3.1.2. Оптимизация рН среды для культивации клеток
Как известно из работы С.А. Лепеховой, снижение рН рабочих растворов ниже 7,2 (расчетная величина рН стандартных питательных сред RPMI, 199, Хенкса) после погружения в них взвеси выделенных клеток сопровождается уменьшением количества жизнеспособных клеток. В этой связи отдельная серия экспериментов in vitro была посвящена в нашей работе поиску оптимального pH среды для клеточной культивации.
Для выявления оптимального уровня pH нами были произведены 2 серии стендовых экспериментов, в которых производили инкубацию клеток селезенки свиньи в течение 2 часов в стандартных условиях. В процессе инкубации происходило изменение рН раствора в сторону закисления. После инкубации производили оценку степени жизнеспособности взвеси клеток свиной селезенки методом исключения красителя (0,4% раствор трипанового синего). Нами были получены следующие показатели жизнеспособности (табл. 3.2).
Таблица 3.2
Изменение рН питательной среды после размещения в ней выделенных клеток и показатель их жизнеспособности во взвеси после инкубации в термостате при 370С в течение 2 часов (медиана, нижний и верхний квартили)
Исходное значение рН питательной среды |
рН среды после размещения клеточной взвеси, n=8 |
Жизнеспособность, через 2 часа культивации, % |
6,8 |
6,6 (6,5-6,8) |
80,8 (79,3-80,9) |
7,0 |
6,9 (6,9-6,95) |
88,0 (87,7-88,1) |
7,2 |
6,95 (6,9-7,1) |
95,3 (95,3-96,2) |
7,4 |
7,2 (7,2-7,2) |
96,6 (96,6-97,7) |
7,6 |
7,4 (7,4-7,4) |
99,4 (99,4-99,6) |
7,8 |
7,6 (7,5-7,6) |
98,6 (98,2-99,1) |
8,0 |
7,0 (7,0-7,0) |
84,1 (84,0-84,2) |
8,2 |
6,7 (6,6-6,8) |
68,0 (66,6-69,1) |
Примечание: показатель жизнеспособности и объем внесенных клеток до инкубации был одинаковым во всех сериях наблюдений.
Следовательно, исходный показатель рН среды для культивации, с учетом закономерного закисления среды, должен составлять 7,6 (рац. предложение «Среда для культивации клеток селезенки свиньи» № 194 от 07.03.2001, принятое НЦ РВХ ВСНЦ СО РАМН).
Нами было показано снижение рН в среднем на 0,2 при исходных значениях 7,4-7,8, а при дальнейшем повышении рН питательной среды закисление ее после размещения клеток было более выраженным с существенным снижением удельного веса жизнеспособных клеток.
3.1.3 Культивирование клеток селезенки новорожденной свиньи
Применяли среду для культивации в оригинальной прописи (рац. предложение «Среда для культивации клеток селезенки свиньи» №194 от 07.03.2001, принятое НЦ РВХ ВСНЦ СО РАМН).
Среда для культивации клеток селезенки свиньи с pH раствора, равной 7,6.
Состав среды:
Среда RPMI 1640 - является основой
Трансферрин - 1мкг/мл
Глутамин - 0,3 мкг/мл
Дексаметазон Е-6 5Е/мл - 0,1 мл на 10 мл среды
Липиды бобов сои без холестерина - 17 мкг/мл
Сыворотка эмбриональная телячья кат. № К055 - 1 мл на 10 мл среды
рН среды - 7,6 (добивались титрованием стерильным 0,1% раствором NaOH, непосредственно перед применением).
Диспергирование клеточной взвеси проводили для снижения иммуногенности материала.
В процессе 5-ти суточной культивации количество выделенных клеток селезенки новорожденной свиньи увеличивалось на 50% (50,0-50,0). Длительность культивации была выбрана на основании известных данных о приобретении клетками в культуре к 5-м суткам культивации максимальной пролиферативной активности.
При цитологическом исследовании по окончании культивации (рис. 3.2) в препарате обнаруживали преимущественно ассоциации, состоящие из лимфоцитов, моноцитов, макрофагов и ретикулярных клеток. Встречались и разрозненные клетки. Ядра всех клеток и цитоплазма имеют четкие контуры. В ядрах преимущественно крупноглобулярный хроматин, хорошо просматриваемый на фоне просветленного ядра. Апоптозных тел и сегментоядерных лейкоцитов нет.
Рис.3.2. Клетки селезенки новорожденной свиньи после культивирования в течение 5 суток. 1- группы клеток, состоящие из лимфоцитов, моноцитов, макрофагов и ретикулярных клеток. Окраска по Романовскому. Об. 100х , Ок. 10х.
Таким образом, нами была получена культура клеток селезенки, состоящая преимущественно из лимфоцитов, с содержанием 4,6 (4,1-4,8) х 107 клеток в 1 мл взвеси и удельным весом жизнеспособных клеток 99,3% (98,9-99,4).
Если во взвеси выделенных из селезенки клеток их наибольшее количество было изолированным друг от друга – 95,0% (90-99%), то после культивации преобладали клеточные группы, а изолированных клеток было 45,0% (40-55%); pw=0,015. На этом основании в дальнейшем клеточный материал после выделения из селезенки комбинированным методом дезагрегации будем называть изолированными клетками селезенки (ИКС) и сравнивать эффекты их ксенотрансплантации (ОГ-2) с результатами пересадки культивированных клеток селезенки (ККС) – ОГ-1.
Обратимся теперь к результатам хранения клеточного материала.