1.7. Культура меристем для оздоровления (из истории).

В 1962 году Белкенгем и Миллер предложили устранение латентного А вируса земляники при помощи культуры меристем, и заметили, что успех размножения апикальных меристем был прямо пропорционален размеру экспланта, в то время как шансы получения безвирусного материала были очевидно обратно пропорциональны размеру посаженной (извлеченной) ткани.

Adams в 1972 году доложил о возможности получения большого количества ростков земляники из культуры меристем или кончиков побегов, культивируемых in vitro, а Nishi и Oosawa (1973) – из меристем каллюса.

В 1974 году Boxus установил, что быстрое размножение растений, свободных от вирусов, in vitro, может применяться в промышленности и описал технологию, которая дает возможность избегать мутаций. С тех пор интерес к микроклональному размножению земляники увеличился, и этот метод используют по всему миру.

Белкенгем и Миллер (1962) установили, что термотерапия позволяет получать безвирусный материал из меристем большего размера.

Как отмечается в нескольких работах, размер экспланта в сочетании с термотерапией является ключевым фактором в получении безвирусного материала. Продолжительность термотерапии влияет на устранение латентного С вируса из верхушек усов различной длины, но не оказывает влияния на вирус морщинистости.

Также термотерапия оказалась полезной для борьбы с вирусами при использовании мелких меристем. Свободные от вирусов растения были получены также и без использования термотерапии (но в этом случае размер экспланта должен быть менее 0,5 мм).

Из меристем размером 0,5 мм были получены растения земляники свободные от Phytophthora cactorum, также Меркле доложил об устранении Phytophthora fragariae из меристем.

В Италии для производства безвирусных меристем размером 0,5-0,7 мм их вырезают из побегов растений прошедших термотерапию.

Безвирусные растения могут сохраняться в защищенных условиях в течение нескольких лет.

Работы по микроклональному размножению земляники ведутся также и в России, Молдавии, Польше и других странах. Этот метод широко используется в странах Европы, постепенно замещая традиционный.

1.8. Факторы, влияющие на рост меристем.

1.8.1. Выбор растений-доноров.

Выбор растений-доноров и времени извлечения меристем являются важными факторами. Меристемы извлеченные после термотерапии растут быстрее и с большим процентом приживаемости, чем меристемы с растений не прошедших термотерапию. Не имеет значения, извлечена ли меристема из апикальной или латеральной почки, но предпочтительнее почка, взятая с уса, как более легко извлекаемые.

Экспланты берутся предпочтительно весной или летом, так как в течение осени и зимы результаты сильно искажаются бактериями и грибками (Мартинелли, 1992).

1.8.2. Питательные среды.

В основе размножения растений in vitro лежат законы биологии: тотипатентность клеток, апикальное доминирование, регенерация. Все эти понятия предусматривают создание специальных условий с целью получения целостного растения, либо восстановления недостающей части. Наиболее важным условием является питательная среда, на которой могут проявиться вышеуказанные явления в желательном направлении.

Состав любой питательной среды можно подразделить на неорганический, органический и природный комплексы. Неорганический комплекс делится на макро- и микро- элементы.

К макроэлементам в культуре ткани относят: азот, фосфор, калий, кальций, магний, натрий, железо; к микроэлементам – марганец, бор, цинк, йод, молибден, медь, кобальт.

Органический комплекс представлен: витаминами – тиамин, пиридоксин, никотиновая кислота, аскорбиновая кислота, мезоинозит, рибофлавин, патентенат кальция, фолиевая кислота, биотин; аминокислотами – гликокол, сульфат аденин, гидролезат казеина; регуляторами роста – ауксины (ИУК, ИМК, НУК,2,4-Д), вещества, обладающие ауксиновой активностью (мивал, крезацин), цитокинины (кинетин, 6-БАП, зеатин, 2-изопентил, карталин, дропп, тидизурон); гиббереллины (ГА-3, ГА-4…7); углеводами (сахароза, глюкоза, фруктоза, сорбит); ретардантами (ССС, АБК, РР 333), агаром (бакто-, дивко-агар, гельрайт); фенолами (флороглюцин, хлорогеновая кислота, кумарин).

Состав некоторых сред представлен 30 и более компонентами. Однако, точный состав питательной среды должен быть подобран в зависимости от потребностей разных сортов, а некоторые группы сортов требуют дополнительных добавок для обеспечения достаточно хорошего роста. Обычно питательную среду делают твердой, добавляя агар (0,7-1,0 % массы к объему).

Наибольшее распространение получила среда на основе минеральных солей по Мурасиге-Скугу, обогащенная витаминами, сахарозой и регуляторами роста. Хорошие результаты были получены при использовании сред Ли и де Фоссарда, а также Гамборга. pH используемой среды колеблется от 5,2 до 6; как правило, рН среды 5,6-5,8.

Свободные от вирусов растеньица могут быть получены из меристем выращенных без регуляторов роста, добавление растительных гормонов, и главным образом бензиладенина в количестве 0,1-1мг/л и ауксина, увеличивает количество меристем, которые дают новые растеньица (Martinelli, 1992).

На этапе укоренения практикуется использование менее богатых сред. Укоренение побегов увеличивается, если использовать половинную по макросолям среду МС, однако среда 3/4 МС дает растения лучшего качества (Деменко, 1997). В качестве индукторов ризогенеза хорошо зарекомендовали себя бетта-индолилмасляная, бетта-индолилуксусная, и альфа-нафтилуксусная кислоты. Введение этих препаратов в питательную среду для укоренения является технологическим приемом. Однако их присутствие положительно сказывается на первых этапах ризогенеза, а для развития корневой системы бесполезно или даже вредно. Поэтому при укоренение используют кратковременное замачивание базальных участков побегов в водных растворахпрепаратов с ауксиновой активностью (ИМК) с последующим помещением их на среды без регуляторов роста или обработку пудрой с ауксинами.

На этапе акклиматизации пробирочных растений наиболее эффективным оказалось использование пластиковых индивидуальных контейнеров, заполненных стерильным субстратом, обогащенным минеральными компонентами питания. Это позволяет довести приживаемость до 90-95 % (Высоцкий, 1989).

1.8.3. Условия освещения и температура.

Для микропобегов, культивируемых на среде, содержащей сахарозу, не нужен вовсе или нужен слабый фотосинтез, однако определенное освещение – необходимый фактор для морфогенеза и образования хлорофилла. В качестве источников света обычно используют люминесцентные лампы освещения 1000-5000 люкс. Существуют разные мнения касательно оптимальных условий освещения и температуры, однако по имеющимся данным, эти факторы имеют немаловажное значение.

Мурасиге (Мурасиге, 1977) обнаружил, что оптимум освещенности у большинства травянистых растений, в том числе и у земляники лежит в области 1000 люкс. Низкая освещенность, примерно 300 люкс, а также слишком высокая (около 3000-10000 люкс), сильно подавляют рост.

Некоторые исследователи полагают (Высоцкий,1989), что условия при 22-27 градусах, освещенности 3-5 тыс. люкс и световом дне продолжительностью 16 часов обеспечивают нормальное развитие эксплантов.

Температура камеры также влияет на результаты культивирования. Адамс (1972) использовал температуру 25 градусов, Боксус (1977) получил наилучшие результаты при 24 градусах, в то время как Муллин и др. (1974) культивировал при 27 градусах. С другой стороны, Ван Хоф (1974) получил лучшие результаты при 20 градусах.

Джонс (1987) доложил, что регенеранты сорта земляники Остара дали заметно больше усов при размножении с 16-ти часовым фотопериодом при 22 градусах, чем при 12-часовом фотопериоде при 18 градусах. Влияние светового и температурного режима на сорта нейтрального дня замечено не было.

Ничши и Оосава (1973) предлагали культивировать меристемы при 25 градусах, относительной влажности 75%, освещенности 3000 люкс при 12-ти часовом дне. Абраменко и др. (1984) предлагали 16-ти часовой фотопериод, освещенность 3000 люкс при 22-25 градусах.

Были попытки использовать свет разной интенсивности и различные температурные режимы и обнаружилось, что максимальный рост эксплантов происходит при 28 градусах и 4000 люкс, более лучший рост побегов при 6000 люкс и лучшее укоренение – при 7000 люкс. (Hunter et al. 1983).

Таким образом, имеющиеся данные очень разнообразны и варьируют в достаточно больших пределах. Но по-видимому, следует выделить как наиболее подходящие условия для роста и развития меристем температуру в пределах 20-25 градусов, освещенность 1000-2000 люкс и 16-ти часовой фотопериод.