Новый метод

Группа исследователей из лаборатории экспериментальной аэробиологии Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии «Вектор» (ГНЦ ВБ «Вектор») Роспотребнадзора под руководством ведущего научного сотрудника, кандидата технических наук Талгата Бакирова в своем проекте использует уникальный и довольно сложный характер поведения клеток в НПЭП, связанный с их индивидуальными физико-химическими характеристиками. Ученые положили его в основу разработки электрооптических систем детекции микроорганизмов, экспрессного мониторинга их морфометрических характеристик и физиологических параметров — фазы жизненного цикла, метаболического статуса и пр., основанных на оптической детекции эффектов поляризуемости клеток при действии на них зондирующего электрического поля. Основные результаты получены благодаря усилиям высококвалифицированных специалистов: В.М. Генералова, А.В. Пак, М.В. Кручининой, Б.Ф. Ведерникова, Ю.В. Марченко, А.А. Медведева, И.С. Андреевой, А.С. Сафатова, Ю.Н. Мистюрина, Г.А. Буряк, Е.П Сухенко.

На клетки в НПЭП действует сила , которая в простейшем варианте (для сферически симметричных однородных частиц) формирует дипольный момент

где m— диэлектрическая проницаемость среды (электролита); r — радиус частицы; — фактор Клаузиуса-Моссоти

,

где — комплексная диэлектрическая проницаемость электролита и биологической частицы (в комплексной диэлектрической проницаемости кроме диэлектрической проницаемости учитывается и проводимость :

Данное выражение строго указывает, что сила, действующая на клетку, зависит как от амплитудно-частотных и пространственных характеристик электрического поля, так и от физико-химических свойств самой клетки. Комплексная диэлектрическая проницаемость каждой конкретной клетки определяется самыми разнообразными характеристиками. Среди них, например, можно выделить соотношение тех или иных составных химических компонентов, объем, форму, особенности пространственного строения.

Диэлектрофоретическая сила уравновешивается силой вязкого трения, которую испытывает клетка со стороны набегающего потока вязкой среды. Для сферической клетки

,

где n — динамическая вязкость среды; r — эквивалентный радиус клетки; v — поступательная скорость клетки относительно потока.

Равенство диэлектрофоретической силы и силы вязкого тренияпозволяет найти величину поляризации клетки:

На основе величины поляризации клетки и зависимости растяжения клетки x за время t воздействия электрического поля до максимального амплитудного значения A, рассчитываются ее жесткость:

и вязкость:

Новый метод измерения жесткости и вязкости эритроцитов человека имеет самостоятельное значение и может использоваться для диагностики многих заболеваний сердца и печени.

Знание амплитудно-частотной зависимости поляризации клетки позволяет рассчитать электрическую емкость, проводимость мембраны и цитоплазмы.

Экспериментальная установка

Последние исследования сотрудников лаборатории экспериментальной аэробиологии ГНЦ ВБ «Вектор» показали, что присутствие в суспензии бактериальных агентов можно идентифицировать с помощью разработанного ими алгоритма одновременного измерения нескольких характеристик клеток (морфометрических параметров, подвижности клеток в неоднородном переменном электрическом поле, поляризуемости на различных частотах электрического поля, электропроводности цитоплазмы и мембраны, электрической емкости мембраны, амплитуды деформации, жесткости и вязкости клеток, степени агломерации, индекса деструкции в электрическом поле, цвета клеток).

Рис. 3. Функциональная схема макета прибора для электрооптической детекции клеток микроорганизмов, экспрессного мониторинга их морфометрических характеристик и физиологических параметров

Специалистами из ГНЦ ВБ «Вектор» собрана экспериментальная установка для одновременной регистрации перечисленных выше характеристик клеток с помощью компьютерной программы распознавания изменений формы, положения и цвета клеток в процессе взаимодействия с неоднородным переменным электрическим полем на различных частотах. Составляющие прибора — пробоотборник микроорганизмов из воздуха и комплекс измерительной аппаратуры: микроскоп с видеокамерой, измерительная ячейка и компьютер. Функциональная схема макета прибора представлена на рис. 3, а фотография — на рис. 4. Установка проста, универсальна и не требует большого числа химических веществ и биологических маркеров.

Рис. 4. Фотография макета прибора

. Доработанная функциональная схема электрооптической системы детекции клеток.

1 - микроскоп, 2 – устройство для подачи и удаления измерительных ячеек, 3 – видеокамера, 4 – генератор, 6 – компьютер, 7 – пакет программ для анализа изображения и измерения физических параметров клеток, 8 – изолирующий бокс.

Измерительная ячейка состоит из предметного стекла, на поверхность которого методом напыления нанесены хромовые электроды (рис. 5). Расстояние между электродами 50·10^-6 м, высота напыления 0,2·10^-6 м. Между электродами расположена измерительная камера. Измерительная ячейка устанавливается на подвижный стол микроскопа, с помощью которого осуществляется наблюдение за микроорганизмами. Электроды измерительной ячейки подключают к генератору напряжения. Характеристики переменного напряжения контролируются осциллографом. От генератора на измерительную ячейку подается гармоническое напряжение в частотном диапазоне 104–107 Гц. В компьютере установлена оригинальная программа распознавания образов клеток и расчета коэффициентов поляризации клеток и всех вышеуказанных характеристик. Она позволяет на основе видеозаписи динамики движения клеток в НПЭП подсчитать их количество, координаты, скорость движения — v, радиус клетки — r, площадь, рассчитать для каждой клетки коэффициент поляризации, построить гистограммы распределения поляризации клеток, степени агрегации клеток, индекса деструкции в электрическом поле, цвета клеток и т.д. В состав программы будет входить подпрограмма расчета градиента напряженности электрического поля —в каждой точке пространства между электродами измерительной ячейки.

Конструкция измерительной ячейки

1 – стеклянная пластина. 2 – электроды, 3 – измерительная камера между электродами, 4 – покровное стекло.

Разработка ячейки для электрофореза и диэлектрофореза клеток (рис. 6) осуществлялась НТУ «Инженерно-технический центр», дочерней структурой предприятия Роскосмоса «ОАО Ижевский мотозавод Аксион-холдинг». Проект по объединенному методу клеточного анализа уже подан на совместный патент под названием «Способ комплексного анализа параметров живых клеток, устройство для его осуществления и его вариант».