16)Определение антибиотика в моче, крови и других жидкостях организма человека.

В штативе устанавливают два ряда пробирок. В одном ряду – разведения эталонного АБ, в другом – исследуемые жидкости. В каждую пробирку вносят взвесь тест – бактерий, приготовленную в среде Гисса с глюкозой. При определении в исследуемой жидкости пенициллина, тетрациклина, эритромицина в качестве тест – бактерий берут стандартный штамм Staph aureus, а при определении стрептомицина – E.coli. После инкубирования (37 градусов , 18 -20 ч) фиксируют результаты опыта по помутнению среды и ее окрашиванию индикатором вследствие расщепления глюкозы тест – бактериями. Концентрация АБ определяется умножением числа наибольшего разведения исследуемой жидкости, задерживающей рост тест – бактерий. Например, если максимальное разведение исследуемой жидкости, которая задерживает рост тест – бактерий, равняется 1:1024, а минимальная концентрация эталонного АБ, задерживающего рост тех же тест – бактерий, - 0,313 мкг/мл, то их произведение: 1024 *0,313 = 320 мкг/мл – составляет концентрацию АБ в 1 мл.

17)Генетические карты микроорганизмов. Гетерогенность популяций микроорганизмов, механизмы популяционной изменчивости. Понятие о диссоциации бактерий, r и s формы колоний.

Генетическая карта:

Гены во всех хромосомах располагаются линейно, их последовательность можно установить, это позволяет создать генетическую энциклопедию бактерий и других организмов, т.е. связать все жизненные процессы с конкретными генами. Хромосомную карту E.coli начали составлять изучая время переносов гена при коньюгации, которую прерывают через разные промежутки времени. Поэтому локализацию генов на хромосоме определяют в минутах их переноса (0-100мин) – это время полного переноса у E.coli.

Своеобразной формой изменчивости является R-S-диссоциация бактерий. Она возникает спонтанно вследствие образования двух форм бактериальных клеток, которые отличаются друг от друга по характеру образуемых ими колоний на твердой питательной среде. Один тип — R-колонии (англ. rough — неровный) — характеризуется неровными краями и шероховатой поверхностью, второй тип — S-колоний (англ. smooth— гладкий)— имеет круглую форму, гладкую поверхность. Процесс диссоциации, т.е. расщепления бактериальных клеток, формирующих оба типа колоний, обычно протекает в одном направлении: от S- к R-форме, иногда через промежуточные стадии образования слизистых колоний. Обратный переход R- в S-

форму наблюдается реже. Для большинства вирулентных бактерий

характерен рост в виде S-формы колоний. Исключение составляют микобактерии туберкулеза, чумы, сибиреязвенные бактерии и некоторые другие, которые растут в R-форме.

В процессе диссоциации одновременно с изменением морфологии колоний меняются биохимические, антигенные, патогенные свойства бактерий, их устойчивость к физическим и химическим

факторам внешней среды. Мутации, которые приводят к S-R-диссоциации, относятся к инсертационным, поскольку они возникают после встраивания внехромосомных факторов наследственности, в том числе и умеренных фагов в бактериальную хромосому. Если эта мутация приводит к утрате генов, контролирующих образование детерминантных полисахаридных звеньев ЛПС у грамотрицательных бактерий, то образуются

R-мутанты. Они формируют шероховатые колонии, изменяют свои антигенные свойства и резко ослабляют патогенность. У дифтерийных бактерий S-R-диссоциация связана с их лизогенизацией соответствующими

бактериофагами. При этом R-формы образуют токсин. У других бактерий R-формы возникают после интеграции в их хромосому R-плазмиды, транспозонов или Is-последовательностей. R-формы

пиогенных стрептококков и ряда других бактерий образуются в результате

рекомбинаций. Биологическое значение S-R-диссоциации состоит в приобретении

бактериями определенных селективных преимуществ, обеспечивающих их существование в организме человека или во внешней среде. К ним относится более высокая устойчивость S-форм к фагоцитозу

макрофагами, бактерицидному действию сыворотки крови. R-формы обладают большей устойчивостью к факторам окружающей среды. Они более длительное время сохраняются в воде, молоке.

Вместе с тем S-R-диссоциация во многих случаях усложняет бактериологическую диагностику ряда инфекционных заболеваний, например дизентерии Зонне, эшерихиоза, вызванного Е. coli 0124 и др.

Увеличение гетерогенности микробных популяций в организме человека происходит за счет воздействия мутагенных факторов, образующихся в результате метаболических реакций (пероксида водорода,

нитрозамины и др.), некоторых химиотерапевтических средств (производные нитрофурана и др.), а также молекул ДНК и РНК, освобождающихся после гибели микроорганизмов и клеток разнообразных

тканей и органов. Вместе с тем транспозоны и Is-последовательности при перемещении

на бактериальной хромосоме встраиваются в любые ее участки, вызывая инсертационные мутации.

Гетерогенность микробных популяций увеличивается также в результате перестройки структурных генов, в том числе и тех, которые контролируют образование антигенов. Так, например, при локализации отдельных фрагментов одного и того же гена в разных частях бактериальной хромосомы или в хромосомной и плаз-

мидной ДНК они будут функционировать только при сборке в единый ген. Число вариантов этого функционирующего гена для каждой микробной клетки весьма велико, что дает возможность синтезировать

широкий ассортимент разновидностей одного и того же продукта. В данном случае селективными преимуществами буцут обладать микроорганизмы, имеющие гетерологичные антигены к циркулирующим

в крови антителам. Подобные генетические механизмы лежат в основе антигенной изменчивости гонококков, боррелий возвратного тифа, трипаносом, малярийного плазмодия и других микроорганизмов

в ходе инфекционного заболевания. Некоторые F-, R-плазмиды, трансдуцирующие бактериофаги, вносят

с собой фрагменты чужеродной ДНК, которые могут рекомбинировать с ДНК реципиентных клеток в том случае, если они имеют гомологичные нуклеотидные последовательности. В результате описанных

событий изменяются генотипы бактериальных клеток, что фенотипически проявляется в появлении новых признаков, которые оцениваются естественным отбором. В организме человека в качестве селективных факторов выступают химиотерапевтические средства, специфические антитела и др.

Вместе с тем эти же факторы могут служить индукторами соответствующих сигналов, которые воспринимаются рецепторами микробных клеток и передаются регуляторным генам, что приводит к появлениюновых генотипов и фенотипов.

18)Механизмы действия АБ на микробную клетку: ингибиторы синтеза пептидогликана клеточной стенки, синтеза белка, нуклеиновых кислот, пуринов аминокислот, ингибиторы функций мембраны и цитоплазматической мембраны у микроскопических грибов.

Антибиотики, подавляющие синтез бактериальной клеточной стенки:

К данной группе относятся пенициллины, цефалоспорины, циклосерин.

Пенициллины. Продуцентами пенициллинов являются плесневые грибы рода Penicillium, которые в процессе своей жизнедеятельности образуют несколько видов пенициллинов. Наиболее активным

природным соединением является бензилпенициллин. А н т и б а к т е р и а л ь н ы й с п е к т р пенициллины 1-го поколения имеют сравнительно узкий: приородные антибиотики (бензилпенициллин) действуют преимущественно на гноеродные кокки и некоторые грамположительные бактерии (палочки дифтерии, клостридии и др.). Типичными представителями противостафилококковых пенициллинов являются оксациллин, метициллин и другие препараты, устойчивые к пенициллиназе. У аминопенициллинов и карбоксипенициллинов антибактериальный спектр расширен за счет ряда грамотрицательных бактерий (прежде всего энтеробактерий). Уреидопеницилинны активны в отношении некоторых других грамотрицательных бактерий, в частности псевдомонад. Это объясняется их

способностью проникать через липополисахарид клеточных стенок грамотрицательных бактерий.

М е х а н и з м а н т и б а к т е р и а л ь н о г о д е й с т в и я всех п е н и ц и л л и н о в связан с нарушением синтеза клеточной стенки за счет блокирования реакции транспептидирования в синтезе пептидогликана (муреина). Таким образом, пенициллин действует только на растущие клетки, в которых осуществляются

процессы биосинтеза пептидогликана. Вследствие отсутствия пептидогликана в клетках человека пенициллин не оказывает на них ингибирующего действия (отсутствие ≪мишени≫), т.е. является практически нетоксичным антибиотиком.

Цефалоспорины — большая группа природных антибиотиков, продуцируемых грибами рода Cephalosporium, и их полусинтетических производных. Основным структурным компонентом цефалоспо-

ринов является 7-аминоцефалоспориновая кислота (7-АЦК), которая имеет сходство с 6-аминопенициллановой кислотой (6-АПК), основой пенициллинов. А н т и б а к т е р и а л ь н ы й с п е к т р цефалоспоринов I -го поколения в целом достаточно широк. Они характеризуются высокой активностью против грамположительных бактерий и выборочно в отношении грамотрицательных. По действию на стафилококки и эшерихии они превосходят пенициллины. В терапевтических концентрациях преобладает бактерицидное действие препаратов. Однако так же, как и к пенициллинам, к ним устойчивы

псевдомонады, протеи, многие энтерококки, бактероиды. Цефалоспорины 2-го поколения отличаются более высокой устойчивостью к бета-лактамазам грамотрицательных бактерий и более широким антибактериальным спектром, хотя к ним также устойчивы нышеперечисленные микроорганизмы.

Цефалоспорины 3-го поколения относятся к антибиотикам широкого спектра действия с высокой стабильностью к большинству микробных Р-лактамаз. Они отличаются от антибиотиков предыдущих

поколений значительно большей активностью в отношении синегнойных бактерий, бактероидов и др. Высокоактивны в отношении бактерий, резистентных к пенициллинам и цефалоспоринам 1-го и 2-го

поколений, в частности метициллинрезистентных и цефазолинрезистентных штаммов, а также к аминогликозидным антибиотикам, левомицетину, сульфаниламидам. Инфекции, вызванные псевдомонадами, хорошо поддаются лечению цефтазидимом. М е х а н и з м а н т и б а к т е р и а л ь н о г о д е й с т в и я цефалоспоринов такой же, как и у пенициллинов.

Циклосерин. Антибиотик, образующийся в процессе жизнедеятельности некоторых актиномицетов. Он получен синтетическим путем. А н т и б а к т е р и а л ь н ы й с п е к т р . Циклосерин оказывает

бактериостатическое действие на некоторые грамположительные и грамотрицательные бактерии. Важной особенностью данного антибиотика является его способность задерживать размножение микобактерий

туберкулеза, хотя она выражена слабее, чем у стрептомицина, фтивазида и тубазида. Циклосерин действует на устойчивые к перечисленным препаратам микобактерии туберкулеза. Его относят к антибиотикам

≪резерва≫. М е х а н и з м а н т и б а к т е р и а л ь н о г о д е й с т в и я циклосерина объясняется изменениями в синтезе сшивающей тетрапептидной цепи в пептидогликане клеточной стенки за счет включения L-циклосерина вместо D-аланина.

Антибиотики, нарушающие функции цитоплазматической мембраны (ЦМ) микроорганизмов:

К данной группе относятся полимиксины, полиеновые антибиотики (нистатин, леворин, амфотерицин В).

Полимиксины. Группа родственных антибиотиков, продуцируемых спорообразующими почвенными бактериями Bacillus polymyxa и др. По химическому строению представляют собой сложные соединения,

включающие остатки полипептидов. К данной группе относятся полимиксин М, полимиксин В, которые отличаются друг от друга главным образом фармакологическими свойствами. А н т и б а к т е р и а л ь н ы й с п е к т р этих антибиотиков включает преимущественно грамотрицательные бактерии (кишечная

и синегнойная палочки, шигеллы, протей, клебсиеллы). Резистентны к полимиксинам грамположительные бактерии, микоплазмы, грибы. На чувствительные бактерии полимиксины оказывают бактерицидное

действие, резистентность к ним развивается медленно.

Полиеновые антибиотики. К данной группе относятся главным образом противогрибковые антибиотики: нистатин, леворин, амфотерицин В, продуцируемые антиномицетами. Близки к ним гризеофульин, толнафтат, клотримазол, миконазол, кетоконазол и др. К гризеофульвину и толнафтату чувствительны дермотофиты, к трем последним препаратам — большинство грибов, за исключением аспергиллов.

А н т и м и к р о б н ы й с п е к т р нистатина и леворина включает дрожжеподобные грибы рода Candida и грибы рода Aspergillus. К амфотерицину В чувствительны возбудители глубоких микозов.

Резистентность чувствительных микроорганизмов к данным антибиотикам развивается редко. М е х а н и з м а н т и м и к р о б н о г о д е й с т в и я полиеновых антибиотиков связан с адсорбцией на цитоплазматической мембране грибов и взаимодействием с ее стерольным компонентом. Это приводит к повышению проницаемости мембраны, в результате чего клетка обезвоживается, теряет некоторые микроэлементы (калий) и в конечном итоге погибает. Таким образом, чувствительность микроорганизмов к нистатину, неворину и другим полиеновым антибиотикам объясняется наличием стеролов в составе их мембраны, а устойчивость бактерий, спирохет, риккетсий и других микроорганизмов — отсутствием данного компонента. Возникновение резистентности к этим антибиотикам у дрожжеподобных

грибов наблюдается редко.

Антибиотики, ингибирующие синтез белка на рибосомах бактериальных клеток

Это самая многочисленная группа антибиотиков, включающая разнообразные по своему химическому составу природные соединения, преимущественно продуцируемые актиномицетами. К ним

относятся аминогликозидные антибиотики, группа тетрациклина, леномицетин, макролиды и др.

Аминогликозидные антибиотики

Стрептомицин является сложным органическим основанием, молекула которого состоит из трех частей: стрептидина, стрептозы и N-метилглюкозамина. М е х а н и з м а н т и б а к т е р и а л ь н о г о д е й с т

в и я стрептомицина заключается в способности блокировать субъединицу рибосомы 30S, а также нарушать считывание генетического кода. При этом кодоны иРНК неправильно считываются антикодонами

тРНК. Например, кодон УУУ, кодирующий фенилаланин, считывается как АУУ, в результате чего его место занимает изолейцин, что приводит к образованию ненужного для бактериальной клетки поли

пептида. Недостатком стрептомицина является быстрое возникновение к нему резистентных бактерий.

Группа тетрациклинов

М е х а н и з м а н т и б а к т е р и а л ь н о г о д е й с т в и я тетрациклинов разнообразен. Ингибирующий эффект обусловлен на рушением связывания аминоацил-mPHK с рибосомальноматричным

комплексом, что приводит к подавлению синтеза белка на рибосомах бактериальных клеток. Ингибирующее действие тетрациклинов в отношении риккетсий Провацека объясняется подавлением окисления

глутаминовой кислоты, которая у этих микроорганизмов является исходным продуктом в реакциях энергетического метаболизма.