфорилирования и проконтролировано по интенсивности люминесценции НАД Н (460-470 нм) и окисленных флавопротеинов (520 - 530 нм).
Выделенные митохондрии печени крысы характеризуются спектром люминесценции (рис. 79, 1) с широкой вершиной, состоящей из максимумов излучения НАД Н (460-470 нм) и окисленных флавопротеинов (520-530 нм). При добавлении к суспензии субстрата окисления - янтарной кислоты - наблюдается увеличение интенсивности люминесценции НАД Н и характерные изменения люминесценции НАД Н в ответ на добавки Са2+, что позволяет оценить функциональное состояние митохондрии в суспензии.
Спектры люминесценции регистрировали на микроспектрофлуориметре. Для возбуждения люминесценции использовали линию излучения дуговой ртутной лампы ДРШ-250, выделяемую светофильтром УФС-6. При изучении кинетики интенсивности люминесценции применяли спектральное двухканальное устройство, позволяющее непрерывно регистрировать на многоканальном самописце изменение интенсивности люминесценции в полосах шириной 7-10 нм в заранее выбранных (460 и 540 нм) участках спектра (рис. 79).
Изменение спектра люминесценции митохондрии при окрашивании их аурамином ОО в концентрации 10-5 М (рис. 79, 2) свидетельствует о том, что взаимодействие аурамина с митохондриальной мембраной приводит к окислению дыхательной цепи митохондрии (на это указывает снижение интенсивности люминесценции НАД Н). Увеличение интенсивности люминесценции в области 520-530 нм происходит, по-видимому, как за счет связывания аурамина,
так и за счет увеличения концентрации окисленных флавопротеинов, максимум люминесценции которых, к сожалению, совпадает с максимумом люминесценции красителя. При повышении концентрации аурамина наблюдается дальнейший рост интенсивности люминесценции в области 520-530 нм в основном за счет связывания красителя с мембраной митохондрий (рис. 79, 3, 4). Наиболее отчетливо это прослеживается при титровании, результаты которого приведены на рис. 80. Аурамин ОО оказывает разобщающее действие на окислительное фосфорилирование даже в малых концентрациях, о чем свидетельствует окисление НАД Н, регистрируемое по снижению его люминесценции (рис. 80, 1а, б).
Рис. 79. Изменение спектра люминесценции суспензии митохондрий при окраске их аурамином 00. Концентрация аурамина 00: 1 – 0; 2 – 10-5 М; 3 - 2 10-5 М; 4 – 10-4 М. Длина волны возбуждения 365 нм. Штриховкой показаны спектральные участки регистрации кинетики (см. рис. 80).
Рис. 80. Изменение интенсивности люминесценции НАД Н (1) и аурамина 00(2) в суспензии митохондрий в разных (а, б) функциональных состояниях при увеличении концентрации красителя.
При ухудшении функционального состояния митохондрий (б) наблюдается сдвиг кривых в сторону меньших концентраций аурамина при сохранении их формы. По оси ординат – интенсивность люминесценции в отн. ед. По оси абсцисс – концентрация аурамина 00 в молях.
Монотонное изменение интенсивности люминесценции аурамина и НАД Н происходит при увеличении концентрации красителя до 5.10-4 М. Дальнейшее увеличение концентрации аурамина приводит к значительному спаду интенсивности его люминесценции (рис. 80, 2а). Концентрация 5 10-4 М соответствует, по-видимому, насыщению аурамином отрицательно заряженных центров связывания красителя на мембране митохондрий. Блокирование аурамином этих центров приводит к резкому окислению НАД Н (рис. 80, 1а), сопровождающемуся, вероятно, уменьшением количества отрицательно заряженных групп на внешней митохондриальной мембране.
На основании этих экспериментальных данных можно полагать, что в состав отрицательно заряженных групп митохондриальной мембраны, с которыми связывается аурамин, входят специфические места связывания Са2+. На обоснованность такого предположения указывает наличие конкуренции между аурамином и Са2+ за места связывания. Добавки Са2+ к суспензии митохондрий, окрашенных аурамином, приводят к ступенчатому спаду интенсивности люминесценции аурамина, величина которого постепенно уменьшается (рис. 81, а, 1). Параллельно этому наблюдаются слабые изменения люминесценции НАД Н, регистрируемые в области 460 нм (рис. 81, а, 2).
Возможно, что отмеченное на рис. 80 снижение интенсивности люминесценции аурамина при увеличении его концентрации более 5 10-4 М также обусловлено вытеснением молекул красителя с групп связывания кальцием, концентрация которого в среде растет за счет выхода его из внутреннего объема митохондрий при окислении дыхательной цепи, сопровождаемом уменьшением интенсивности люминесценции НАД Н.
Рис. 81. Изменение интенсивности люминесценции митохондрий, окрашенных аурамином 00 в концентрации, выше насыщающей, при
последовательных добавках. а – янтарной кислоты
и Са2+, Mg2+ и La2+.
Положение точки перегиба на кривой титрования (рис. 80) зависит от функционального состояния используемых в опыте митохондрий. При ухудшении этого состояния, регистрируемом по изменению люминесцентного ответа НАД Н на добавки Са2+ (рис. 80, а, б) и повышению общей окисленности дыхательной цепи, точка перегиба смещается в область концентрации аурамина 4 10-5 М при сохранении формы кривых (рис. 80, 1б, 2б).
На возможность взаимодействия аурамина с местами связывания Са2+ указывает и то, что он оказывает на митохондриальную мембрану такое же действие, как и лантан - известный ингибитор энергозависимого накопления Са2+ в митохондриях [293]. Добавление к суспензии митохондрий La3+ в концентрации, превышающей количество мест связывания аурамина, приводит к характерному изменению ответов люминесценции НАД Н на добавление Са2+ (рис. 82, 2). В этом случае наблюдается ступенчатое снижение интенсивности люминесценции, так же как и при добавлении Са2+ к суспензии митохондрий, окрашенных аурамином в концентрации, выше насыщающей (рис. 81, а). Добавление Са2+, Мg2+- и Lа3+ к суспензии митохондрий, окрашенных аурамином, приводит к однотипному ступенчатому снижению интенсивности люминесценции красителя (рис. 81, б). Повидимому, эти катионы конкурируют с красителем за места связывания на митохондриальной мембране и вытесняют его в раствор, где аурамин теряет способность люминесцировать.
Рис. 82. Изменение интенсивности люминесценции НАД Н митохондрий в ответ на добавки янтарной кислоты и Са 2+. 1 –
интактные миохондрии; 2 – митохондрии, обработанные 50 мМ La3+.
4.2.Изучение динамики кальция при функционировании клеток
Важнейшая роль ионов Са2+ в регуляции различных функциональных механизмов клетки в настоящее время широко известна [294, 295], и потому интерес к методам определения его в клетках постоянно возрастает.
Одним из наиболее старых применяемых в гистологии методов обнаружения кальция является метод, основанный на образовании ярко окрашенных лаков его при взаимодействии с гематоксилином или с ализариновыми красителями [32]. Широко распространен метод с ализариновым красным S (рис. 83), который образует с кальцием нерастворимый лак краснооранжевого цвета. Локализация лака наблюдается при микроскопировании препарата в проходящем свете. Специфичность этого метода невысока, так как и другие ионы металлов (алюминий, хром, барий, стронций, железо, бериллий, кадмий, лантан, свинец и т.д.) могут образовывать с ализариновым красным лаки, окраска которых меняется от ярко-алого для алюминия до пурпурночерного для железа [296].
Рис. 83. Спектр поглощения ализаринового красного S.
По-видимому, более высокой специфичностью обладает люминесцентный вариант метода обнаружения кальция с ализариновым красным [297-300]. Однако последовательность протекающих при этом реакций образования продуктов с различными свойствами, в том числе и с оптическими, достаточно сложна, и ее, по-видимому, полезно рассмотреть подробнее с целью получить основу для интерпретации наблюдаемой окраски препаратов. При этом необходимо сразу отметить два обстоятельства. Первое из них заключается в том, что сами по себе сухие лаки ализаринового красного S с двухвалентными ионами люминесценцией не обладают. По-видимому, образование лака - конгломератов и длинных цепочек из молекул красителя, соединенных двухвалентными ионами, - приводит как к сдвигу спектра люминесценции в инфракрасную область, так и к резкому повышению вероятности безызлучательной диссипации поглощенной красителем энергии возбуждающего люминесценцию излучения.
Второе обстоятельство, которое, по-видимому, необходимо учитывать, заключается в том, что сам ализариновый красный является типичным анионным красителем, способным к электростатическому взаимодействию с положительно заряженными группами различных компонентов биологического объекта, помимо его способности к специфическому взаимодействию с ионами металлов.
АЛИЗАРИНОВЫЙ КРАСНЫЙ S
С14Н7 О7SN2 Н2О
м. в. 360,28
Действительно, кристаллы ализаринового красного S обладают люминесценцией с максимумом излучения в красной (670-680 нм) области спектра (рис. 84, 1). Растворение кристаллов в дистиллированной воде приводит к некоторому расширению этой полосы люминесценции и появлению дополнительного плеча с максимумом в районе 520 нм (рис. 84, 2). Это плечо, повидимому, обязано своим происхождением комплексам, в которых одна молекула ализаринового красного соединена с одним ионом Са2+. На обоснованность такого предположения указывает то, что при добавлении к раствору красителя раствора СаСl2 наблюдается выпадение хлопьевидного осадка с максимумом люминесценции в области 520 нм (рис. 84, 3).
Образовавшийся комплекс оказывается неустойчивым и сразу же после образования спектр люминесценции его изменяется так, что интенсивность максимума излучения в зеленой области (520 нм) начинает падать одновременно с появлением и ростом полосы люминесценции в красной области спектра (685 нм). В течение нескольких минут этот новый максимум становится основным (рис. 84, 4) в спектре люминесценции осадка.
Причиной наблюдаемого изменения спектра люминесценции осадка является, по-видимому, образование таких комплексов, в которых один ион Са2+ связывает две молекулы ализаринового красного S. Происходящее при этом объединение π-орбит двух молекул красителя и приводит, вероятно, к смещению полосы люминесценции из зеленой в красную область спектра. Полезно отметить здесь, что спектр люминесценции такого двойного комплекса ализаринового красного S c Са2+ (рис. 84, 4) сильно отличается по форме от спектра люминесценции свободных молекул красителя в растворе (рис. 84, 2) или в кристаллах (рис. 84, 1).
Рис. 84. Спектры люминесценции ализаринового красного S. 1 – кристаллы красителя; 2 – насыщенный раствор; 3 – осадок выпадающий после добавления CaCl2 к насыщенному раствору; 4 – влажный осадок, остающийся после испарения воды из осадка, выпавшего после добавления CaCl2; 5 – 9 – изменение интенсивности люминесценции влажного осадка при постепенном испарении из него остатков воды. Длина волны возбуждения 436 нм. Осадок, обладающий спектрами люминесценции 3 – 9, в проходящем свете имеет красный цвет.
В дальнейшем по мере высыхания осадка и испарения из него воды наблюдается постепенное уменьшение интенсивности красного максимума люминесценции (рис. 84, 4-9), что связано, повидимому, с образованием полимерных цепочек из чередующихся молекул красителя и кальция, т.е. с образованием собственно лака.
Сложность интерпретации результатов взаимодействия клеток с ализариновым красным S при использовании только визуального наблюдения может быть проиллюстрирована на примере рецептора растяжения речного рака. После обработки этого препарата насыщенным раствором красителя возникает довольно яркая красная люминесценция различных структур этого объекта. При наблюдении одного и того же препарата, как в свете его люминесценции, так и в проходящем свете можно видеть, что некоторые структуры, такие, например, как ядра глиальных клеток, окружающих нейроны рецептора, не обладают заметной люминесценцией, хотя в проходящем свете в них наблюдается высокая плотность красного пигмента. В то же время мышечные клетки характеризуются как высокой плотностью красного пигмента, наблюдаемого в проходящем свете, так и довольно яркой красной люминесценцией.
Ядра рецепторных нейронов отличаются по цвету люминесценции (желто-оранжевая) от мышечных клеток. Таким образом, сравнение окраски препарата в проходящем свете и в свете люминесценции указывает на большую специфичность люминесцентного варианта. Сравнивая спектры люминесценции, полученные в модельных опытах (рис. 84) и при изучении различных участков рецептора растяжения (рис. 85), можно сделать заключение, что, действительно, наблюдаемое в проходящем свете распределение красителя обязано своим происхождением как образованию истинных лаков с Са2+ (например, нелюминесцирующие осадки в ядрах глиальных клеток), так и прямому электростатическому взаимодействию ализаринового красного с положительно заряженными группами белков, а также с ионами Са2+, связанными с отрицательно заряженными группами белков. Спектры люминесценции клеток. содержат две основные полосы
излучения. Одна из них характерна для одиночных молекул красителя (ср. рис. 84, 2 и рис. 85, 3), в то время как другая полоса с максимумом излучения в области 520 нм принадлежит комплексу одного иона Са2+ с одной молекулой ализаринового красного.
Таким образом, люминесценцию различных структур, в том числе мышечных клеток, следует, по-видимому, отнести за счет электростатического взаимодействия самих молекул красителя с полярными группами белков. При этом возникает вопрос о специфичности такого взаимодействия и о роли мест связывания Са2+ на белках в этом процессе.
Рис. 85. Спектры люминесценции рецептора растяжения речного рака, флуорохромированного насыщенным раствором ализаринового красного в течение 10 мин. 1 – аксонный холмик медленно адаптирующегося нейрона; 2 – ядро того же нейрона; 3 – участок медленно адаптирующейся мышцы; 4 – 7 – изменение спектра люминесценции медленно адаптирующейся мышцы в течение 14 мин после добавления к препарату (3) нескольких кристаллов ЭДТА; 8 – дендрит медленно адаптирующегося нейрона после обработки препарата ЭДТА.
Рост красной люминесценции одного и того же участка мышцы (рис. 85, 3) после добавления к препарату ЭДТА (рис. 85, 4-7) указывает на возможность взаимодействия красителя с группами белков, блокированными ионами Са2+.
В качестве другого примера люминесцентного индикатора кальция, использовавшегося в гистохимии, может быть назван флуорексон [301, 302]. Это соединение совместно с тетрациклином было применено для разработки двухцветной окраски минерализованных тканей [303].
ФЛУОРЕКСОН
2, 4-Бис-[N, N'-ди(карбоксиметил)- аминометил]флуоресцеин. Флуоресцеинкомплексон. Кальцеин С30Н26N2О13
м. в. 622,55
И, наконец, наибольшее распространение в качестве люминесцентной метки кальция в последнее время получил антибиотик тетрациклин. Способность тетрациклина образовывать с кальцием хеллат [304] была использована для разработки методов исследования кальция не только в минерализованных тканях [305, 306], но и в различных клетках [307] и их органоидах [308-311].
ХЛОРТЕТРАЦИКЛИН
Ауреомицин С22Н23 О8N2Cl
м. в; 478,9
Весьма интересные данные о росте и минерализации кости были получены при комплексном применении всех трех упомянутых выше меток [312]. Животным вводили сначала ализариновый красный S, через неделю - окситетрациклин b еще через неделю - флуорексон.
По прошествий недели после введения флуорексона изготавливали препараты костей и их люминесценцию исследовали микроскопически.
В результате такой обработки вокруг гаверсовых полостей кости образовывались концентрические зоны разного цвета люминесценции. Наиболее удаленная от гаверсова канала область обладала красной люминесценцией ализарина, далее следовала область золотисто-желтой люминесценции окситетрациклина и непосредственно к гаверсовой полости примыкало кольцо зелёной люминесценции флуорексона. Эта работа представляет собой пример изящного применения трехцветного люминесцентного метода, позволяющего легко проследить направление и скорость минерализации кости.
Одним из важнейших и наиболее трудных вопросов, возникающих при попытке использовать люминесцентные, красители-метки для изучения функциональных механизмов клетки является вопрос о природе субстрата, связывающего люминесцентную метку. Большая сложность и многокомпонентность клетки, наличие в ней взаимодействующих структурных органоидов, имеющих зачастую сходные механизмы действия, не позволяют использовать непосредственно представления о взаимодействии метки с какими-либо чистыми веществами in vitro для интерпретации данных, полученных при исследовании клетки.
Необходимым, обычно, является проверка этих представлений на все более усложняющихся модельных объектах, таких, как суспензия митохондрий и их наружных и внутренних мембран, саркоплазматический ретикулум, сократительный аппарат и т.д. Не менее полезным является использование в качестве моделей узкоспециализированных клеток, в которых изучаемый механизм представлен наиболее ярко. Некоторые подходы подобного типа были описаны выше.
Определенную пользу может принести также прием, заключающийся в применении к одному и тому же препарату последовательно нескольких люминесцентных меток одного и того же субстрата. Наблюдаемые при этом зачастую конкурентные отношения меток, обладающих разной по цвету люминесценцией, могут доставить ценную информацию.
Например, изложенные выше данные, полученные при исследовании суспензий митохондрий, указывают на возможность взаимодействия аурамина с местами специфического связывания кальция на белках. Поэтому представлялось интересным сравнить локализацию аурамина с локализацией одиночных молекул ализаринового красного S на белках одного и того же препарата.
Оказалось, что если препарат рецептора растяжения рака, окрашенный ализариновым красным, дополнительно обработать аурамином, то последний вытесняет с белков ализариновый красный. Это видно не только по замене его красной люминесценции на зеленую люминесценцию аурамина, но и по ослаблению плотности ализарина в проходящем свете в местах его непосредственной связи с белками (мышца). Таким образом, аурамин (катион) выступает здесь как своеобразный конкурент молекул ализаринового красного S (анион) за места связывания на белках. Места, за которые может происходить конкуренция, представляют собой, по-видимому, отрицательно заряженные группы белков, блокированные Са2+ и приобретающие таким образом положительный заряд. Анион ализаринового красного электростатически связывается с ионом Са2+, в свою очередь связанным с отрицательно заряженной группой белка. Появившийся в среде катион аурамина, взаимодействуя с отрицательно заряженными группами белков, вытесняет с них Са2+, через который осуществлялась связь аниона ализаринового красного с этими группами.
Точно также можно наблюдать взаимоотношения ализаринового красного S и хлортетрациклина, о котором известно, что интенсивность его люминесценции на несколько порядков выше, если он связан с кальцием и находится в неполярном окружении — в мембранах [308, 309, 313]. При окрашивании препарата рецептора растяжения рака хлортетрациклином можно наблюдать яркую зеленую люминесценцию мышц, приядерных и примембранных областей обоих нейронов. Дополнительная окраска препарата ализарином приводит почти к полному замещению зеленой люминесценции хлортетрациклина красной люминесценцией ализарина. Докраска этого же препарата хлортетрациклином только частично возвращает зеленую люминесценцию, наиболее заметную в медленно адаптирующейся мышце. Следует при этом отметить, что в отличие от аурамина хлортетрациклин не вытесняет из препарата красный продукт взаимодействия ализарина с белками мышц, наблюдаемый в проходящем свете. По-видимому, места связывания этих люминесцентных меток различны. Результаты подробных исследований взаимодействия хлортетрациклина с митохондриальной суспензией (рис. 86) указывают на то, что основной вклад в люминесценцию вносит комплекс хлортетрациклина с Са2+, находящийся в гидрофобной области митохондриальной мембраны [313].
Приведенные выше сравнительные наблюдения показывают, что хотя все три красителя имеют отношение к кальцию, они характеризуют, однако, разные аспекты его обмена в клетке. Свободный кальций определяется ализариновым красным S по местам локализации зеленой люминесценции его одиночных комплексов с красителем (520 нм), по узкополосной (рис. 84, 4) красной люминесценции (685 нм) комплексов кальция с двумя молекулами красителя или по местам локализации красного нелюминесцирующего лака, наблюдаемого в проходящем свете.
Молекулы ализаринового красного S, являющегося анионным красителем, способны к электростатическому взаимодействию с Са2+, связанным с отрицательно заряженными группами белков. В этом случае ализариновый красный S обладает характерной широкополосной люминесценцией кирпично-красного цвета (рис. 84, 2; рис. 85, 1, 3) и может вытесняться вместе с Са2+ с групп связывания аурамином. Возможно, что в число мест взаимодействия обоих этих красителей входят и специфические места связывания Са2+.
Рис. 86. Изменение люминесценции хлортетрациклина (длина волны 540 нм), связанного интактными митохондриями (1) и митохондриями, ингибированными олигомицином (2) [313]. Длина волны возбуждения 436 нм.
Что касается хлортетрациклина, то его люминесценция выявляет, по-видимому, присутствие кальция в гидрофобных участках препарата. Это уже упоминавшееся качество хлортетрациклина резко (в 200-400 раз) увеличивать квантовый выход при связывании его с кальцием в неполярных (мембраны) структурах клетки нашло применение и при изучении динамики кальция в мембране аксона при генерации потенциала действия [314].
4.3.Исследование структуры мембраны при генерации потенциала действия
Для полноты изложения представляется полезным кратко суммировать на основе литературных данных попытки применения люминесцентных красителей-меток в изучении структуры мембраны нерва во время генерации потенциала действия.
Наиболее подходящими для этих целей являются именно красители или комбинации красителей с переменным квантовым выходом. Естественно, что одной из первых меток, примененных для изучения структурных изменений мембраны, оказался АНС. Было установлено, что изменение интенсивности люминесценции нерва, окрашенного АНС, коррелирует с суммарным потенциалом действия тонких волокон [57]. Исследования на гигантских аксонах кальмара [315-322] показали, что изменения интенсивности люминесценции АНС имеют разный знак в зависимости от того, внутри аксона или снаружи он находится (рис. 87). Аналогичным образом изменяется люминесценция АНС в искусственных бислойных лецитиновых мембранах под действием импульсов напряжения, когда краситель находится в растворе с одной стороны мембраны [323].
Рис. 87. Изменение интенсивности люминесценции (1) аксона кальмара, флуорохромированного АНС во время потенциала действия (2) [322]. АНС на внешней поверхности аксона. Использовано синхронное накопление сигнала.
Существенным недостатком АНС в этих экспериментах является весьма малая величина изменения интенсивности его люминесценции в ответ на электрическую стимуляцию объекта, лежащая значительно ниже уровня шумов. Поэтому оказывается необходимым применение сложных методов синхронного накопления для выделения полезного сигнала из-под шума. Более того, окончательно не ясно, отражает ли потенциалзависимое изменение люминесценции АНС динамику структурных перестроек в мембране или оно связано с прямым действием электрического поля на молекулы красителя или их окружение [324].
Наилучшие результаты, были получены при использовании мероцианиновых красителей, обладающих высоким соотношением сигнал/шум на аксоне. Изменение люминесценции аксона, окрашенного мероцианином, оказалось возможным наблюдать во время одиночного потенциала действия без применения накопления сигнала [325-327].
«Мероцианин 540»
Применявшийся краситель слабо растворим в воде, и потому готовили его спиртовой раствор, разбавлявшийся затем морской водой. Конечное содержание спирта - 1%. Данные, полученные на аксоне кальмара диаметром 0,4 мм, окрашенном в течение 10 мин при температуре 14° С, приведены на рис. 88.
Рис. 88. Изменение интенсивности люминесценции аксона кальмара, флуорохромированного мероцианиновым красителем, во время потенциала действия [325]. Прямые измерения.
В живых клетках мероцианин окрашивает в основном мембранные структуры препарата, взаимодействуя при этом, по-видимому, с липидной областью мембраны, свободной от функциональных белковых групп. Во всяком случае, окраска мероцианином не вызывает нарушений работы механизмов ионного транспорта, не препятствует генерации потенциала действия и не нарушает, например, колебательного режима работы митохондриальных мембран (рис.89).
Рис. 89. Влияние мероцианина на функциональное состояние митохондрий. 1 – интенсивность люминесценции «мероцианина-540», связанного с мембраной митохондрий; 2
– концентрация калия в среде; 3 – скорость потребления кислорода.
Другим перспективным подходом, аналогичным рассмотренному выше на примере взаимодействия белков в саркомере мышцы, является использование для изучения мембран пары красителей, квантовый выход которых меняется за счет миграции энергии возбуждения при сближении меток. Используя такую пару люминесцентных красителей, Кун [328] весьма изящно исследовал сближение липидных монослоев при их контакте. Монослои формировались из арахидоновой кислоты на твердой подложке (поливиниловая пленка, стекло) или на поверхности воды. Поверхность одного монослоя окрашивали красителем-донором (Д), поверхность второго -
красителем-акцептором (А), в качестве которых были использованы люминесцентные метки с приведенными ниже структурными формулами.
Используя монохроматическое излучение, возбуждали только голубую люминесценцию метки-донора. Приближение второго монослоя с адсорбированной на нем меткой-акцептором на расстояние менее 200 Å приводило к уменьшению интенсивности голубой люминесценции донора и появлению желтой люминесценции акцептора. Миграция энергии возбуждения от метки-донора к метке-акцептору наблюдалась в интервале расстояний между этими молекулами от 50 до 200 Å.
Аналогичные результаты были получены и в случае использования в качестве акцептора нелюминесцирующего гемоглобина, безызлучательно рассеивающего принятую от метки-донора энергию. Естественно, что в этом случае о миграции энергии возбуждения судили только по уменьшению интенсивности голубой люминесценции. Расчеты показывают [328], что взаимодействие красителей в данном случае может быть описано как взаимодействие фосфоресцирующих электрических диполей.
Миграцию энергии между различными парами таких соединений, как хлорофиллы а и в, и некоторыми красителями исследовали на бислойных липидных мембранах [329]. Пигменты вводили в мембрану и определяли ту концентрацию их, при которой по изменению спектра люминесценции обнаруживалась миграция энергии. Было показано, в частности, что миграция энергии между хлорофиллом а и в осуществляется на расстоянии до 100 Å.По-видимому, методические подходы с использованием явления миграции энергии окажутся наиболее перспективными при исследовании структурных изменений в клеточных мембранах в процессе выполнения ими функций.
4.4. Взаимодействие белков и нуклеиновых кислот
Явление миграции энергии от одного красителя к другому может служить основой для разработки чрезвычайно чувствительных методов исследования взаимодействия различных макромолекул в процессе функционирования их в клетке. Некоторые особенности такого подхода могут быть рассмотрены на примере разработки люминесцентного аналога известной реакции Грама
[330—332].
Отношение микроорганизмов к окраске по Граму является одним из важнейших таксономических признаков. Однако классический вариант реакции Грама [333] представляет собой довольно длительный и трудоемкий процесс, требующий предварительной фиксации исследуемых клеток. В этой связи представлялось полезным разработать быстрый способ прижизненного определения грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов на основе использования некоторых специфических свойств люминесцентных красителей.
Как неоднократно указывалось, отношение к окраске по Граму связано с особенностями клеточной оболочки микроорганизмов. Предполагается, что в то время как поверхность грамотрицательных клеток покрыта слоем белков и липопротеидов, в состав клеточной оболочки грамположительных микроорганизмов входит рибонуклеиновая кислота [32, 333, 334]. Поэтому для разработки метода были выбраны люминесцентные красители, один из которых - АНС -обладает высоким сродством к гидрофобным группам белковых молекул, а другой - этидиум бромид - характеризуется крайне высокой специфичностью связывания с нуклеиновыми кислотами.
Другим особым свойством, общим для обоих красителей, определившим их выбор для разработки метода, является способность резко (в 50-100 раз) увеличивать квантовый выход люминесценции при связывании с субстратом. Это обстоятельство исключительно полезно в методическом отношении, так как позволяет наблюдать окрашенные клетки без предварительной отмывки избытка несвязавшихся красителей. В связанном виде АНС и этидиум бромид обладают люминесценцией с максимумами 490 и 610 нм соответственно, как это схематически показано на рис. 90. При этом полоса излучения АНС перекрывается практически полностью полосой поглощения этидиум бромида, что создает особо благоприятные предпосылки для миграции энергии с АНС на этидиум бромид.
Для разработки метода были использованы 150 заведомо определенных по Граму штаммов микроорганизмов, полученных из лаборатории коллекционных культур ИБФМ АН СССР. Микроорганизмы окрашивали водными растворами этидиум бромида в концентрации 10-5 г/мл и АНС в концентрации 10-4 г/мл (Serva, ФРГ). Каплю окрашиваемой бактериальной суспензии наносили на предметное стекло и добавляли к ней каплю раствора этидиум бромида. Затем препарат накрывали покровным стеклом, излишки жидкости удаляли фильтровальной бумагой, после чего на край покровного стекла наносили каплю раствора АНС и оттягивали жидкость фильтровальной бумагой с противоположной стороны, ускоряя таким образом распределение АНС в препарате под покровным стеклом. Препарат окантовывали парафином для предохранения от высыхания и
исследовали микроспектрофлуориметрически при возбуждении люминесценции в максимуме поглощения АНС (365 нм).
Рис. 90. Спектры поглощения АНС в концентрации 10-4 г/мл (1) и этидиум бромида в концентрации 2,5 10-4 г/мл (2). Схематически показано положение полос излучения АНС (3) и этидиум бромида (4) в спектральном диапазоне.
После окраски этидиум бромидом и АНС по описанной выше методике живые грамотрицательные микроорганизмы резко отличаются от грамположительных по цвету люминесценции. Живые грамотрицательные микроорганизмы разных видов приобретают голубую люминесценцию с максимумом излучения в области 490 нм (рис. 91, 1), в то время как грамположительные бактерии вне зависимости от их видовой принадлежности обладают однотипной красной люминесценцией с максимумом излучения в области 605-610 нм (рис. 91, 2).
Рис. 91. Спектры люминесценции грамотрицательных (1 – Serratia marcescens
B-63) и грамположительных (2 – Bacilus subtilis В-580) микроорганизмов, окрашенных АНС и этидиум бромидом. Длина волны возбуждения 365 нм.
Следует отметить, что в культурах грамотрицательных микроорганизмов, выращенных в жидких средах, встречаются единичные клетки, обладающие люминесценцией в красной области спектра. Количество таких клеток увеличивается в препаратах из культур, выращенных на твердых средах. Можно было предположить, что это мертвые или поврежденные клетки. Контрольные опыты с окрашиванием суспензий грамотрицательных микроорганизмов, подвергнутых нагреву до 100° С, показали, что при увеличении времени нагревания суспензии относительное количество клеток, приобретающих красную люминесценцию, пропорционально увеличивается.
Смену цвета люминесценции грамотрицательных микроорганизмов с голубого на красный удобно наблюдать на одиночной клетке у видов, обладающих ярко выраженной двигательной активностью. Если в свежеприготовленном препарате грамотрицательных бактерий Enterobacter cloacae клетки характеризуются высокой двигательной активностью и имеют голубую люминесценцию (рис. 92, 1), то через некоторое время их движение замедляется и в спектре люминесценции появляется красная компонента (рис. 92, 2), которая становится доминирующей (рис. 92, 3) после прекращения подвижности клеток. При этом форма спектра люминесценции поврежденных или мертвых грамотрицательных микроорганизмов (рис. 92, 3) становится такой же, как и у заведомо грамположительных клеток (рис. 92, 4).
Следует отметить, что в то время как вегетативные клетки грамположительных микроорганизмов приобретают красную люминесценцию с максимумом излучения 605-610 нм, их споры обладают голубой люминесценцией с максимумом излучения 490 нм.
Рис. 92. Изменение спектров люминесценции грамотрицательных бактерий Enterobacter cloacae В-69 (1-3)
при повреждении, сопровождающемся прекращением движения (3). Для сравнения приведен спектр люминесценции грамположительных микроорганизмов
Staphylococcus aureus В-83 (4). Длина волны
365 нм.
Имея в виду упомянутые специфические свойства использованных красителей, можно предполагать, что именно различие в организации клеточной оболочки грамотрицательных и грамположительных микроорганизмов является причиной наблюдаемого различия в их люминесцентной окраске. Действительно, появление у живых грамотрицательных микроорганизмов голубой люминесценции с максимумом излучения 490 нм указывает на то, что только АНС имеет возможность связываться с субстратом (гидрофобные области белков) на поверхности этих клеток. Повреждение белково-липопротеиновой оболочки клеток грамотрицательных микроорганизмов открывает доступ этидиум бромиду к местам его специфического взаимодействия с молекулами нуклеиновых кислот, что приводит к появлению характерной для связанного этидиум бромида дополнительной полосы люминесценции в красной области (рис. 92, 2). При этом по мере увеличения интенсивности полосы люминесценции этидиум бромида (605-610 нм) наблюдается уменьшение интенсивности излучения АНС с максимумом в области 490 нм (рис. 96, 3). Повидимому, причиной этого является безызлучательная миграция энергии с АНС на этидиум бромид благодаря почти полному перекрытию полосы излучения АНС (рис. 90, 3) с полосой поглощения этидиум бромида (рис. 90, 2).
По той же причине (непроницаемость внешней оболочки для этидиум бромида и отсутствие специфических для него мест связывания на поверхности) наблюдается голубая люминесценция спор грамположительных микроорганизмов за счет абсорбции на их поверхности АНС.
Иная ситуация возникает при взаимодействии двух красителей с оболочкой грамположительных микроорганизмов. В этом случае этидиум бромид имеет доступ к специфическим для него местам связывания с рибонуклеиновыми кислотами. Благодаря этому грамположительные клетки приобретают красную люминесценцию с максимумом излучения в области 605-610 нм. Возможно, что и АНС адсорбируется на гидрофобных группах белков этих клеток, однако, упомянутая выше миграция энергии с АНС на этидиум бромид приводит к резкому ослаблению голубой люминесценции АНС в области 490 нм (рис. 91, 2).
Результаты описанных выше исследований позволяют полагать, что донорно-акцепторная пара АНС - этидиум бромид представляет собой тонкий инструмент для изучения взаимодействия белков и нуклеиновых кислот в клетке. Как и следовало ожидать, имея в виду высокую специфичность взаимодействия каждого из этих красителей, люминесценция не возникает при добавлении ДНК или РНК к раствору АНС, так же как и в случае добавления гистона к этидиум бромиду. При окрашивании ДНК (или РНК) парой АНС - этидиум бромид возникает только характерная красная люминесценция этидиум бромида. Обработка этой парой меток раствора гистона приводит к появлению только голубой люминесценции АНС.
Другая картина [335, 336] наблюдается при окрашивании коацерватных капель [337], образованных системой ДНК-гистон. Добавление к препарату АНС приводит к появлению голубой люминесценции его комплексов с гистоном (рис. 93, 1). Дополнительное окрашивание этих же капель этидиум бромидом вызывает резкое изменение спектра: голубая люминесценция АНС гасится и появляется красная люминесценция комплексов этидиум бромида с ДНК (рис. 93, 2). Несомненно, что миграция энергии с АНС на этидиум бромид лежит в основе регистрируемого эффекта, как и в описанном выше случае изменения окраски при гибели грамотрицательных клеток.
Интересно отметить, что гашение люминесценции АНС за счет миграции энергии на этидиум бромид наблюдается и в том случае, когда коацерватные капли (система ДНК - гистон) приготавливаются из предварительно окрашенных компонентов ДНК + этидиум бромид и гистон + АНС. Присутствие меток на макромолекулах не препятствует образованию ими коацерватных капель, имеющих люминесценцию только в красной области спектра. По-видимому, это означает, что миграция энергии с АНС, закрепленного на гистоне, на этидиум бромид, связанный с ДНК, осуществляется вдоль молекулы белка и нуклеиновой кислоты по системе взаимодействующих π- электронных орбит этих макромолекул.
Рис. 93. Спектры люминесценции коацерватных капель (система ДНКгистон), окрашенных вначале АНС (1), а затем дополнительно этидиум бромидом
(2).
Другим примером использования этого же методического подхода может служить работа Бекера и соавт. [338], в которой исследовалась полимеризация белков микротрубочек и их связь с мембранными структурами клетки. При этом один компонент тубулина (белок микротрубочек) или мембраны окрашивали флуоресцеинизотиоцианатом (донор), а другой - родаминизотиоцианатом (акцептор). Длина волны возбуждения соответствовала поглощению метки-донора. При смешивании приготовленных таким способом растворов в спектре люминесценции помимо полосы излучения флуоресцеинизотиоцианата (желто-зеленый цвет) появлялась дополнительно и полоса люминесценции родаминизотиоцианата (красный цвет) за счет миграции энергии от молекулыдонора к молекуле-акцептору при образовании комплексов тубулин - тубулин и тубулин - мембраны.
Заканчивая данную главу, имеет смысл обратить внимание на возможность использования некоторых люминесцентных меток с высокой специфичностью взаимодействия для выяснения молекулярного состава соответствующих функциональных механизмов клетки. Приведенные выше данные свидетельствуют о высокой специфичности взаимодействия этидиум бромида именно с нуклеиновыми кислотами. Оказалось, что этидиум бромид, кроме того, обладает способностью в малых концентрациях подавлять спайковую электрическую активность нервных клеток, накапливаясь в их мембранах. Этот эффект трудно объяснить, не предполагая наличия «скелета» из нуклеиновой кислоты в составе электрогенных каналов клеточной мембраны, имея в виду и то обстоятельство, что рибонуклеопротеиновые комплексы из клеточной стенки грамположительных микроорганизмов послужили одной из первых моделей электрогенных каналов в искусственных липидных мембранах [339-341].