Среда Кинга а для образования пиоцианина: бактопептон – 2 %, глицерин – 1 %, k2so4 (безв.) – 1 %, MgCl2 –0,14 %, агар – 1,5 %, вода дистиллированная, рН 7,2.

Среда Кинга В для образования флюоресцеина: пептон – 2 %, глицерин – 1 %, K₂HPO₄ (безв.)– 0,15 %, MgSO₄ – 0,15 %, агар – 1,5 %, вода дистиллированная, рН 7,2.

Среда для флюоресцирующего пигмента: полноценный агар с 2-

7 % глицерина, который вносится до стерилизации. Пигмент выявляется при просмотре в проходящем ультрафиолетовом свете.

Среда для образования синего внеклеточного пигмента (индигоидина) (г/л): соевый триптический перевар – 40 г, дрожжевой экстракт – 1 г, глюкоза – 5 г, глицерин – 20 г, агар – 5 г, вода – 1 л, рН 7,3.

Среда для образования оранжевого пигмента: соевая мука – 15 г, пептон – 5 г, глюкоза – 15 г,Nacl– 5 г.,CаСО₃ – 1 г, глицерин – 2,5 мл, агар – 20 г, вода водопроводная – 1 л, рН 7,0.

Среды для образования желтооранжевых водонерастворимых пигментов:

Среда Нахимовской ( % ):сахароза или маннит – 2,0, К₂РО₄– 0,02,MgSO₄– 0,02,NaCl– 0,02,K₂SO₄– 0,01,CaCO₃–0,5, агар – 2, пептон ферментативный – 0,2, вода дистиллированая, рН – 7,2.

Среда Петренко ( % ): пептон ферментативный – 2,0, глицерин – 2,0,K₂SO₄– 2,0,MgCl₂– 0,7, агар – 2,0, вода дистиллированная, рН – 7,0.

5. Выделение отдельных групп бактерий

Выделение культур актиномицетов

Источником для выделения актиномицетов является почва. Почвенную суспензию увлажняют, растирают (как описано ранее), и готовят взвесь в стерильной воде. Высев производят на среду следующего состава (г/л): крахмал растворимый - 20, КNО₃ - 1 К₂НРО₄ - 0,5, MgSO₄ x 7Н ₂O - 0,5, NaCl - 0,5, FeSO₄ - следы, вода водопроводная, рН 7,2-7,3.

После появления колоний отбирают 2-3 изолированные, рассевают и инкубируют при 28 ^о С. Микроскопируют и описывают отдельные клетки и сформировавшиеся колонии.

Выделение бактерий рода Bdellovibrio

Источником для выделения служит почва. 10 г почвенного образца смешивают с 10 мл воды (водопроводной) и встряхивают в течение I часа. После того, как взвесь отстоялась, ее центрифугируют для удаления крупных частиц и последовательно фильтруют через мембранные фильтры с диаметром пор до 0,45 мкм. 0,5 мл профильтрованной суспензии вносят в пробирку с 3 мл полноценного агара (0,7%). В пробирку вносят культуру бактерий хозяев (Pseudomonas, Erwinia, Escherichia и др.) и выливают на поверхность чашки Петри с 1,5% агаром. После инкубирования в течение 18 часов, отмечают появление негативных колоний. Если колоний не возникает, то инкубирование продолжают еще сутки. Возникающие после инкубирования в течение 2 суток колонии рассматривают как бделловибрионы. Пассируют (т.е. вырезают кусочки агара и ресуспендируют в стерильной воде), а затем наслаивают на газон бактерий-хозяев не менее 3 раз.

Получение культур мезофильных спорооборазующих бактерий

Готовят пробы из образцов почвы как описано ранее. Затем 0,1 мл исследуемого образца добавляют к 9 мл полноценной среды, подогревают 15 мин при 70°С, инкубируют в течение ночи. Затем выросшие культуры высевают на полноценную агаризованную среду. Для выделения культур Clostridium используют среду следующего состава (г/л): КН₂РО₄ - 0,5, К₂НРО₄ - 0,5, MgS0₄ - 0,5, NaCl – 0,5, вода водопроводная, глюкоза - 20, пептон - 5, CaCO₃ - 10, рН 7,0.

Выделение анаэробных микроорганизмов рода Clostridium

Для выделения анаэробов используют образцы почвы, приготовленные как описано ранее. Посев осуществляется в среду, содержащую (г/л): КН₂РО₄ - 0,5, К₂НРО₄ - 0,5, MgS0₄ - 0,5, NaCl – 0,5, вода водопроводная, глюкоза - 20, пептон - 5, CaCO₃ - 10, рН 7,0.

При выращивании в высоком слое среды, ее наливают не менее чем на 2/3 в пробирки, стерилизуют, остужают и делают засев образца. На поверхность наносят слой вазелинового масла. Инкубируют при 37° С. В качестве восстановителя используют 0,05 % тиогликолевую кислоту или цистеин НС1 (0,025 %).

Вышеуказанная среда может быть уплотнена внесением 0,2% агара, проавтоклавирована в пробирках и охлаждена до 45^о С. На дно первой пробирки вносят 0,1 мл образца, перемешивают и 0,1 мл переносят на дно следующей пробирки и т.д. Пробирки быстро охлаждают в холодной воде. Рост Clostridium обусловливает золотисто-желтую флуоресценцию.

Выделение микроорганизмов, растворяющих фосфаты кальция

Указанные микроорганизмы выделяют из почвенной суспензии путем высева 10^-4 –10^-6 разведений на агаризованную среду следующего состава (г/л): глюкоза - 10, аспарагин - I, К₂SО₄ - 0,2, МgSО₄ x 7H₂O -0,2 дрожжевой экстракт - 0,02, агар - 15., вода водопроводная, стерилизуют 15 мин при 0,5 атм.

Фосфат кальция вносят методом осаждения следующим образом: в стерильную расплавленную среду (на 100 мл) вносят 0,33 г СаС1₂ х 6Н₂0, после его растворения добавляют 0,38 г Nа₃РО₄ x 12Н₂О. Образуется примерно 0,15 г Сa₃(PO₄)₂. Инкубируют 2-7 суток при 28-30°С.

Выделение культур микобактерий

Для получения накопительной культуры готовят среду следующего состава (г/л): NН₄С1 - 0,5, К₂НРО₄ - 0,5, МgSO₄ - 0,2, СаСО₃ - 0,2, вода водопроводная. Стерилизуют 20 мин при 0,5 атм, разливают в конические колбы слоем по 1,5-2 см. В среду стерильной пипеткой вносят по каплям парафин. Среду заражают небольшим количеством почвы. Инкубируют 2 недели при 28-30^о С. Вокруг капель парафина образуются скопления микобактерий. Диск парафина переносят на предметное стекло, петлей снимают часть клеток и пересевают. Исследуют кислотоустойчивость клеток.

Выделение азотфиксирующих микроорганизмов

Для выделения азотфиксирующих микроорганизмов используют жидкую безазотистую среду Эшби, которой засевают в колбах на 250 мл примерно 2-3 г парниковой почвы. Колбы помещают в термостат на 28-30°С. Через 5-7 суток инкубирования на поверхности среды образуется пленка, что может свидетельствовать о накоплении азотобактера. В случае вспенивания предполагают наличие Clostridium и исследуют образование масляной кислоты. 5 мл жидкости из колбы переносят в пробирку и добавляют 10% раствор FeCl₃ (2 мл), нагревают до кипения. Раствор маслянокислого железа, который образуется, имеет кроваво-красный цвет. Кроме того, готовят мазки и окрашивают их (с поверхности пленки и из нижних слоев),

Выделение культур лактобацилл

Для выделения культур лактобацилл из сыров делают штрихом посев из разведений на среду следующего состава (г/л): гидролизат казеина - 10, мясной экстракт - 10, дрожжевой экстракт - 5, глюкоза - 20, ацетат натрия - 5, цитрат аммония - 2, К₂НРО₄ - 2, МgSO₄ -0,2, MnCl₂ x 4H₂O -0,05, вода дистиллированная.

Для выделения гомоферментативных молочнокислых бактерий используют стерильное обезжиренное молоко 10 %. Для выделения гетероферментативных молочнокислых бактерий используют молоко с добавлением лимоннокислого натрия (1 %) или дрожжевого автолизата (2 %) и глюкозы (1 %).Температуру инкубирования выбирают в зависимости от вида бактерий которые нужно выделить: 30^о С для - мезофильных, 45^о С – для термофильных культур и 25^о С – для выделения Lactococcus lactis subsp.cremoris. Изолированные колонии лактококков получают на агаризованной среде при глубинном засеве из ряда разведений.

Приложение

Таблица 1